申請日2015.11.02
公開(公告)日2016.01.20
IPC分類號G01N30/88
摘要
本發(fā)明公開了一種三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，屬于農(nóng)藥工業(yè)廢水手性單體的毒物鑒別領(lǐng)域。其步驟包括：廢水中三唑類殺菌劑的富集濃縮，分離與定性識別，手性單體的分離，致毒手性單體的識別。本發(fā)明從農(nóng)藥工業(yè)廢水中分離并識別三唑類殺菌劑，并且鑒別出廢水中致毒的三唑類殺菌劑手性單體，有利于有針對性的指導(dǎo)合成工藝與水處理設(shè)施，削減農(nóng)藥工業(yè)廢水的毒性與潛在風(fēng)險，從而降低農(nóng)藥生產(chǎn)對環(huán)境和人類健康的影響。
權(quán)利要求書
1.一種三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，其特征在于，它包括如下步驟：
(1)廢水中三唑類殺菌劑的富集濃縮：利用固相萃取柱對水樣中的三唑類殺菌劑進行富集，利用有機溶劑洗脫固相萃取柱，獲得不同極性的三唑類殺菌劑，將洗脫液旋蒸、氮吹濃縮、定容、保存;
(2)廢水中三唑類殺菌劑的定性識別與分離制備：利用液質(zhì)聯(lián)用對步驟(1)得到的廢水濃縮液中的三唑類殺菌劑進行定性識別，確定具體的三唑類殺菌劑成分，再利用制備色譜對具體的三唑類殺菌劑成分分別進行分離純化，濃縮得到純品;
(3)三唑類殺菌劑手性單體的分離：基于手性色譜柱利用超臨界流體色譜對步驟(2) 得到的具體的三唑類殺菌劑成分進行手性分離，濃縮得到手性單體;
(4)致毒手性單體的識別：利用大型溞毒性測試平臺將步驟(3)得到的手性單體暴露于大型溞，通過24～48小時觀察受抑制的大型溞數(shù)來計算半數(shù)抑制濃度EC50值;利用盆栽噴霧法將瓜類炭疽病菌和番茄灰霉病菌接種到黃瓜葉片上，通過觀察葉片上的病斑數(shù)來計算半數(shù)抑制濃度IC50值，建立毒性-活性比數(shù)據(jù)庫，篩選毒性貢獻最高，活性貢獻最低的單體，以識別致毒手性單體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的固相萃取柱為WatersOasisHLB或C18固相萃取小柱;固相萃取柱在使用之前，依次用正己烷、二氯甲烷、甲醇和去離子水活化，流速控制在1～4 滴/秒，萃取結(jié)束后，離心除去萃取柱中的水分并將其放在干燥器中備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的有機溶劑為正己烷、二氯甲烷和甲醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的定性識別為采用液質(zhì)聯(lián)用定性檢測，具體參數(shù)如下：高效液相色譜儀HPLC：Agilent1260;色譜柱：WatersXBridgeBEHC18XP分析柱 (2.1mm×50mm,2.5μm);柱溫：40℃;流動相：A：水，B：甲醇;流速：0.2-0.6mL/min;質(zhì)譜儀：API4000-ABSCIEX;離子源：電噴霧離子化ESI;電離模式：正離子模式;采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式;多反應(yīng)監(jiān)測模式的離子對：戊菌唑為284>159,284>70;腈菌唑為289>125,289>70;烯效唑為292>125,292>70;多效唑為294>125,294>70;硅氟唑為294>135,294>70;氧環(huán)唑為300>231,300>159;氟硅唑為316>247,316>165;滅菌唑為318>125,318>70;葉菌唑為320>125,320>70;氟環(huán)唑為330>121,330>101;種菌唑為334>125,334>70;腈苯唑為337>125,337>70;丙環(huán)唑為342>159,342>69;丙硫菌唑為344>326,344>125;氟菌唑為346>278,346>73;氟醚唑為372>159,372>70;戊唑醇為308>125,308>70;粉唑醇為302>123,302>70;己唑醇為314>159,314>70。