申請日2010.06.11

　　公開(公告)日2011.01.12

　　IPC分類號C12N15/62; C12N1/19; C12N9/20; C12N15/81

　　摘要

　　本發(fā)明提出了一種用于含油脂污水處理的全細胞脂肪酶制劑的構(gòu)建方法，主要是針對含油脂污水中油脂的降解，克隆高效降解脂肪酶基因，將高水解活性的脂肪酶展示表達在解脂耶氏酵母細胞表面得到全細胞脂肪酶制劑。該制劑以產(chǎn)脂肪酶微生物的形式直接加入活性污泥中，進行含油脂污水的處理。這種全細胞脂肪酶制劑可以避免直接使用脂肪酶帶來的酶固定化成本和添加預處理工藝流程的問題，有效解決了單一使用脂肪酶的高成本問題和單一使用產(chǎn)脂肪酶微生物的低效性問題，極大的提高產(chǎn)脂肪酶微生物在活性污泥法處理含油脂污水中的效率。該全細胞脂肪酶制劑還可以應用于油脂污染土壤的生態(tài)修復。

　　摘要附圖

 

　　權(quán)利要求書

　　1.一種用于含油脂污水處理的全細胞脂肪酶制劑的構(gòu)建方法，主要是針對含油脂污水中油脂的降解，克隆高效降解脂肪酶基因，將高水解活性的脂肪酶展示表達在解脂耶氏酵母細胞表面得到全細胞脂肪酶制劑，其特征在于具體方案如下：

　　1)、參照Flo膜蛋白的基因編碼序列(GenBank accession No.NC001133)設(shè)計Flo基因的克隆引物：Flo-F-Sfi I和Flo-R-EcoR I。以S.cerevisia的基因組DNA為模板PCR擴增得到分別帶有Sfi I和EcoR I限制性酶切位點的Flo基因片段;

　　2)、根據(jù)脂肪酶基因LIPY7的序列設(shè)計下列引物：LIPY7f-Mun I和LIPY7r-XbaI。利用PCR擴增得到分別帶有Mun I和Xba I限制性酶切位點的LIPY7基因片段，將Flo基因片段用EcoR I消化、LIPY7基因片段用Mun I消化，得到相同粘性末端的基因片段，其中EcoR I與Mun I互為同尾酶，在T4DNA連接酶的作用下，將用EcoR I消化的Flo基因片段與用MunI消化的LIPY7基因片段連接，以Flo-F-Sfi I為正向引物、LIPY7r-Xba I為反向引物，以連接產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，得到Flo-LIPY7融合基因片段，且兩端分別帶有Sfi I和XbaI限制性酶切位點，將此融合基因分別用Sfi I和Xba I消化，并與經(jīng)Sfi I和Xba I消化的表達載體pINA1296連接，得到脂肪酶LIPY7在解脂耶氏酵母中展示表達的載體pINA1296-F-LIPY7;

　　3)、將重組質(zhì)粒pINA1296-F-LIPY7經(jīng)Not I線性化后，轉(zhuǎn)化Yarrowia lipolytica，經(jīng)間接免疫熒光檢測，證實脂肪酶LIPY7展示表達在Yarrowia lipolytica細胞表面，得到脂肪酶LIPY7的全細胞脂肪酶制劑。

　　說明書

　　一種用于含油脂污水處理的全細胞脂肪酶制劑的構(gòu)建方法

　　技術(shù)領(lǐng)域

　　本發(fā)明涉及應用于含油脂污水處理的活性污泥中微生物改造的技術(shù)方法，屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域。

　　背景技術(shù)

　　隨著人民生活水平的不斷提高，糧油工業(yè)也得到了迅猛的發(fā)展。21世紀初，僅我國具有一定規(guī)模的浸出油廠就已經(jīng)達到2,000多家，并且生產(chǎn)規(guī)模還在逐年增加。隨之而來的高濃度油脂廢水的排放量也在急劇增加。石油加工業(yè)、飯店餐飲業(yè)以及生活污水的排放，更進一步加劇了含油脂廢水的泛濫，對環(huán)境和人類的健康造成極大的危害。

　　解決含油脂廢水污染問題的關(guān)鍵集中在污水的處理技術(shù)及其效果上。目前采用的主要有物理法、化學法和生物法。物理法處理含油脂的污水，主要是利用油脂和水的理化性質(zhì)不同實現(xiàn)油水分離，從而達到除去油脂的效果，物理法可以在某種程度上回收利用部分油脂，但對污水處理而言，油脂去除率低、能耗高;化學法處理含油污水，主要是通過添加化學試劑對油脂進行降解，從而達到除去油脂的目的，該方法往往需要添加一些化學試劑，不僅能耗高，而且容易造成化學試劑的二次污染等問題;生物法處理含油脂污水，主要是通過微生物的降解作用對油脂分解，從而達到除去油脂的目的。生物法已經(jīng)逐步替代了常規(guī)的物理、化學方法，成為當今世界應對含油脂污水的主要方法。

　　生物法中以脂肪酶制劑進行預處理的應用較為廣泛[Jeganathan J，et al.Hydrolyticpretreatment of oily wastewater by immobilized lipase.J Hazard Mater.2007，145(1-2)127-135.]，也有利用產(chǎn)脂肪酶微生物直接應用于含油脂污水處理的報道[Chigusa K，et al.Treatment of wastewater from oil manufacturing plant by yeasts.War.Sci.Technol.，1996，34(1)：51-58]。脂肪酶制劑應用于含油脂污水的處理，是在污水進行活性污泥法處理前，通過脂肪酶對污水中油脂的水解作用，達到分解污水中油脂為小分子有機物的目的。這樣不僅需要額外添加相應的設(shè)備，增加了污水處理的工藝流程，而且所用的脂肪酶必須經(jīng)過固定化以改善其酶學性質(zhì)，這些必然使得污水處理的成本大大增加。將產(chǎn)脂肪酶微生物直接加入活性污泥中，可以省去添加設(shè)備和增加工藝流程的麻煩，但由于一般產(chǎn)脂肪酶微生物的脂肪酶活性低、性質(zhì)不佳等原因，以至污水處理中的油脂去除效率低，污水處理周期長。

