申請日2014.01.13
公開(公告)日2014.04.23
IPC分類號C12N15/82; C02F3/32
摘要
一種高緯度城市生活污水植物水處理方法，它涉及一種生活污水的水處理方法。它采用外來入侵物種進行城市生活污水水處理，并利用轉(zhuǎn)基因技術增強空心蓮子草的氧結(jié)合能力和需氧量，使其可以處理污染程度高的生活污水水體;而且可以提高空心蓮子草的耐寒性，令其可在高緯度地區(qū)應用，使冬季水處理時間延長、水處理效果提升。方法：一、構(gòu)建植物表達載體;二、構(gòu)建空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株;三、培育、繁殖空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株，再將其移植到高緯度污染水體中進行污水處理和修復。本發(fā)明應用于水環(huán)境工程領域。
權(quán)利要求書
1.一種高緯度城市生活污水植物水處理方法，其特征在于高緯度城市生活污水植物水處 理方法按以下步驟進行：
一、構(gòu)建植物表達載體;
二、構(gòu)建空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株;
三、培育、繁殖空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株，再將空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株移植到高緯度污染 水體中進行污水處理和修復;
其中，步驟一中植物表達載體中包含啟動子super promoter和透明顫菌血紅蛋白基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高緯度城市生活污水植物水處理方法，其特征在于步驟一 中選用載體p3300-Tnos構(gòu)建植物表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高緯度城市生活污水植物水處理方法，其特征在于步驟一 中啟動子super promoter的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高緯度城市生活污水植物水處理方法，其特征在于步驟一 中透明顫菌血紅蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
說明書
一種高緯度城市生活污水植物水處理方法
技術領域
本發(fā)明涉及一種生活污水的水處理方法。
背景技術
由于城市的快速發(fā)展和人口數(shù)量的不斷增加，我國的生活污水越來越多。環(huán)保總局報告 顯示，目前城市生活污水排放量以年均5%的速度遞增，已超過工業(yè)污水排放量。生活污水不 但影響水質(zhì)，對我們生活的環(huán)境更是一大危害。
空心蓮子草(拉丁學名：Alternanthera philoxeroides(Mart.)Griseb.)，別名：革命草、水 花生、喜旱蓮子草等，屬莧科的一種植物。多年生草本;莖基部匍匐，上部上升，管狀，不 明顯4棱，長55～120厘米，具分枝，幼莖及葉腋有白色或銹色柔毛，莖老時無毛，僅在兩側(cè) 縱溝內(nèi)保留。葉片矩圓形、矩圓狀倒卵形或倒卵狀披針形。具有藥用價值。20世紀50～70年 代，隨著養(yǎng)豬事業(yè)的發(fā)展，作為優(yōu)良飼料在中國進行大力推廣，上世紀80年代后期為野生， 自然蔓生面積迅速擴大�？招纳徸硬葜饕谵r(nóng)田(包括水田和旱田)、空地、魚塘、溝渠、河 道等環(huán)境中生長為害，阻塞水上交通，封閉河塘水面，降低作物產(chǎn)量，影響農(nóng)田排灌，被列 為中國首批外來入侵物種。
空心蓮子草適應性強，既能扎根生于淺水中，也能漂浮于水面上;抗酸堿能力強，可在 pH值為3～12的環(huán)境中生長;并能耐受30%的鹽濃度。但是被生活污染嚴重污染的水體中氧 氣的含量低，成為制約空心蓮子草進行植物水處理的一個瓶頸。而且，在高緯度地區(qū)冬季空 心蓮子草雖然水下部分仍有活力，來年春天仍可萌發(fā)生長，但水面部分己凍死，由于高緯度 地區(qū)冬季時間長導致其難以在高緯度地區(qū)用于水體修復。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用外來入侵物種進行城市生活污水水處理，并利用轉(zhuǎn)基因技術增強空心蓮子草 的氧結(jié)合能力和需氧量，使其可以處理污染程度高的生活污水水體;而且可以提高空心蓮子 草的耐寒性，令其可在高緯度地區(qū)應用，使冬季水處理時間延長、水處理效果提升。
高緯度城市生活污水植物水處理方法按以下步驟進行：
一、構(gòu)建植物表達載體;
二、構(gòu)建空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株;
三、培育、繁殖空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株，再將空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株移植到高緯度污染 水體中進行污水處理和修復;
其中，步驟一中植物表達載體中包含啟動子super promoter和透明顫菌血紅蛋白基因。
本發(fā)明也利用高緯度地區(qū)冬季寒冷的自然條件對空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株的生長和蔓延進 行遏制，在利用空心蓮子草的同時防止空心蓮子草產(chǎn)生生態(tài)破壞。
具體實施方式
本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組 合。
具體實施方式一：本實施方式高緯度城市生活污水植物水處理方法按以下步驟進行：
一、構(gòu)建植物表達載體;
二、構(gòu)建空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株;
三、培育、繁殖空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株，再將空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株移植到高緯度污染 水體中進行污水處理和修復;
其中，步驟一中植物表達載體中包含啟動子super promoter和透明顫菌血紅蛋白基因。
本實施方式中先將核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的啟動子super promoter導入到載體 p3300-Tnos中，然后將人工合成的透明顫菌血紅蛋白基因(如SEQ ID NO：2所示)和導入 啟動子super promoter的載體p3300-Tnos都用XbaI和SacI進行雙酶切，之后進行連接，獲 得植物表達載體。
本實施方式獲得的植物表達載體分別用EcoRI和HindⅢ、XbaI和EcoRI、XbaI和SacI 進行雙酶切，分別獲得1.8kb、0.7kb和456bp三條條帶，說明植物表達載體構(gòu)建成功。