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，其特征在于，步驟(2)中，制備色譜的分離參數(shù)如下：WatersAutoPurificationHPLCSystem;色譜柱：WatersXBridgeC18制備柱(19mm×150mm,5μm);柱溫：35℃;流動相：A：水，B：甲醇;流速：3-7mL/min;以多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描出的三唑類殺菌劑作為目標物質(zhì)，設(shè)置離子對進行見峰收集。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的濃縮，方式為在體積百分比5%-20%甘油水溶液保護的條件下，利用氮吹將組分中的甲醇去除，以保證易揮發(fā)物質(zhì)的回收率，剩下的水溶液利用二氯甲烷液液萃取3次，萃取液經(jīng)旋蒸、氮吹濃縮。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的超臨界流體色譜，參數(shù)如下：超臨界流體色譜制備系統(tǒng)： WatersSFC80，紫外檢測器(Gilson151);色譜柱：手性制備柱(25mm×250mm, 10μm);流動相：A：食品級二氧化碳，B：甲醇;流速：45-50g/min;檢測波長：220nm;柱溫：40℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，其特征在于，步驟(4)中，按公式(1)計算毒性-活性比，毒性-活性比最大的單體即為最主要的致毒手性單體。
說明書
三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥工業(yè)廢水中致毒手性單體的識別方法，具體地說是農(nóng)藥工業(yè)廢水中三唑類殺菌劑手性單體的制備方法與致毒單體的識別方法。
背景技術(shù)
農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用，中國作為農(nóng)業(yè)大國，也是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，2014年我國農(nóng)藥累計生產(chǎn)量為374.4萬噸。農(nóng)藥生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了大量的農(nóng)藥工業(yè)廢水，廢水通常具有成分復(fù)雜、毒性大、難生物降解、色度高、 COD高等特點。已有研究表明農(nóng)藥工業(yè)廢水具有生態(tài)毒性和遺傳毒性，對水生生態(tài)安全和人類的健康構(gòu)成威脅。目前生產(chǎn)的農(nóng)藥中手性農(nóng)藥的比例占到了40%左右，手性農(nóng)藥通常含有1或2個手性中心。已有研究表明不同手性單體的毒性及生物活性具有顯著差異，廢水處理工藝的處理效果也有明顯區(qū)別。我國的農(nóng)藥生產(chǎn)以外消旋體形式存在，缺少手性分離步驟。因此建立快速穩(wěn)定的技術(shù)識別農(nóng)藥工業(yè)廢水的致毒手性單體具有重大意義，有利于有針對性的去除廢水中的高風(fēng)險污染物，削減廢水的毒性及指導(dǎo)農(nóng)藥生產(chǎn)工藝的改進，從而降低農(nóng)藥對環(huán)境和人類健康的影響。
通過檢索發(fā)現(xiàn)目前國內(nèi)外文獻還沒有基于液相色譜-質(zhì)譜定性分析、制備色譜分離與毒性測試識別農(nóng)藥工業(yè)廢水的致毒三唑類殺菌劑手性單體的報道。
