申請日2016.05.30

　　公開(公告)日2016.11.09

　　IPC分類號(hào)G01N30/02; G01N30/06

　　摘要

　　本發(fā)明公開了一種污水和污泥中12種典型抗生素的同時(shí)檢測方法，包括：對污泥進(jìn)行冷凍干燥，研磨過篩取樣，加替代物，加入甲醇和Na2EDTA‑McIlvaine緩沖液，混勻超聲離心提取上清液，將重復(fù)三次提取的上清液合并后用超純水定容，調(diào)節(jié)pH為3.0;抽濾水樣，用超純水稀釋并調(diào)節(jié)pH為3.0，加入替代物和Na2EDTA·2H2O，放置一個(gè)小時(shí);固相萃取采用SAX‑HLB串聯(lián)系統(tǒng)，用甲醇、超純水和酸性超純水活化，然后上柱、淋洗、甲醇洗脫;洗脫液氮吹復(fù)溶，用優(yōu)化好的液質(zhì)參數(shù)定量。本發(fā)明優(yōu)化的超聲萃取、固相萃取、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中抗生素的有效提取和準(zhǔn)確定量，可應(yīng)用于廣泛的污水和污泥樣品的測定。

　　權(quán)利要求書

　　1.污水和污泥中12種典型抗生素的同時(shí)檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

　　步驟一、取一定量的污泥預(yù)凍后冷凍干燥24h，研磨過篩后稱取1g干污泥，將該干污泥放入50mL的塑料離心管中，加入100μL質(zhì)量體積濃度為1mg/L的13C3-咖啡因作為替代物;

　　步驟二、向上述塑料離心管中加入7.5mL的甲醇和7.5mL且pH為4.0的Na2EDTA-McIlvaine緩沖液，混勻振蕩1min，超聲萃取15min，4000rpm離心5min，取出上清液，備用，再重復(fù)兩次上述操作;

　　步驟三、合并步驟二獲得的上清液，并用超純水定容到500mL，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為3.0，獲得污泥的稀釋樣品;

　　步驟四、取100～500mL的污水水樣，用0.7μm的玻璃纖維濾膜進(jìn)行過濾，超純水稀釋到1000mL，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.0，加入100μL質(zhì)量體積濃度為1mg/L的13C3-咖啡因作為替代物，加入0.5g Na2EDTA·2H2O，放置一個(gè)小時(shí)，間歇振蕩以保持Na2EDTA·2H2O的溶解狀態(tài)，完成污水水樣的前處理;

　　步驟五、將步驟三獲得的污泥的稀釋樣品和經(jīng)過步驟四前處理后的污水樣品分別進(jìn)行固相萃取，用SAX-HLB小柱串聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行污水樣品和污泥的稀釋樣品的固相萃取，所述固相萃取的過程是：依次用6mL甲醇、6mL超純水和6mL pH為3.0的超純水進(jìn)行活化，以5mL/min的流速上柱，拆掉SAX小柱后用5mL的超純水淋洗HLB小柱，最后用8mL的甲醇洗脫得到洗脫液;

　　步驟六、將步驟五得到的洗脫液在40℃水浴條件下，氮吹至其中的溶劑完全揮發(fā)，加入內(nèi)標(biāo)物，再用1mL的10%乙腈+90%0.3%甲酸溶液復(fù)溶，得到檢測樣品;

　　步驟七、分別以乙腈和0.3%甲酸溶液為流動(dòng)相，利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀對檢測樣品進(jìn)行12種目標(biāo)抗生素的定量分析。

　　2.如權(quán)利要求1所述污水和污泥中12種典型抗生素的同時(shí)檢測方法，其特征在于，步驟二中的超聲萃取所采用的功率密度為0.1W/mL。

　　3.如權(quán)利要求1所述污水和污泥中12種典型抗生素的同時(shí)檢測方法，其特征在于，步驟二中的超聲萃取是在冰浴中進(jìn)行。

　　4.如權(quán)利要求1所述的污水和污泥中12種典型抗生素的同時(shí)檢測方法，其特征在于，步驟七中，對檢測樣品進(jìn)行12種目標(biāo)抗生素的定量分析中，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的工作參數(shù)如下：

　　色譜參數(shù)包括：脫溶劑氣溫度為450℃，脫溶劑氣流量為900L/Hr，錐孔氣流速為50L/hr，柱溫為40℃;檢測時(shí)長10min;流動(dòng)相梯度如下：

　　質(zhì)譜參數(shù)包括：質(zhì)譜掃描分三個(gè)通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-10min，上述三個(gè)通道分別對應(yīng)的駐留時(shí)間依次為0.019s，0.063s和0.097s。