利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將植物表達載體導入農(nóng)桿菌中，然后對目的基因(啟動子super promoter和透明顫菌血紅蛋白基因)進行檢測與測定，選擇成功表達的農(nóng)桿菌導入空心蓮子 草;之后利用抗生素進行轉(zhuǎn)化植株的篩選，并利用PCR法進行轉(zhuǎn)化植株的鑒定，含有啟動子 super promoter和透明顫菌血紅蛋白基因的為成功轉(zhuǎn)化的空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株。
具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟三中空心蓮子草轉(zhuǎn)基 因植株生根后，幼苗高度長到3cm進行移植。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟一中啟動子super promoter導入到載體p3300-Tnos后獲得質(zhì)粒p3300-super promoter-Tnos，然后用堿裂解法提 取p3300-super promoter-Tnos質(zhì)粒，再用XbaI和SacI進行雙酶切，XbaI和SacI雙酶切反應 體系為50μL，由20μL的質(zhì)粒、0.5μL的限制性內(nèi)切酶XbaI、0.5μL的限制性內(nèi)切酶SacI、5μL 的10×共用酶切緩沖液和余量的ddH2O組成;雙酶切反應：在30℃水浴鍋中放置2h。其它步 驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟一中經(jīng)過雙酶切的人 工合成的透明顫菌血紅蛋白基因和表達載體p3300-super promoter-Tnos進行連接，連接體系 為10μL，由6μL的人工合成的透明顫菌血紅蛋白基因片段、2μL的載體p3300-super promoter-Tnos片段，1μL的T4DNA ligation buffer和1μL的T4DNA ligation組成;16℃連接 反應12h，獲得植物表達載體。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：步驟二按以下步驟構(gòu)建空 心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株：
①農(nóng)桿菌(LBA4404)感受態(tài)細胞的制備
1、從含有50mg/L Sm、50mg/L Rif的YEB的平板上挑取農(nóng)桿菌LBA4404的單菌落;
2、接種于5mL含Sm和Rif的YEB液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃，180r/min，振蕩培養(yǎng)1～2d;
3、取菌液按1:10的比例重新接種于50mL含Sm和Rif的YEB中;
4、振蕩培養(yǎng)6～8h，至對數(shù)生長期OD600≈0.5;
5、菌液置于冰上20～30min，分裝于高壓滅菌的1.5mL eppendorf管中;
6、4℃、5000r/min離心10min，棄上清;
7、沉淀加入800μL冰預冷的0.05mol/L CaCl2懸浮細胞，冰浴20～30min;
8、4℃、5000r/min離心10min，棄上清;
9、沉淀加入100μL冰預冷的0.05mol/L CaCl2重懸細胞;
10、置于4℃保存?zhèn)溆?
②凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404
1、取農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，加入3～4μL植物表達載體，輕輕混勻，置冰上30min;
2、液氮冷凍3～5min，迅速移至37℃水浴鍋放置中2～3min融化;
3、加入800μL YEB，28℃振蕩培養(yǎng)4～5h;
4、8000r/min離心5min，去上清，留下適量上清，將沉淀混勻，取100μL涂于含相應抗 生素YEB的平板上，28℃倒置暗培養(yǎng)48h。
�、蹨蕚滢r(nóng)桿菌侵染的受體材料
育苗：將空心蓮子草的葉片用水清洗2～3遍后，用75%酒精對葉片進行表面消毒15～30s， 再用0.1%的升汞消毒30～60s，無菌水沖洗5遍，然后接種于MS0培養(yǎng)基中;
④農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的再生
1、菌種活化
將農(nóng)桿菌接種于加有Sm、Rif和Kan的LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)36～48h， 或至長出單菌落;挑取單菌落并接種于10mL含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃， 180r/min，振蕩培養(yǎng);待菌液長至對數(shù)生長期，即OD600=0.4～0.6，再次將菌液接種于含相應 抗生素的LB液體培養(yǎng)基中進行二次活化;
2、侵染
取出預培養(yǎng)的空心蓮子草外植體放入活化好的農(nóng)桿菌菌液中，浸泡10～15min，其間輕搖 幾次;取出材料，用無菌水沖洗4～5次，然后用無菌濾紙吸去多余的液體;
3、共培養(yǎng)
將侵染后的外植體接種到MS0培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)1～2d;
4、繼代培養(yǎng)
外植體經(jīng)共培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基MS1中，28℃光培養(yǎng)，分化愈傷組織，約10d 左右繼代一次;
5、篩選培養(yǎng)
繼代培養(yǎng)2～3周后，外植體愈傷組織開始分化出抗性芽，將抗性芽轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基 MS2上，并繼續(xù)進行繼代培養(yǎng);
6、抗性芽的生根培養(yǎng)
待芽長至3～4cm長，將其剪下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS3上，誘導生根，大約15～20d長出 不定根。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
實施例1
在高緯度地區(qū)進行對比試驗：
試驗地點：大慶市，大慶市位于黑龍江省西部，松遼盆地中央坳陷區(qū)北部，市區(qū)地理位 置北緯45°46'，東經(jīng)124°19'至125°12'之間。試驗生活污水采自大慶市薩南公園。
試驗分為兩種方案進行，第一種方案采用本發(fā)明的生活污水處理方法，第二種方案直接 采用未經(jīng)過改造的普通空心蓮子草處理生活污水;每種方案又采取3種不同的種植密度進行 試驗，并選擇一同緯度、同水質(zhì)、同面積、同樣條件的水域作為空白對照樣。
2011年春天試驗地點平均氣溫達到15℃將幼苗高為3cm的空心蓮子草轉(zhuǎn)基因植株和普 通空心蓮子草植株移植到各自的污染水體中進行試驗。
