申請日2013.10.15

　　公開(公告)日2014.02.05

　　IPC分類號C12Q1/68; C12R1/01; G01N21/64

　　摘要

　　一種污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，屬于污水生物處理技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明可以對污水處理廠中兩個屬的亞硝酸鹽氧化菌，即硝化菌屬和硝化螺菌屬進(jìn)行檢測，不僅可以分析總的亞硝酸鹽氧化菌，而且可以分析各個屬的動態(tài)變化。采用通用性好、成本較低的SYBR Green熒光染料法建立了亞硝酸鹽氧化菌2個屬的實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。2條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.997，擴(kuò)增效率在100%到110%之間。利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對某污水處理系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行監(jiān)控和鑒定。本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)、簡便、可靠的污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法。

　　權(quán)利要求書

　　1.一種污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：污水 生物處理系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌包括硝化菌屬和硝化螺菌屬，分別定量檢測這兩個屬的 微生物數(shù)量，二者數(shù)量之和是亞硝酸鹽氧化菌的總量;提取實(shí)際生活污水處理系統(tǒng)中活性 污泥微生物的基因組DNA;采用硝化菌屬和硝化螺菌屬16S rDNA引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò) 增;將兩個屬的純化回收的DNA擴(kuò)增片段與載體連接，連接好的載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞培 養(yǎng)15-18h，挑取白斑進(jìn)行重組菌落PCR驗(yàn)證;提取包含目的片段的質(zhì)粒用作實(shí)時熒光定 量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，在實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;利用建立的標(biāo)準(zhǔn) 曲線對污水處理廠中亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行定量檢測;

　　上述常規(guī)PCR擴(kuò)增體系如下：

　　上述實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

　　當(dāng)檢測硝化菌屬時采用硝化菌屬的正向引物為TGCGACCGGTCATGG，反向引物為 GGGCGGWGTGTACAAGGC;當(dāng)檢測硝化螺菌屬時采用硝化螺菌屬的正向引物為 CCTGCTTTCAGTTGCTACCG，反向引物為GTTTGCAGCGCTTTGTACCG;

　　上述硝化菌屬常規(guī)PCR和實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增程序如下：95℃處理10min;35個 循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)包括95℃1min，62℃1min，72℃2min;硝化螺菌屬常規(guī)PCR和實(shí) 時熒光定量PCR擴(kuò)增程序如下：95℃處理10min;35個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)包括95℃1min， 60℃1min，72℃2min。

　　說明書

　　污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌熒光定量PCR檢測方法

　　技術(shù)領(lǐng)域

　　本發(fā)明涉及一種污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法， 屬于污水生物處理技術(shù)領(lǐng)域，用于對污水生物處理系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌的定量 檢測。

　　背景技術(shù)

　　污水生物脫氮技術(shù)由于經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于污水處理領(lǐng)域。 傳統(tǒng)污水生物脫氮的原理是指氨氮被氨氧化菌氧化成亞硝態(tài)氮(亞硝化階 段)，再由亞硝酸鹽氧化菌氧化成硝態(tài)氮(硝化過程);之后硝態(tài)氮和亞硝態(tài) 氮被反硝化成氮?dú)?反硝化過程)，從而實(shí)現(xiàn)污水中氮的去除。對于傳統(tǒng)生 物脫氮技術(shù)而言，亞硝酸鹽氧化菌作為硝化過程的主要功能微生物之一，在 污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)的生物活性和菌群分布的穩(wěn)定性，是保證污水生物脫氮 系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵因素。污水生物處理系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌包括硝化 菌屬和硝化螺菌屬，有的污水處理系統(tǒng)中只含有其中的一個屬，而有的污水 處理系統(tǒng)中含有兩個屬。為了全面了解系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌的分布情 況，需要分別定量檢測這兩個屬的微生物數(shù)量，二者數(shù)量之和是亞硝酸鹽氧 化菌的總量。近年來，在傳統(tǒng)生物脫氮理論的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了短程脫氮新理論， 即將硝化過程控制在亞硝態(tài)氮，然后直接進(jìn)入反硝化，從而使生化反應(yīng)大大 縮短，被稱之為短程硝化反硝化。相比于傳統(tǒng)方法，短程脫氮理論上減少25% 硝化需氧量、40%反硝化碳源，更具實(shí)用價值。實(shí)現(xiàn)短程脫氮的關(guān)鍵是將硝 化產(chǎn)物控制為亞硝酸鹽，即去除亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽的過程。從微生物學(xué) 的觀點(diǎn)來看，就是抑制或淘汰亞硝酸鹽氧化菌。對于短程脫氮技術(shù)而言，準(zhǔn) 確監(jiān)測并定量亞硝酸鹽氧化菌的動態(tài)變化是實(shí)現(xiàn)短程脫氮并保證其穩(wěn)定運(yùn) 行的關(guān)鍵。分子生物技術(shù)的快速發(fā)展為污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)微生物研究提供 了新的分析方法和手段。因此，采用分子生物技術(shù)對不同工藝、水質(zhì)條件下 的亞硝酸鹽氧化菌菌群結(jié)構(gòu)、活性等進(jìn)行研究分析，能夠?yàn)槲鬯�生物脫氮�?統(tǒng)的長期穩(wěn)定運(yùn)行提供有力保障。