發(fā)明內(nèi)容
目前農(nóng)藥生產(chǎn)廢水量大，環(huán)境風(fēng)險高，然而農(nóng)藥殘留主要以外消旋體形式存在，廢水中不同手性單體藥效不同，毒性差異較大，廢水處理不具有針對性，對致毒單體的去除率較低，需要建立具有針對性的毒性單體鑒別方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，基于制備色譜純化技術(shù)分離農(nóng)藥工業(yè)廢水中致毒的三唑類殺菌劑，建立手性單體的制備及其大型溞毒性和抗菌活性的評估方法來識別農(nóng)藥工業(yè)廢水中主要的致毒手性單體，為農(nóng)藥生產(chǎn)工藝及廢水處理工藝改進提供指導(dǎo)意見。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種三唑類殺菌劑廢水中致毒手性單體的識別方法，它包括如下步驟：
(1)廢水中三唑類殺菌劑的富集濃縮：利用固相萃取柱對水樣中的三唑類殺菌劑進行富集，利用有機溶劑洗脫固相萃取柱，獲得不同極性的三唑類殺菌劑，將洗脫液旋蒸、氮吹濃縮、定容、保存;
(2)廢水中三唑類殺菌劑的定性識別與分離制備：利用液質(zhì)聯(lián)用對步驟(1)得到的廢水濃縮液中的三唑類殺菌劑進行定性識別，確定具體的三唑類殺菌劑成分，再利用制備色譜對具體的三唑類殺菌劑成分(包括戊唑醇、己唑醇、粉唑醇和丙環(huán)唑等)分別進行分離純化，濃縮得到純品;
(3)三唑類殺菌劑手性單體的分離：基于手性色譜柱利用超臨界流體色譜對步驟(2) 得到的具體的三唑類殺菌劑成分進行手性分離，濃縮得到手性單體;
(4)致毒手性單體的識別：利用大型溞毒性測試平臺將步驟(3)得到的手性單體暴露于大型溞，通過24～48小時觀察受抑制的大型溞數(shù)來計算半數(shù)抑制濃度EC50值;利用盆栽噴霧法將瓜類炭疽病菌和番茄灰霉病菌接種到黃瓜葉片上，通過觀察葉片上的病斑數(shù)來計算半數(shù)抑制濃度IC50值，建立毒性-活性比數(shù)據(jù)庫，篩選毒性貢獻最高，活性貢獻最低的單體，以識別致毒手性單體。
步驟(1)中，所述的固相萃取柱為WatersOasisHLB或C18固相萃取小柱;固相萃取柱在使用之前，依次用正己烷、二氯甲烷、甲醇和去離子水活化，流速控制在1～4 滴/秒，萃取結(jié)束后，離心除去萃取柱中的水分并將其放在干燥器中備用。其中，所述的離心優(yōu)選5000r/min條件下離心5min。
步驟(1)中，所述的有機溶劑為正己烷、二氯甲烷和甲醇的組合。上述有機溶劑優(yōu)選的體積用量各為5～10mL。
步驟(1)中，所述的旋蒸，溫度控制在30-35℃，旋蒸濃縮至1mL以下。
步驟(2)中，所述的定性識別為采用液質(zhì)聯(lián)用定性檢測，具體參數(shù)如下：
高效液相色譜儀HPLC：Agilent1260;
質(zhì)譜儀：API4000-ABSCIEX;
色譜柱：WatersXBridgeBEHC18XP分析柱(2.1mm×50mm,2.5μm);柱溫：40℃;流動相：A：水，B：甲醇;流速：0.2-0.6mL/min;進樣體積為5μL;
流動相梯度見表1。
質(zhì)譜條件見表2。
利用多反應(yīng)監(jiān)測模式對三唑類殺菌劑定性分析的參數(shù)見表3。
表1
時間/min 水體積百分含量/%甲醇體積百分含量/% 0.0 90 10 0.5 90 10 2.0 30 70 4.0 20 80 8.0 10 90 8.5 90 10 12.0 90 10
表2
參數(shù)名稱參數(shù)數(shù)值質(zhì)譜儀 API 4000 碰撞氣Collision Gas(CAD) 7 離子源電噴霧離子化ESI 氣簾氣Curtain Gas(CUR) 35 電離模式正離子模式霧化氣Ion Source Gas1(Gas1) 45 霧化氣氮氣加熱氣Ion Source Gas2(Gas2) 50 碰撞氣氬氣離子噴霧電壓Ion Spray Voltage 4000 采集方式多反應(yīng)監(jiān)測MRM 溫度Temperature(TEM) 600