　　說明書

　　污水和污泥中12種典型抗生素的同時(shí)檢測方法

　　技術(shù)領(lǐng)域

　　本發(fā)明涉及抗生素的檢測分析領(lǐng)域，具體涉及污水和污泥中12種典型抗生素的同時(shí)檢測方法。

　　背景技術(shù)

　　抗生素作為一種新型污染物廣泛出現(xiàn)在地表水、地下水、土壤甚至飲用水中，盡管濃度水平較低(通常為ng/L～μg/L或μg/kg～mg/kg)，仍可能會(huì)對敏感性生物產(chǎn)生急性或慢性的毒害作用�？股�素持續(xù)排放形成的選擇性壓力，還會(huì)導(dǎo)致抗性細(xì)菌和抗性基因的產(chǎn)生，該類基因片段一旦轉(zhuǎn)移進(jìn)入致病菌，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害抗生素類藥物對人類和動(dòng)物感染的治療潛力。污水廠是環(huán)境中抗生素的重要來源，被生物體攝入但未被吸收的抗生素會(huì)隨著排泄物進(jìn)入污水廠，因而污水和污泥中會(huì)存在一定濃度水平的抗生素。

　　鑒于污水和污泥中抗生素類藥物的濃度水平較低，屬于微量有機(jī)污染物，且污水和污泥中基質(zhì)成分復(fù)雜，一般的檢測手段難以滿足要求，因此有必要建立新的具有高靈敏度、高特異性的前處理和檢測方法，實(shí)現(xiàn)該類復(fù)雜基質(zhì)中微量抗生素的準(zhǔn)確定量，以供進(jìn)一步的研究分析。

　　針對微量抗生素的檢測技術(shù)，常用的有液相色譜檢測技術(shù)，包括高效液相色譜-紫外吸收檢測技術(shù)、高效液相色譜-熒光檢測技術(shù)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附測定法和生物傳感器技術(shù)，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測技術(shù)靈敏度高、檢出限低、穩(wěn)定性強(qiáng)，因此優(yōu)選該技術(shù)用于分析檢測。另外，超高效液相色譜與液相色譜相比，靈敏度和分辨率更高，分析速度更快。對水相中抗生素的富集可采用冷凍干燥法和固相萃取技術(shù)，固相萃取技術(shù)得出的檢測限更低，方法更可靠。對吸附態(tài)抗生素的提取可采用超聲萃取和加壓溶液萃取的方法，兩者的回收率相當(dāng)，但是超聲萃取可同時(shí)處理多個(gè)樣品，因而更方便快捷。富集后的抗生素的濃縮方法有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮吹濃縮，相較于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，氮吹濃縮耗時(shí)較長，但目標(biāo)物回收率較高且穩(wěn)定。通過對各個(gè)步驟應(yīng)用技術(shù)的比選可以初步制定污水和污泥中抗生素的提取、富集、濃縮和檢測的方案，但針對不同的水質(zhì)特點(diǎn)和目標(biāo)物特性，仍要進(jìn)行具體操作條件的優(yōu)化。

　　目前針對污水和污泥中抗生素的檢測方法多用于污水廠進(jìn)出水及好氧污泥的檢測，而對于厭氧反應(yīng)器，如厭氧消化池中污水和污泥，尚未形成成熟的抗生素檢測方法。由于厭氧反應(yīng)器中有機(jī)化合物種類較多，濃度較高，對抗生素一類微量污染物的檢測干擾較為明顯，因此需要對厭氧反應(yīng)器中的污水和污泥的抗生素檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，得出可普遍適用于污水廠各種污水和污泥的抗生素檢測方法。目前針對污水中抗生素檢測的方法一般采用HLB小柱進(jìn)行固相萃取(張金,宗棟良,常愛敏,等.水環(huán)境中典型抗生素SPE-UPLC-MS/MS檢測方法的建立[J].環(huán)境化學(xué),2015,34(8):1446-1452)，如果用于厭氧反應(yīng)器中污水的抗生素檢測，容易使較多有機(jī)干擾物截留在HLB小柱內(nèi)，影響抗生素的檢測準(zhǔn)確性，因此需要優(yōu) 化萃取過程，盡可能減少有機(jī)雜質(zhì)的干擾。目前針對污泥中抗生素的檢測方法一般采用超聲萃取(Yμan XJ,Qiang ZM,Ben WW.Rapid detection of mμltiple class pharmaceμticals in both mμnicipal wastewater and slμdge with μltra high performanceliqμid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of EnvironmentalSciences,2014,26(9):1949-1959)，但超聲條件尚未形成統(tǒng)一的參數(shù)，而且提取液的成分和用量方面還需要進(jìn)一步優(yōu)化。

