申請(qǐng)日2015.07.22

　　公開(公告)日2016.01.20

　　IPC分類號(hào)G01N33/18

　　摘要

　　本方法公開了一種測(cè)定含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法，包括以下步驟：1)先測(cè)定水中游離余氯的量。2)根據(jù)游離余氯的值初步判定是否有大腸桿菌殘留的可能。3)向大腸桿菌有可能殘留的水樣中加入一定量濃度為0.11g/L的硫代硫酸鈉還原游離余氯。4)對(duì)水樣進(jìn)行增菌、分離、生化鑒定，符合其特征的報(bào)告大腸桿菌檢出。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單、易于操作，污染小，準(zhǔn)確度高、干擾小。

　　權(quán)利要求書

　　1.一種測(cè)定合氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法，其特征包括如下步驟：

　　(1)對(duì)樣品先進(jìn)行游離余氯的測(cè)定;

　　(2)根據(jù)游離余氯的值是否達(dá)到臨界點(diǎn)來(lái)判定是否有大腸桿菌殘留;

　　(3)如果游離余氯的值小于臨界點(diǎn)，則向每升水樣中加入1mL濃度為0.11g/L的硫代硫酸鈉溶液，還原游離余氯;

　　(4)取水樣10mL于10mL雙倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，平行接種五份，36℃±1℃培養(yǎng)24h ±2h，如未產(chǎn)酸產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)24h，對(duì)產(chǎn)酸產(chǎn)氣管劃線分離于伊紅美藍(lán)瓊脂平板， 36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，挑取典型和可疑菌落進(jìn)行IMViC(用來(lái)測(cè)定菌的生化特征的4個(gè)實(shí)驗(yàn))生化鑒定和革蘭氏染色，符合其特征的判定大腸桿菌檢出;

　　(5)大腸桿菌殘留的臨界點(diǎn)是游離余氯的量為165mg/L，本處的臨界點(diǎn)指消毒時(shí)間大于 2h，水樣中菌落總數(shù)≤108cfu/mL;游離余氯的量大于165mg/L時(shí)，底定性檢測(cè)大腸桿菌無(wú)殘留。

　　2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)每升水樣中加入1mL濃度為0.11g/L的硫代硫酸鈉溶液還原游離余氯。

　　說(shuō)明書

　　一種測(cè)定含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法

　　【技術(shù)領(lǐng)域】

　　本發(fā)明涉及水質(zhì)生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及測(cè)定含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法。

　　【背景技術(shù)】

　　大腸桿菌(dachangganjun)(Escherichiacoli)細(xì)菌門。細(xì)胞桿狀，直徑約1微米，長(zhǎng)約2微米，兩端鈍圓，周身具鞭毛，可運(yùn)動(dòng)。革蘭氏染色陰性，不形成芽孢。菌落圓形，白色或黃白色，光滑而具閃光，低平或微凸起，邊緣整齊。最適條件下培養(yǎng)20分鐘可繁殖 1代。大腸桿菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)普遍存在的細(xì)菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，可能在腸中對(duì)合成維生素K起作用。但它侵入人體一些部位時(shí)，可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等。人在感染大腸桿菌后的癥狀為胃痛、嘔吐、腹瀉和發(fā)熱。感染可能是致命性的，尤其是對(duì)孩子及老人。由大腸桿菌導(dǎo)致的疾�。阂皇悄c道外感染。多為內(nèi)源性感染，以泌尿系感染為主;二是急性腹瀉。某些血清型大腸桿菌能引起人類腹瀉。

　　大腸桿菌(escherichiacoli)一般不致病。但致病性大腸菌株能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細(xì)胞，具有痢疾桿菌樣致病力。已知大腸桿菌有菌體(O)抗原170 種，表面(K)抗原近103種，鞭毛(H)抗原60種，因而構(gòu)成了許多血清型。在引起人畜腸道疾病的血清型中，有腸致病性大腸桿菌(簡(jiǎn)稱EPEC)、腸毒素性大腸桿菌(簡(jiǎn)稱ETEC) 和腸侵襲性大腸桿菌(間稱EIEC)等之分，多數(shù)腸毒素性大腸桿菌都帶有F抗原。在170 種“O”型抗原血清型中約1/2左右對(duì)禽有致病性，但最多的是O1、O2、O78、O35四個(gè)血清型。另有產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，其腸毒素有耐熱性及不耐熱性兩種，均能使人致病。腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7感染性腹瀉是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病，它除引起腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性小板減少性紫癲(TTP) 等嚴(yán)重的并發(fā)癥。后者病情兇險(xiǎn)，病死率高。