　　實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)作為一種核酸定量的手段，以其高靈敏性、高特 異性、高精確度、實(shí)時性、污染少等優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于污水生物處理系統(tǒng)中 特定菌群的定量分析。已有的實(shí)時定量PCR技術(shù)應(yīng)用于污水短程生物脫氮的 研究，主要是對氨氧化菌的定量。但實(shí)現(xiàn)短程脫氮的關(guān)鍵在于亞硝酸鹽氧化 菌是否被抑制或淘汰。對于亞硝酸鹽氧化菌，往往通過亞硝酸鹽積累率達(dá)到 較高的水平(>80%)逆推出亞硝酸鹽氧化菌被成功淘洗的結(jié)論。這種逆推顯 然不夠嚴(yán)謹(jǐn)，因?yàn)樗鼰o法揭示亞硝酸鹽氧化菌是活性受到抑制還是已被徹底 淘洗出系統(tǒng)，這兩種情況將會產(chǎn)生兩種不同的運(yùn)行效果。如果是亞硝酸鹽氧 化菌的活性受到抑制，當(dāng)環(huán)境條件的變化有利于生長時亞硝酸鹽氧化菌將恢 復(fù)活性，導(dǎo)致短程脫氮運(yùn)行不穩(wěn)定甚至完全破壞。如果是亞硝酸鹽氧化菌已 被徹底淘洗出系統(tǒng)，則更加有助于短程脫氮的穩(wěn)定運(yùn)行，短期的環(huán)境條件的 變化不會對短程脫氮產(chǎn)生影響。由于缺少對污水處理系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌 的檢測，對于不同運(yùn)行條件下系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌的群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變 化不清楚，進(jìn)而無法準(zhǔn)確闡述短程脫氮的形成機(jī)制。

　　本發(fā)明采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對污水處理廠中的亞硝酸鹽氧化菌 進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明在技術(shù)上不同于現(xiàn)有技術(shù)，主要體現(xiàn)在以下三方面：

　　(1)標(biāo)準(zhǔn)品DNA的來源。現(xiàn)有技術(shù)主要是從純培養(yǎng)或人工配水富集的 目標(biāo)菌中提取基因組DNA，或是化學(xué)合成DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品。目標(biāo)菌的 純培養(yǎng)需要較長的時間、費(fèi)用較高。更難以解決的是亞硝酸鹽氧化菌中的硝 化螺菌屬目前還無法實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)。人工配水富集的目標(biāo)菌的菌群單一，無法 獲得實(shí)際污水處理系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌的所有優(yōu)勢屬的標(biāo)準(zhǔn)品。化學(xué)合成 DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品首先要通過基因測序知道目標(biāo)基因序列，否則無法合 成。而本發(fā)明采用的標(biāo)準(zhǔn)品全部來源于處理實(shí)際生活污水的反應(yīng)器，無需目 標(biāo)菌的純培養(yǎng)、人工配水富集目標(biāo)菌和目標(biāo)基因序列。