　　發(fā)明內(nèi)容

　　本發(fā)明針對復(fù)雜的污水和污泥基質(zhì)中微量的抗生素污染物，提出一種污水和污泥中12種典型抗生素的同時(shí)檢測方法，該檢測方法靈敏度高、分辨率高、回收率高且可應(yīng)用于污水廠各種污水和污泥樣品的檢測分析。

　　本發(fā)明提出的一種污水和污泥中12種典型抗生素的同時(shí)檢測方法，包括以下步驟：

　　步驟一、取一定量的污泥預(yù)凍后冷凍干燥24h，研磨過篩后稱取1g干污泥，將該干污泥放入50mL的塑料離心管中，加入100μL質(zhì)量體積濃度為1mg/L的13C3-咖啡因作為替代物;

　　步驟二、向上述塑料離心管中加入7.5mL的甲醇和7.5mL且pH為4.0的Na2EDTA-McIlvaine緩沖液，混勻振蕩1min，超聲萃取15min，4000rpm離心5min，取出上清液，備用，再重復(fù)兩次上述操作;

　　步驟三、合并步驟二獲得的上清液，并用超純水定容到500mL，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為3.0，獲得污泥的稀釋樣品;

　　步驟四、取100～500mL的污水水樣，用0.7μm的玻璃纖維濾膜進(jìn)行過濾，超純水稀釋到1000mL，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.0，加入100μL質(zhì)量體積濃度為1mg/L的13C3-咖啡因作為替代物，加入0.5g Na2EDTA·2H2O，放置一個(gè)小時(shí)，間歇振蕩以保持Na2EDTA·2H2O的溶解狀態(tài)，完成污水水樣的前處理;

　　步驟五、將步驟三獲得的污泥的稀釋樣品和經(jīng)過步驟四前處理后的污水樣品分別進(jìn)行固相萃取，用SAX-HLB小柱串聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行污水樣品和污泥的稀釋樣品的固相萃取，所述固相萃取的過程是：依次用6mL甲醇、6mL超純水和6mL pH為3.0的超純水進(jìn)行活化，以5mL/min的流速上柱，拆掉SAX小柱后用5mL的超純水淋洗HLB小柱，最后用8mL的甲醇洗脫得到洗脫液;

　　步驟六、將步驟五得到的洗脫液在40℃水浴條件下，氮吹至其中的溶劑完全揮發(fā)，加入內(nèi)標(biāo)物，再用1mL的10%乙腈+90%0.3%甲酸溶液復(fù)溶，得到檢測樣品;

　　步驟七、分別以乙腈和0.3%甲酸溶液為流動(dòng)相，利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀對檢測樣品進(jìn)行12種目標(biāo)抗生素的定量分析。

　　進(jìn)一步講，步驟二中的超聲萃取所采用的功率密度為0.1W/mL。

　　步驟二中的超聲萃取是在冰浴中進(jìn)行。

　　步驟七中，對檢測樣品進(jìn)行12種目標(biāo)抗生素的定量分析中，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的工作參數(shù)如下：

　　色譜參數(shù)包括：脫溶劑氣溫度為450℃，脫溶劑氣流量為900L/Hr，錐孔氣流速為50L/hr，柱溫為40℃;檢測時(shí)長10min;流動(dòng)相梯度如下：

　　質(zhì)譜參數(shù)包括：質(zhì)譜掃描分三個(gè)通道，包括0-3.7min，3.7-5.5min和5.5-10min，上述三個(gè)通道分別對應(yīng)的駐留時(shí)間依次為0.019s，0.063s和0.097s。

　　與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

　　(1)本發(fā)明的十二種目標(biāo)物分屬于四個(gè)不同的抗生素類別，結(jié)構(gòu)、性質(zhì)各有不同，但在本方法中，針對高有機(jī)質(zhì)濃度的厭氧污水和污泥，同時(shí)可以得到準(zhǔn)確定量分析。

　　(2)污水廠實(shí)際水樣中目標(biāo)物濃度波動(dòng)很大，在本方法中首先采用稀釋的方法減小復(fù)雜基質(zhì)的影響(一般稀釋到溶解性化學(xué)需氧量SCOD值低于100mg/L)，并在固相萃取過程中，采用SAX-HLB小柱串聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行萃取，進(jìn)一步降低萃取和檢測過程中的雜質(zhì)干擾，方法的線性范圍可達(dá)三個(gè)數(shù)量級(jí)，滿足污水廠各種污水和污泥中抗生素的定量需求。

　　(3)污水廠污泥中的抗生素主要是以吸附態(tài)存在，在超聲萃取過程中，既要保證充分解吸到提取液中，又要避免抗生素發(fā)生降解，因此在處理過程中采用較小的功率密度(0.1W/mL)，并加入冰浴;采用優(yōu)化的提取液成分和用量，提高萃取效果。