申請(qǐng)日2013.12.12

　　公開(公告)日2015.09.30

　　IPC分類號(hào)C12N1/38; C12N11/10; C12R1/38; C02F3/34; C12N11/08

　　摘要

　　本發(fā)明公開了一種好氧反硝化細(xì)菌及其在污水處理中的應(yīng)用，申請(qǐng)人通過富集從濕地中篩選出一種好氧反硝化細(xì)菌，施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，CCTCC NO：M2013488。該細(xì)菌可用于處理高NO3-的廢水，最高去除率可達(dá)99.6%，且無亞硝態(tài)氮的累積，并可同時(shí)去除有機(jī)廢水中的COD，去除率可達(dá)60%-80%。相比其他報(bào)道的用于污水處理的好氧反硝化細(xì)菌，本發(fā)明菌株對(duì)污水處理高效，24h后對(duì)硝態(tài)氮的去除率可達(dá)99.6%，脫氮速率可達(dá)22.6mg?L-1?h-1，其除氮效率是已報(bào)道菌株的1.51～4.57倍，可以單獨(dú)使用或者固定化后應(yīng)用于廢水處理中，應(yīng)用廣泛。

　　權(quán)利要求書

　　1.一種好氧反硝化細(xì)菌，其特征在于：施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，CCTCC NO：M 2013488。

　　2.權(quán)利要求1所述的好氧反硝化細(xì)菌在污水處理中的應(yīng)用。

　　3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，該好氧反硝化細(xì)菌用海藻酸鈉進(jìn)行固定。

　　4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，該好氧反硝化細(xì)菌用聚乙烯醇進(jìn)行固定。

　　5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，該好氧反硝化細(xì)菌用海藻酸鈉和聚乙烯醇進(jìn)行固定。

　　說明書

　　一種好氧反硝化細(xì)菌及其在污水處理中的應(yīng)用

　　技術(shù)領(lǐng)域

　　本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域，具體涉及一種好氧反硝化細(xì)菌，還涉及該細(xì)菌在污水處理 中的應(yīng)用。

　　背景技術(shù)

　　近年來，工業(yè)廢水的大量排放以及農(nóng)業(yè)大量施用化肥，導(dǎo)致氮素污染引起的水環(huán)境問題 日益突出，而其中硝酸鹽污染問題尤為嚴(yán)重。硝酸鹽及其衍生物因具有致病、致癌作用而影 響人類健康。因此，加大對(duì)污水中氮素污染的治理，尤其是提高硝酸鹽氮的處理效率是目前 污水處理技術(shù)中亟待解決的問題。

　　生物反硝化脫氮是利用微生物的作用，在厭氧或缺氧條件下，以硝酸鹽替代氧作電子受 體將硝酸鹽逐步還原為氣態(tài)產(chǎn)物脫除，是一種經(jīng)濟(jì)有效的脫氮方式。但往往由于受到厭氧和 缺氧條件的限制，生物脫氮過程進(jìn)行的并不徹底。好氧反硝化菌的出現(xiàn)使得反硝化過程更容 易控制，其是利用好氧反硝化酶的作用，在有氧條件下進(jìn)行反硝化作用的一類反硝化細(xì)菌。 自20世紀(jì)80年代，Robertson等(Robertson et al.Archives of Microbiology,1984,139,351-354) 在除硫和反硝化處理系統(tǒng)中首次分離出好氧反硝化菌以來，人們對(duì)于好氧反硝化菌的脫氮性 能已經(jīng)進(jìn)行了一定程度上的研究。然而已篩得的好氧反硝化菌大部分脫氮效率不高，一般在 溶解氧濃度較低時(shí)才會(huì)具有反硝化活性，因此，篩選分離出高效的好氧反硝化細(xì)菌菌株，并 將其應(yīng)用于實(shí)際污水處理中，以節(jié)約脫氮成本，提高經(jīng)濟(jì)效益具有十分重要的意義。

　　發(fā)明內(nèi)容

　　本發(fā)明的目的在于提供一株好氧反硝化細(xì)菌，該細(xì)菌已于2013年10月23日送往中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類命名：施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，保 藏編號(hào)：CCTCC NO：M2013488。該菌株具有高效脫除水體中硝酸鹽氮的能力。

　　本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一株好氧反硝化細(xì)菌在污水處理中的應(yīng)用，單獨(dú)使用該 菌，或者將該菌進(jìn)行固定化后投放到水體中，均可以有效地去除水體中的硝酸鹽氮，且無亞 硝態(tài)氮的累積，并且除氮速度快。

　　為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

　　一種好氧反硝化細(xì)菌，其篩選過程是：

　　(1)富集

　　于2013年5月從增氧型復(fù)合垂直流人工濕地小試系統(tǒng)兩套系統(tǒng)中采集土壤樣品，采樣 深度為表層10cm。無菌條件下稱量10g土壤接入500mL的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集，利用間 歇曝氣法進(jìn)行富集，間歇時(shí)間為12h，每次曝氣3h，于30℃溫箱培養(yǎng)，每五天轉(zhuǎn)接一次， 富集時(shí)間1個(gè)月。測(cè)得硝態(tài)氮的去除率為99.9%，基本上沒有亞硝氮的累積。

　　所述液體培養(yǎng)基為KNO32g，K2HPO41g，KH2PO41g，MgSO40.2g，檸檬酸 鈉5g，微量鹽溶液2mL;蒸餾水1000mL。

　　(2)初篩

　　采用涂布法將富集得到的菌懸液均勻涂布于BTB選擇性培養(yǎng)基，30℃溫箱培養(yǎng)3d后， 選取變藍(lán)的菌落或暈圈作為初篩菌。

　　(3)復(fù)篩

　　將初篩的菌株接種于液體培養(yǎng)基，30℃，120r·min-1搖床培養(yǎng)5d，進(jìn)行復(fù)篩。每24小 時(shí)利用格氏試劑、二苯胺試劑顯色來檢測(cè)硝酸鹽的降解情況，選取去除效果好的菌株。