　　(2)定量檢測的環(huán)境樣品及目標(biāo)微生物。①目前，實(shí)時熒光定量PCR 主要應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)Σ《�、致病菌的檢測分析。而本發(fā)明的 待測樣品為污水處理系統(tǒng)中的活性污泥，樣品本身具有極強(qiáng)的特殊性。由于 活性污泥受廢水污染，其中含有大量未知的有機(jī)、無機(jī)污染物、顆粒物、雜 質(zhì)等，還有其它與亞硝酸鹽氧化菌共存于活性污泥中的菌膠團(tuán)，對DNA的 提取純化干擾較大，并進(jìn)而影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增。因此，活性污泥微生物基 因組DNA的提取方法、PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件需要特殊確定，難度較大。 ②本發(fā)明定量檢測的目標(biāo)微生物是亞硝酸鹽氧化菌，已有研究證實(shí)污水生物 處理系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌包括兩個屬，即硝化菌屬和硝化螺菌屬。由于 本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品來自于實(shí)際污水處理系統(tǒng)，運(yùn)行條件和廢水成分的復(fù)雜性使 得亞硝酸鹽氧化菌菌群豐富，獲得兩個主要屬的標(biāo)準(zhǔn)品，因此能夠?qū)ξ鬯��?理廠中亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行全面的定量分析。

　　(3)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。采用實(shí)時熒光定量PCR方法對環(huán)境樣品的特定菌 群密度進(jìn)行定量過程中，樣品預(yù)處理方法和參數(shù)的選擇對于測定結(jié)果有較大 的影響。將實(shí)時熒光定量PCR應(yīng)用于污水處理廠主要功能微生物亞硝酸鹽氧 化菌的檢測，待測樣品為污水處理系統(tǒng)中的活性污泥。由于亞硝酸鹽氧化菌 以污水為生存基質(zhì)，污水中含有大量未知的有機(jī)、無機(jī)污染物、顆粒物、雜 質(zhì)等，對DNA的提取純化干擾較大，并進(jìn)而影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增。因此本 申請對分析難度較大的亞硝酸鹽氧化菌不同屬的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了探索和優(yōu) 化，并獲得了較好的擴(kuò)增效果和定量結(jié)果。

　　故本發(fā)明提取實(shí)際生活污水處理系統(tǒng)中活性污泥微生物的基因組DNA， 采用硝化菌屬和硝化螺菌屬16S rDNA引物，建立檢測亞硝酸鹽氧化菌兩個 屬的實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對污水全程脫氮除磷 和短程脫氮除磷系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行定量檢測，分析運(yùn)行條件變化 過程中亞硝酸鹽氧化菌群落的動態(tài)變化與系統(tǒng)運(yùn)行的相關(guān)性，揭示亞硝酸鹽 氧化菌被淘洗的過程和形成短程硝化的機(jī)制，未見相關(guān)研究報道。

　　發(fā)明內(nèi)容

　　本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)、可靠的污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時 熒光定量PCR檢測方法，對污水處理廠中兩個屬的亞硝酸鹽氧化菌，即硝化菌 屬和硝化螺菌屬進(jìn)行檢測，不僅可以分析總的亞硝酸鹽氧化菌，而且可以分析 各個屬的動態(tài)變化。利用SYBR Green熒光染料法，無需設(shè)計多個探針即可檢 測多個基因，通用性好、成本低，并且可同時進(jìn)行大批量的樣本分析。可用于 污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌菌群數(shù)量的監(jiān)控和鑒定，具有很好的應(yīng)用前景。

　　本發(fā)明的技術(shù)方案：

　　一種污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于： 亞硝酸鹽氧化菌包括硝化菌屬和硝化螺菌屬，污水生物處理系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧 化菌包括硝化菌屬和硝化螺菌屬，分別定量檢測這兩個屬的微生物數(shù)量，二者數(shù) 量之和是亞硝酸鹽氧化菌的總量;提取實(shí)際生活污水處理系統(tǒng)中活性污泥微生物 的基因組DNA;采用硝化菌屬和硝化螺菌屬16S rDNA引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增 和瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，切膠純化回收DNA擴(kuò)增片段，獲得硝化菌屬和硝化螺 菌屬的擴(kuò)增片段;將兩個屬的純化回收的DNA擴(kuò)增片段與載體連接，連接好的 載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)15-18h，挑取白斑進(jìn)行重組菌落PCR驗(yàn)證;提取包含 目的片段的質(zhì)粒用作實(shí)時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，在實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn) 行擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對污水處理廠中亞硝酸鹽氧化菌進(jìn) 行定量檢測;