表3
步驟(2)中，制備色譜的分離參數(shù)如下：
制備色譜儀：WatersAutoPurificationHPLCSystem;
色譜柱：WatersXBridgeC18制備柱(19mm×150mm,5μm);柱溫：35℃;
流動相：A：水，B：甲醇;流速：3-7mL/min;進樣體積為500μL;
紫外吸收波長：220nm;
流動相梯度見表4。
基于建立的化合物正辛醇-水分配系數(shù)LogKow與保留時間tR的線性關(guān)系式 (LogKow=0.11501tR-0.21618)計算出三唑類殺菌劑出峰時間估算值，進而利用估算值加減0.4作為殺菌劑的預(yù)計出峰時間范圍。典型三唑類殺菌劑的預(yù)計出峰時間范圍如表5 所示。
表4
時間/min 水體積百分含量/%甲醇體積百分含量/% 0.0 50 50 50 0 100 80 0 100
表5
步驟(2)中，所述的濃縮，方式為在體積百分含量5%-20%甘油水溶液保護的條件下，利用氮吹將組分中的甲醇去除，以保證易揮發(fā)物質(zhì)的回收率，剩下的水溶液利用二氯甲烷液液萃取3次，萃取液經(jīng)旋蒸、氮吹濃縮。
步驟(3)中，所述的超臨界流體色譜，參數(shù)如下：
超臨界流體色譜制備系統(tǒng)：WatersSFC80，紫外檢測器(Gilson151);
色譜柱：手性制備柱(25mm×250mm,10μm);柱溫：40℃;
流動相：A：食品級二氧化碳，B：甲醇;流速：45-50g/min;
紫外吸收波長：220nm;
流動相梯度見表6。
表6
A、B相百分含量總和為100%。
步驟(4)中，手性單體的大型溞毒性：將手性單體吹干替換成二甲基亞砜，隨后將50μL替換成二甲基亞砜的手性單體加入到9.95mL水中，配成稀釋倍數(shù)為2的不同梯度試驗液，接著往10mL試驗液中加入5只24h/48h以內(nèi)剛產(chǎn)的幼溞，設(shè)置4個平行，將其放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h/48h，觀察記錄每個試驗液中活動受抑制的大型溞數(shù)目。計算半抑制濃度(EC50-Daphnia)，以表征三唑類殺菌劑手性單體對大型溞的急性毒性效應(yīng)。手性單體的抗菌活性：參照<<國家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心生物篩選SOP>>采用盆栽噴霧法測定手性單體對瓜類炭疽病菌和番茄灰霉病菌的生物活性。將手性單體樣品加入少量N,N-二甲基甲酰胺進行溶解，之后用0.1%的吐溫80表面活性劑水配制成稀釋倍數(shù)為 2的不同梯度試驗液，接著在黃瓜苗上均勻噴灑試驗液，24小時后各自人工接種瓜類炭疽病菌和番茄灰霉病菌，接種后立即移至恒溫室保濕箱中保濕誘發(fā)，5天左右待空白病斑穩(wěn)定后記錄各試驗液的病斑數(shù)。計算半抑制濃度(IC50-Fungus)，以表征三唑類殺菌劑手性單體的抗菌活性。
通過三唑類殺菌劑手性單體的抗菌活性IC50-Fungus的倒數(shù)獲得抗菌活性單元，三唑類殺菌劑手性單體的大型溞毒性EC50-Daphnia的倒數(shù)獲得大型溞毒性單元，基于抗菌活性單元和大型溞毒性單元按公式(1)計算毒性-活性比。毒性-活性比最大的單體即為最主要的致毒手性單體來源。
有益效果：本發(fā)明方法提供了一種農(nóng)藥工業(yè)廢水中致毒三唑類殺菌劑手性單體的識別方法，本發(fā)明從農(nóng)藥工業(yè)廢水中制備純化得到三唑類殺菌劑，并且鑒別出廢水中主要的致毒手性單體，有利于削減農(nóng)藥工業(yè)廢水的毒物及提高致毒手性單體的去除率，并且能夠指導(dǎo)農(nóng)藥生產(chǎn)工藝的改進，從而降低農(nóng)藥對環(huán)境和人類健康的影響。
