申請日2010.04.20

　　公開(公告)日2010.07.28

　　IPC分類號C12Q1/04

　　摘要

　　一種從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法，它涉及一種篩選生物破乳菌的方法。它解決了現(xiàn)有生物破乳菌破乳效能低，篩選技術滯后，篩選方法針對性差、操作復雜、時間長、篩選效率低的問題。方法：1.富集培養(yǎng)活性污泥中的目的菌，得菌液;2.菌液分離培養(yǎng)得菌株;3.制備全培養(yǎng)液;4.測定排開油圈的直徑，取直徑d≥3.0cm的菌株;5.制備全培養(yǎng)液;6.向O/W型乳狀液中加全培養(yǎng)液進行破乳，選取排油率≥50%的菌株，即完成。本發(fā)明將初篩破乳菌時間從大于3個月降低至1個月，篩出率可達到100%，破乳能力高于50%的菌株，進一步馴化培養(yǎng)則可得到破乳能力高于80%的高效菌株，針對性強，操作簡單易。

　　權利要求書

　　1.一種從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法，其特征在于從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法按以下步驟進行：一、向裝有150ml液體無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中接種活性污泥，在溫度為28～30℃、搖床轉數(shù)為140r/min的條件下培養(yǎng)7d，得富集菌液，然后轉接到新鮮的液體無機鹽培養(yǎng)基中，在溫度為28～30℃、搖床轉數(shù)為140r/min的條件下培養(yǎng)7d，重復轉接3次，得菌液;二、采用藍膠平板培養(yǎng)基或油平板培養(yǎng)基對菌液進行劃線分離培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為倒置于28～30℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h，然后挑取陽性單菌落進行劃線純化培養(yǎng)，直至得到菌落及菌體形態(tài)一致的菌株;三、將菌株接種于裝有100ml液體無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為30℃、搖床轉數(shù)為140r/min的條件下培養(yǎng)3d，得全培養(yǎng)液;四、將0.2ml經(jīng)過油紅O染色的煤油滴加到有30ml蒸餾水且直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，煤油膜鋪開穩(wěn)定后，再向煤油膜表面滴加20μl全培養(yǎng)液，靜止30s后測定排開油圈的直徑，選取直徑d≥3.0cm的菌株;五、將步驟四中所得菌株接種于裝有100ml液體無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為30℃、搖床轉數(shù)為140r/min的條件下培養(yǎng)3d，得全培養(yǎng)液;六、向裝有5mLO/W型乳狀液的磨口具塞比色管中加入2mL步驟五中所得全培養(yǎng)液，震蕩后靜止，在室溫下進行破乳，24h后選取排油率≥50%的菌株，即完成從活性污泥中快速篩選生物破乳菌;其中步驟一中活性污泥按體積比為25%的量接種。

　　2.根據(jù)權利要求1所述的一種從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法，其特征在于步驟一、步驟三和步驟五中液體無機鹽培養(yǎng)基的成分均相同，液體無機鹽培養(yǎng)基由4.0g的NH4NO3、4.0g的K2HPO4、6.0g的KH2PO4、0.2g的MgSO4·7H2O、1ml的微量元素溶液、40ml的液體石蠟和1000mL的去離子水中組成，所述的微量元素溶液由1000mg的CaCl2·2H2O、1000mg的FeSO4·7H2O和1400mg的EDTA溶于1000mL的去離子水中組成。

　　3.根據(jù)權利要求1所述的一種從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法，其特征在于步驟一中活性污泥來自城市污水處理廠曝氣池。

　　4.根據(jù)權利要求1所述的一種從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法，其特征在于步驟二中藍膠平板培養(yǎng)基由1.0g的牛肉膏、20g的葡萄糖、5g的蛋白胨、0.2g的酵母膏和20g的瓊脂粉溶于蒸餾水1000ml中組成。

　　5.根據(jù)權利要求1所述的一種從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法，其特征在于步驟二中油平板培養(yǎng)基由0.1g的(NH4)2SO4、0.2g的NH4NO3、0.03g的MgSO4、1g的KH2PO4、0.4g的Na2HPO4、0.05g的酵母粉、20g的瓊脂粉、浸過液體石蠟的粗濾紙和1000ml的蒸餾水組成。