　　上述常規(guī)PCR擴(kuò)增體系如下：

　　上述實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

　　當(dāng)檢測硝化菌屬時采用硝化菌屬的正向引物為TGCGACCGGTCATGG，反 向引物為GGGCGGWGTGTACAAGGC;當(dāng)檢測硝化螺菌屬時采用硝化螺菌屬的 正向引物為CCTGCTTTCAGTTGCTACCG，反向引物為 GTTTGCAGCGCTTTGTACCG;

　　上述瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖質(zhì)量百分比濃度為2%，電泳電壓為120V，電 泳時間為60min;

　　上述硝化菌屬常規(guī)PCR和實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增程序如下：95℃處理 10min;35個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)包括95℃1min，62℃1min，72℃2min;硝 化螺菌屬常規(guī)PCR和實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增程序如下：95℃處理10min;35個 循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)包括95℃1min，60℃1min，72℃2min。

　　本發(fā)明的有益效果：

　　從控制點(diǎn)源污染入手，嚴(yán)格限制排放到地表水體的污水中的氮、磷濃度是減 輕水體富營養(yǎng)化的根本措施。污水生物脫氮，無論是全程脫氮方式還是短程脫氮 方式，亞硝酸鹽氧化菌的監(jiān)測都是保證處理系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵。本發(fā)明提供了 一種經(jīng)濟(jì)、簡便、可靠的污水處理廠中亞硝酸鹽氧化菌2個屬的實(shí)時熒光定量 PCR檢測方法，能夠從屬的水平對污水生物脫氮系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌的動態(tài) 變化進(jìn)行分析，既可用于城市污水處理廠日常運(yùn)行的微生物監(jiān)控，保證生物脫氮 效果;又可用于實(shí)驗(yàn)室有關(guān)亞硝酸鹽氧化菌的定量分析、代謝機(jī)制、基因表達(dá)解 析的研究，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

　　本發(fā)明通過提取實(shí)際污水處理系統(tǒng)中活性污泥微生物的基因組DNA，采用 亞硝酸鹽氧化菌的2個屬，即硝化菌屬和硝化螺菌屬的16S rDNA引物進(jìn)行常規(guī) PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，切膠純化回收DNA擴(kuò)增片段，獲得2個屬的 PCR產(chǎn)物。將純化產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和克隆培養(yǎng)后，提取包含目的片段的質(zhì)粒DNA 作為實(shí)時熒光定量PCR檢測硝化菌屬和硝化螺菌屬的標(biāo)準(zhǔn)品。在實(shí)時熒光定量 PCR儀上進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。2條實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線均呈現(xiàn)良 好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)、斜率與擴(kuò)增效率如表1所示，該方法符合精確定量的 要求。可以利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品中亞硝酸鹽氧化菌2個屬的菌群數(shù) 量進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明成功建立了亞硝酸鹽氧化菌2個屬的實(shí)時熒光定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，使單獨(dú)研究不同屬對環(huán)境的動態(tài)響應(yīng)成為可能。而且利用SYBR Green熒光染料法，檢測成本降低，便于推廣應(yīng)用。

　　表1硝化菌屬和硝化螺菌屬定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)、斜率與擴(kuò)增效率

　　本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)：

　　(1)本發(fā)明提取實(shí)際生活污水處理系統(tǒng)中活性污泥微生物的基因組DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品DNA的來源，同時獲得了亞硝酸鹽氧化菌2個屬的標(biāo)準(zhǔn)品。與人工 配水系統(tǒng)相比，菌群更為豐富。標(biāo)準(zhǔn)品的制備無需目標(biāo)菌的純培養(yǎng)和人工富集， 操作簡單、成本降低。

　　(2)本發(fā)明的定量方法不僅可以對總的亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行定量分析，還 可以對2個屬，即硝化菌屬和硝化螺菌屬分別定量，對監(jiān)測污水處理廠亞硝酸鹽 氧化菌菌群動態(tài)變化具有更強(qiáng)的適用性，為污水處理廠的長期穩(wěn)定運(yùn)行提供有 力保障。獲得的實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性良好，擴(kuò)增效率高，符合精 確定量的要求。利用SYBR Green熒光染料法，通用性好，檢測成本低。