　　所述BTB培養(yǎng)基為：瓊脂20g，KNO31g，KH2PO41g，F(xiàn)eCl2·6H2O0.5g，CaCl2·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O1g，琥珀酸鈉8.5g，BTB(1%溶于酒精)1mL;蒸餾水1000mL，用 1mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0～7.3。

　　通過綜合比較硝態(tài)氮的去除率，亞硝態(tài)氮的累積量以及硝態(tài)氮的去除速率等指標(biāo)，最終 從28株初篩菌中篩選出一株好氧反硝化細(xì)菌JH-1，其16SrRNA為SEQ ID NO.1所示。該 細(xì)菌已于2013年10月23日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類命名：施氏假單 胞菌(Pseudomonas stutzeri)JH-1，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M2013488，地址：中國(guó)武漢 武漢大學(xué)。

　　JH-1為革蘭氏陰性菌，為短桿菌，長(zhǎng)為1.0um—1.5um,寬為0.2um—0,4um,無芽孢和鞭 毛，在固體培養(yǎng)基上形成不透明的白色菌落，菌落表面光滑，邊緣整齊。

　　JH-1生理生化特性–酶活、碳源同化

　　+：陽性，-：陰性，

　　JH-1生理生化特性--酶活

　　+：陽性反應(yīng);-：陰性反應(yīng);W：弱陽性反應(yīng)

　　一種好氧反硝化細(xì)菌在污水處理中的應(yīng)用，其步驟是：

　　(1)將活化后的菌液接種于待處理的含氮廢水中，投加量為受處理廢水體積的5%，pH 范圍為7.0-7.3，在搖床(30℃，120r/min)條件下，定時(shí)取樣檢測(cè)水樣中硝態(tài)氮、COD的 去除率及亞硝態(tài)氮的累積量。

　　(2)用三種不同的基質(zhì)包埋細(xì)菌獲得固定化好氧反硝化細(xì)菌，并用于廢水脫氮處理中

　　A、海藻酸鈉固定法：稱取4g海藻酸鈉溶解到60mL的0.9%的生理鹽水中，高溫高壓 (121℃，105-110kPa)滅菌冷卻至室溫(20-25℃)，與80mL好氧反硝化細(xì)菌懸浮液充分混 合，滴入4%w/v的CaCl2溶液中，冰浴，邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球;將形 成的小球放置于4℃冰箱中交聯(lián)固化12-24h后，用生理鹽水洗滌2-3次備用。

　　B、聚乙烯醇固定法：配制60mL10%w/v的聚乙烯醇溶液，高溫高壓(121℃，105-110kPa) 滅菌冷卻到室溫(20-25℃)，與80mL好氧反硝化菌懸液充分混合，滴入飽和硼酸溶液中， 冰浴，邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球;將形成的小球放置于4℃冰箱中交聯(lián)固 化12-24h后，用生理鹽水洗滌2-3次備用。

　　C、海藻酸鈉和聚乙烯醇固定法：5%w/v聚乙烯醇和5%w/v的海藻酸鈉的混合溶液60mL， 加熱使其完全混合，高溫高壓滅菌(121℃，105-110kPa)，冷卻至室溫(20-25℃)，與80mL 好氧反硝化菌懸液充分混合;將此混合液用注射器擠入到4%w/v的CaCl2溶液中，冰浴， 邊滴邊攪拌，使其形成直徑為2mm的小球;將形成的小球放置于4℃冰箱中交聯(lián)固化11-13h， 用無菌水清洗小球，再放入飽和硼酸溶液中，于4℃冰箱中交聯(lián)固化11-13h，用生理鹽水洗 滌2-3次備用。

　　將A、B、C三步制得的好氧反硝化細(xì)菌小球從冰箱中取出，用雙蒸水或者0.9%w/v的 生理鹽水洗滌3-4次，然后浸泡在0.9%的生理鹽水中，曝氣約11-13h左右以活化固定化小 球，將一定量活化后的固定化小球填充到人工濕地模擬柱中，進(jìn)行廢水脫氮處理研究。

　　(3)于天然湖水中加入適量外加碳源檸檬酸鈉，將經(jīng)24h活化的施氏假單胞菌JH-1 按5%的接種量接入湖水中，搖床(30℃，120rpm)培養(yǎng)48h測(cè)定水體中硝態(tài)氮以及亞硝 態(tài)氮的量。

　　與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果

　　本發(fā)明菌株可利用的碳源和氮源范圍廣泛，易于培養(yǎng)。

　　本發(fā)明菌株可用于處理高NO3-的廢水，最高去除率可達(dá)99.6%，且無亞硝態(tài)氮的累積。

　　本發(fā)明菌株可同時(shí)去除有機(jī)廢水中的COD，去除率可達(dá)60%-80%。

　　本發(fā)明菌株可以單獨(dú)使用或者固定化后應(yīng)用于廢水處理中，應(yīng)用廣泛。

　　相比其他已發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌，菌株JH-1是一株非常高效的好氧反硝化細(xì)菌，24h 后對(duì)硝態(tài)氮的去除率可達(dá)99.6%，脫氮速率可達(dá)22.6mg·L-1·h-1，已報(bào)道分離出的好氧反硝化 菌其脫氮速率大多數(shù)在4.50～13.7mg·L-1·h-1。JH-1脫氮速率是這些菌的1.51～4.57倍。