　　依據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》和《消毒管理辦法》(衛(wèi)生部第27號(hào)令)的相關(guān)規(guī)定，生活及醫(yī)療污水必須經(jīng)過(guò)無(wú)害化處理，才可以排放，其中常用的消毒處理方法有：加氯消毒，臭氧法消毒，次氯酸鈉法、二氧化氯法消毒等，而這些廢水、污水是大腸桿菌很重要的一個(gè)污染源，雖然經(jīng)過(guò)消毒，但由于消毒的效果與水中菌液的濃度、作用時(shí)間、消毒劑的含量都有著重要的關(guān)系，即便是經(jīng)過(guò)消毒的廢水，也可能有大腸桿菌的殘留，對(duì)于這些污水消毒處理的效果，有關(guān)單位會(huì)定期對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)此有很大的檢測(cè)市場(chǎng)需求，而我國(guó)目前的水質(zhì)檢測(cè)方法中只有生活飲用水GB5750.12-2006中有大腸桿菌的相關(guān)檢測(cè)，環(huán)保部標(biāo)準(zhǔn)HJ/T347-2007《水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法和濾膜法(試行)》中檢測(cè)的糞大腸菌群，廢水中未發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的相關(guān)檢測(cè)方法。由于含氯消毒劑有強(qiáng)氧化性，如果參照生活飲用水的檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定含氯消毒廢水中大腸桿菌，會(huì)使乳糖膽鹽培養(yǎng)液中的指示劑脫色，致使實(shí)驗(yàn)無(wú)法操作，因此，建立一個(gè)準(zhǔn)確可行的含氯消毒廢水大腸桿菌的測(cè)定方法非常必要。

　　本發(fā)明建立了一種檢測(cè)含氯消毒廢水中殘留的大腸桿菌新方法，雖然消毒劑對(duì)大腸桿菌的消毒效果很好，但由于其濃度、作用時(shí)間、菌的濃度都與消毒效果息息相關(guān)。本方法采用測(cè)定游離余氯的量來(lái)初步判定是否有大腸桿菌殘留，再對(duì)廢水中的余氯進(jìn)行還原來(lái)測(cè)定大腸桿菌殘留。方法簡(jiǎn)單，易于操作，污染小，準(zhǔn)確度高。

　　【發(fā)明內(nèi)容】

　　本發(fā)明的目的是解決含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留測(cè)定的問(wèn)題，用于檢測(cè)消毒廢水中大腸桿菌的殘留，避免大腸桿菌對(duì)環(huán)境水質(zhì)的生物污染，本方法成本低，污染小，準(zhǔn)確度高，能夠滿足檢測(cè)需求。

　　本發(fā)明公開了一種測(cè)定含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法，具體采用下述技術(shù)方案：

　　(1)對(duì)樣品先進(jìn)行游離余氯的測(cè)定，方法參照GB/T5750.11-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法消毒劑指標(biāo)》。

　　(2)根據(jù)游離余氯的值判定是否有大腸桿菌殘留可能。當(dāng)游離余氯的含量小于等于 165mg/L時(shí)，大腸桿菌可能殘留，需要進(jìn)一步檢測(cè)來(lái)確證。