　　發(fā)明內(nèi)容

　　本發(fā)明的目的是提出一種高活力油脂污水處理的全細胞脂肪酶制劑的構(gòu)建方法。針對污水中的高濃度油脂的降解，將高活性的脂肪酶展示表達在產(chǎn)脂肪酶的微生物細胞表面，以提高產(chǎn)脂肪酶微生物中脂肪酶的活性，使脂肪酶在對污水中油脂降解的高效性與產(chǎn)脂肪酶微生物應用的便捷性結(jié)合，解決了單一使用脂肪酶的高成本問題和單一使用產(chǎn)脂肪酶微生物的低效性問題，從而使活性污泥法處理含油脂污水的效率得到極大提高。本方法亦可應用于針對污水中其他難以降解的成分(如烴類、苯環(huán)類化合物等)對活性污泥中其他微生物進行改造。

　　以下是實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)路線：

　　1、針對含油脂污水中油脂的降解，克隆高效降解脂肪酶基因。

　　根據(jù)已報道的解脂耶氏酵母中脂肪酶基因的序列分別設(shè)計脂肪酶基因克隆的引物對，提取解脂耶氏酵母的基因組DNA為模板，進行PCR擴增得到脂肪酶基因片段(如圖1)。經(jīng)測序分析后進行表達，得到高活性的脂肪酶。

　　2、將高活性的脂肪酶在活性污泥中的微生物或適合在活性污泥中生長繁殖的微生物細胞表面進行展示表達，得到全細胞酶制劑。

　　本發(fā)明將高水解活性的脂肪酶展示表達在Yarrowia lipolytica(解脂耶氏酵母)細胞表面得到全細胞脂肪酶制劑。

　　具體方案如下：

　　1)參照Flo膜蛋白的基因編碼序列(GenBank accession No.NC001133)設(shè)計Flo基因的克隆引物：Flo-F-Sfi I和Flo-R-EcoR I。以S.cerevisia(釀酒酵母)的基因組DNA為模板PCR擴增得到分別帶有Sfi I和EcoR I限制性酶切位點的Flo基因片段。

　　2)根據(jù)脂肪酶基因LIPY7的序列設(shè)計下列引物：LIPY7f-Mun I和LIPY7r-XbaI。利用PCR擴增得到分別帶有Mun I和Xba I限制性酶切位點的LIPY7基因片段。將Flo基因片段用EcoR I消化、LIPY7基因片段用Mun I消化，得到相同粘性末端的基因片段(EcoR I與Mun I互為同尾酶)。在T4DNA連接酶的作用下，將用EcoR I消化的Flo基因片段與用MunI消化的LIPY7基因片段連接。以Flo-F-Sfi I為正向引物、LIPY7r-Xba I為反向引物，以連接產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，得到Flo-LIPY7融合基因片段，且兩端分別帶有Sfi I和XbaI限制性酶切位點。將此融合基因分別用Sfi I和Xba I消化，并與經(jīng)Sfi I和Xba I消化的表達載體pINA1296連接，得到脂肪酶LIPY7在解脂耶氏酵母中展示表達的載體pINA1296-F-LIPY7(如圖2)。

　　3)將重組質(zhì)粒pINA1296-F-LIPY7經(jīng)Not I線性化后，轉(zhuǎn)化Yarrowia lipolytica，經(jīng)間接免疫熒光檢測，證實脂肪酶LIPY7展示表達在Yarrowia lipolytica細胞表面(如圖3)，得到脂肪酶LIPY7的全細胞脂肪酶(菌)制劑，命名為YL-LIPY7。

　　3、全細胞脂肪酶制劑在含油脂污水處理中的應用：將全細胞脂肪酶制劑添加在活性污 泥中進行含油脂污水處理，分析驗證其對油脂污水的處理效率。

　　將該全細胞脂肪酶制劑直接添加在序列間歇式活性污泥法(SBR工藝)的活性污泥中進行活性污泥微生物的同步馴化，通過活性污泥中生物相的觀測，證實該全細胞脂肪酶制劑穩(wěn)定存在于活性污泥中。實驗證實該全細胞脂肪酶制劑可有效提高含油脂污水處理的效率。該全細胞脂肪酶制劑在生物膜法污水處理工藝中也證實對含油脂污水處理有效。

　　本發(fā)明利用生物工程技術(shù)將高活性的脂肪酶展示表達在產(chǎn)脂肪酶的微生物細胞表面，形成高活力全細胞脂肪酶制劑。該制劑以產(chǎn)脂肪酶微生物的形式直接加入活性污泥中，進行含油脂污水的處理。這種全細胞脂肪酶制劑可以避免直接使用脂肪酶帶來的酶固定化成本和添加預處理工藝流程的問題，有效解決了單一使用脂肪酶的高成本問題和單一使用產(chǎn)脂肪酶微生物的低效性問題，極大的提高產(chǎn)脂肪酶微生物在活性污泥法處理含油脂污水中的效率。該全細胞脂肪酶制劑還可以應用于油脂污染土壤的生態(tài)修復。