　　說明書

　　一種從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法

　　技術領域

　　本發(fā)明涉及一種篩選生物破乳菌的方法。

　　背景技術

　　生物破乳劑作為生物制劑的一種，具有破乳效率高、成本低、適應性高、環(huán)境友好、可重復使用等優(yōu)點，具有廣泛的研究前景。而高效生物破乳菌的種類與數(shù)量直接關系到生物破乳劑的應用范圍及破乳效果;目前，已報道的高效生物破乳菌的種數(shù)相對較少(生物破乳菌菌種單一)，且破乳效能低(破乳能力低于50%)，導致此現(xiàn)象的原因主要有，破乳菌菌源地的選取不當;篩選技術滯后，篩選方法針對性不強，手段單一;篩菌過程復雜，耗時過長(初篩破乳菌時間大于3個月)，篩選效率低，僅為20%～50%。

　　發(fā)明內(nèi)容

　　本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有生物破乳菌破乳效能低，篩選技術滯后，篩選方法針對性差、操作復雜、時間長、篩選效率低的問題，而提供的一種從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法。

　　從活性污泥中快速篩選生物破乳菌的方法按以下步驟進行：一、向裝有150ml液體無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中接種活性污泥，在溫度為28～30℃、搖床轉數(shù)為140r/min的條件下培養(yǎng)7d，得富集菌液，然后轉接到新鮮的液體無機鹽培養(yǎng)基中，在溫度為28～30℃、搖床轉數(shù)為140r/min的條件下培養(yǎng)7d，重復轉接3次，得菌液;二、采用藍膠平板培養(yǎng)基或油平板培養(yǎng)基對菌液進行劃線分離培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為倒置于28～30℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h，然后挑取陽性單菌落進行劃線純化培養(yǎng)，直至得到菌落及菌體形態(tài)一致的菌株;三、將菌株接種于裝有100ml液體無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為30℃、搖床轉數(shù)為140r/min的條件下培養(yǎng)3d，得全培養(yǎng)液;四、將0.2ml經(jīng)過油紅O染色的煤油滴加到有30ml蒸餾水且直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，煤油膜鋪開穩(wěn)定后，再向煤油膜表面滴加20μl全培養(yǎng)液，靜止30s后測定排開油圈的直徑，選取直徑d≥3.0cm的菌株;五、將步驟四中所得菌株接種于裝有100ml液體無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為30℃、搖床轉數(shù)為140r/min的條件下培養(yǎng)3d，得全培養(yǎng)液;六、向裝有5mLO/W型乳狀液的磨口具塞比色管中加入2mL步驟五中所得全培養(yǎng)液，震蕩后靜止，在室溫下進行破乳，24h后選取排油率≥50%的菌株，即完成從活性污泥中快速篩選生物破乳菌;其中步驟一中活性污泥按體積比為25%的量接種。

　　本發(fā)明針對破乳菌的自身特點，提高富集培養(yǎng)的選擇性和針對性，將生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選方法與破乳試驗相結合，建立一套高效、簡單、周期短的快速篩選系統(tǒng)，用于曝氣池活性污泥中具有破乳能力菌株的有效篩選，可得到多種具有高效破乳能力的菌株，對豐富高效破乳菌的菌種資源以及今后大規(guī)模生物破乳劑生產(chǎn)所需工程菌的培育均具有深遠的意義;利用具有明確目的性的菌株識別方法替代傳統(tǒng)的分離純化手段，將初篩破乳菌時間從大于3個月降低至1個月，極大縮短了冗長的篩菌周期;并保證活性污泥中破乳菌的篩出率可達到100%，明顯提高篩菌效率;同時解決了以往所篩出的目的菌株破乳能力低的問題，此方法更容易獲得破乳能力高于50%的菌株，進一步馴化培養(yǎng)則可得到破乳能力高于80%的高效菌株;除此以外，該方法還具有針對性強，方法靈活，操作簡單易掌握的優(yōu)點。