　　(3)如果大腸桿菌有可能殘留，向每升水樣中加入1mL濃度為0.11g/L的硫代硫酸鈉溶液，還原游離余氯。

　　(4)取水樣10mL于10mL雙倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，平行接種5份，36℃±1℃培養(yǎng)24h ±2h，如未產(chǎn)酸產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)24h，對(duì)產(chǎn)酸產(chǎn)氣管劃線分離于伊紅美藍(lán)瓊脂平板， 36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，挑取典型和可疑菌落接種于IMViC(用來(lái)測(cè)定大腸桿菌的生化特征的4個(gè)實(shí)驗(yàn)，參見GB4789.38-2012《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸桿菌計(jì)數(shù)》)進(jìn)行生化鑒定和革蘭氏染色，符合其特征的判定大腸桿菌檢出。

　　(5)當(dāng)游離余氯的量為165mg/L時(shí)是大腸桿菌殘留的臨界點(diǎn)，本處的臨界點(diǎn)指水樣的菌落總數(shù)為≤108cfu/mL，按《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版增補(bǔ)版)5.2.4方法操作，消毒時(shí)間大于2h。大于此值時(shí)，定性檢測(cè)大腸桿菌無(wú)殘留。

　　【具體實(shí)施方式】

　　下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

　　實(shí)施例1：

　　分析步驟：取營(yíng)養(yǎng)肉湯300mL于無(wú)菌罐中，制備20罐，121℃滅菌15min，向每個(gè)無(wú)菌罐中加入一環(huán)(接種環(huán))大腸埃希氏菌液，36℃培養(yǎng)24h后，對(duì)每個(gè)無(wú)菌罐進(jìn)行編號(hào)，分別加入10%次氯酸鈉溶液，如下表所示：

　　將所有無(wú)菌罐放置2小時(shí)(消毒劑作用時(shí)間)后分別無(wú)菌取2mL用于測(cè)定游離余氯的值參照(GB/T5750.11-2006)，同時(shí)無(wú)菌取10mL于10mL雙倍乳糖蛋白胨中，平行接種5份， 36℃培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，未產(chǎn)酸產(chǎn)氣者繼續(xù)培養(yǎng)24h，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣管挑取一環(huán)劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36℃培養(yǎng)24h，觀察有無(wú)典型菌落，挑取單個(gè)典型和可疑菌落接種于IMViC進(jìn)行生化鑒定和革蘭氏染色，36℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，大腸桿菌的生化特征為靛基質(zhì)陽(yáng)性、甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)陰性、檸檬酸鹽試驗(yàn)陰性。具體結(jié)果如下表。

　　結(jié)果分析：當(dāng)游離余氯的量為165mg/L時(shí)是大腸桿菌殘留的臨界點(diǎn)，本處的臨界點(diǎn)指水樣的菌落總數(shù)為≤108cfu/mL，按《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版增補(bǔ)版)5.2.4方法操作，消毒時(shí)間大于2h。大于此值時(shí)，定性檢測(cè)大腸桿菌無(wú)殘留。

　　實(shí)施例2：

　　分析步驟：無(wú)菌取經(jīng)含氯消毒過(guò)的生活污水2mL測(cè)定游離余氯的值為164mg/L。判定有大腸桿菌殘留，向1L水樣中加入0.11g/L的硫代硫酸鈉溶液1mL，取10mL于雙倍乳糖蛋白胨中，同時(shí)平行接種5份，36℃培養(yǎng)24h后產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，挑取一環(huán)劃線于伊紅美藍(lán)平板上， 36℃培養(yǎng)24h，觀察有黑色中心，帶金屬光澤的菌落，挑取5個(gè)單菌落接種于IMViC(用來(lái)測(cè)定大腸桿菌的生化特征的4個(gè)實(shí)驗(yàn))進(jìn)行生化鑒定和革蘭氏染色，36℃培養(yǎng)24h后，靛基質(zhì)陽(yáng)性、甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)陰性、檸檬酸鹽試驗(yàn)陰性，革蘭氏染色為陰性無(wú)芽孢桿菌。符合大腸桿菌的特征，判定水樣中大腸桿菌檢出。

　　上述實(shí)施例僅供說(shuō)明本發(fā)明之用，而并非是對(duì)本發(fā)明專利的限制;應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍;因此，凡跟本發(fā)明權(quán)利要求范圍所做的變化與修飾，均應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求的覆蓋范圍。