再生水回用是解決現(xiàn)代城市缺水問題的有效途徑之一。城市污水處理廠的二級出水中仍含有一定濃度的氮和磷，若直接用作城市景觀水體補水極易引發(fā)水體富營養(yǎng)化。若再生水用于補充地下水，則可能造成地下水硝酸鹽污染。過量的硝酸鹽進入人體會導致輸氧的血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，喪失攜氧能力，嚴重甚至會導致窒息。傳統(tǒng)二級處理出水C/N極低，需要投加外部碳源以實現(xiàn)進一步脫氮，此過程不僅導致處理成本增加，同時還存在碳源過量的二次污染風險。
硫自養(yǎng)反硝化生物濾池因為成本低，且反應過程中無需投加碳源等優(yōu)點而被廣泛關注，其脫氮原理主要是生物膜上的微生物在缺氧環(huán)境下以還原態(tài)硫為電子供體對硝酸鹽進行反硝化，因此濾池正常運行的前提是濾料表面生物膜的培養(yǎng)和形成。目前，反硝化脫硫菌（NR-SOB）的應用研究主要集中于脫氮硫桿菌，但該菌生長緩慢，且對溫度、鹽度的耐受性不強，實際應用潛力有限。可見，合適的掛膜啟動方式對于硫自養(yǎng)反硝化技術的工程應用具有重要意義。
當前硫自養(yǎng)反硝化的脫氮負荷較低，一般在0.12~0.60kg/（m³·d）左右。此外，硫自養(yǎng)反硝化微生物易受到進水水質等環(huán)境因素影響，造成出水水質波動。硫源對于反硝化脫氮效果也有較大影響，升華硫和硫代硫酸鈉為硫源的脫氮效果優(yōu)于生物硫。但受制于成本及危險化學品規(guī)定限制，純硫磺濾料無法在工程中直接應用。所以筆者采用新開發(fā)的含硫復合填料進行實驗。
目前，針對硫自養(yǎng)反硝化生物濾池合適的掛膜啟動方式還未見詳細研究報道。以北京某再生水廠二沉池出水作為實驗進水，對比了變?yōu)V速接種掛膜、固定濾速自然掛膜和變?yōu)V速自然掛膜三種啟動方式對硫自養(yǎng)反硝化生物濾池脫氮效果穩(wěn)定性的影響，同時考察了反應過程中DO、pH和SO42-等參數(shù)的變化情況，從而確定適宜的掛膜方法。結合高通量測序技術和硝酸鹽氮的去除機制，探討不同掛膜條件下硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)中的微生物群落結構，以期為復合硫填料反硝化應用于工程的掛膜啟動提供參考。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置
反應器由4組相同的濾柱組成（如圖1所示），濾柱直徑為150mm、總高為1000mm，其中，底部承托層為150mm高的礫石（直徑為30～50mm），濾料層高為350mm。濾料采用含硫復合濾料。濾料堆積密度為0.8～1.1g/cm3，粒徑為5～15mm，比表面積為30.1m2/g，填充體積為6180cm3。濾池采用上向流設計，二沉池出水通過蠕動泵從底部進水口進入，經(jīng)過生物濾池填料凈化后從上部的出水口排出。
1.2 接種污泥和原水水質
接種污泥取自北京某再生水廠A2/O工藝的二沉池回流污泥，懸浮固體（MLSS）濃度為8000mg/L。所用原水為二沉池出水，NO3--N、NO2--N、SO42-、DO分別為8.92~16.27、0~0.5、68.62~136.51、1.91~7.97mg/L，濁度為0.56~2.21NTU，pH為6.74~8.07。
1.3 實驗方法
反應器的啟動分為三種方式：固定濾速自然掛膜、變?yōu)V速自然掛膜和變?yōu)V速接種掛膜，氮去除量達到10mg/L時調整空床停留時間（EBCT），由120min逐漸縮短至20min，1#、2#、3#不接種污泥，4#接種1L二沉池回流污泥。其中，1#、2#采用固定濾速自然掛膜，EBCT分別為30、20min，相應的進水氮負荷為0.58、0.86kg/（m³·d）；3#采用變?yōu)V速自然掛膜，EBCT依次為120、60、45、40、30min，對應的進水氮負荷為0.14、0.29、0.38、0.43、0.58kg/（m³·d）；4#采用變?yōu)V速接種掛膜，EBCT依次為120、60、45、40、30、20min，對應的進水氮負荷為0.14、0.29、0.38、0.43、0.58、0.86kg/（m³·d）。
1.4 分析方法
水樣經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進行水質分析，NO3--N、NO2--N、SO42-：賽默飛ICS-1100離子色譜，溫度、pH、DO：WTW/Multi3420測定儀。1.5高通量測序分析取北京市某再生水廠二沉池回流污泥和穩(wěn)定運行階段的掛膜濾料（變?yōu)V速接種掛膜和變?yōu)V速自然掛膜）送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序分析。濾料取自濾料層的中部，對樣品16SrRNA的V3-V4區(qū)進行擴增，所用引物為338F與806R。
2、結果與討論
2.1 固定濾速自然掛膜
分別以EBCT為30、20min啟動反應器，分析運行25d的NO3--N去除情況和NO2--N的生成情況，結果見圖2。兩種情況下的平均脫氮負荷分別為0.37、0.35kg/（m³·d），平均氮去除率分別僅為65.59%和41.48%，無法達到相關研究0.75kg/（m³·d）的脫氮負荷。在EBCT=30min的情況運行到第8～15天時，平均氮去除量為10.1mg/L，說明反硝化菌在掛膜初期也有脫氮效果。在EBCT=20min下運行，系統(tǒng)僅在第8天和15天出現(xiàn)氮去除量大于10mg/L的現(xiàn)象。兩種情況下都存在出水水質不穩(wěn)定和亞硝酸鹽積累的現(xiàn)象，說明在自然掛膜初期反硝化菌的脫氮性能極易受到環(huán)境因素影響，需要合適的恒化培養(yǎng)環(huán)境。
2.2 變?yōu)V速自然掛膜
2.2.1 變?yōu)V速自然掛膜啟動分析
在整個變?yōu)V速自然掛膜階段，在1～16、17～22、23～51、52～65、66～104和105～120d，調整EBCT分別為120、60、45、40、30、20min（即第一～六階段），運行結果見圖3。在每個時間段，出水NO3--N濃度先升高后降低，出水NO2--N濃度在調整初期會出現(xiàn)部分積累，最大積累量為5.92mg/L。
在第一階段，出水NO3--N從12.70mg/L逐漸降低至2.12mg/L，但是在第7天升至7.63mg/L，說明在掛膜初期脫氮效果不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響。第二階段的氮去除量有所增加，可穩(wěn)定在10mg/L以上且無NO2--N積累，平均氮去除率為95.22%，表明硫桿菌等脫氮菌的生物量比上一階段有所增加，氮去除量主要受制于底物濃度。
在第三和第四階段，氮去除量隨進水水質波動，掛膜培養(yǎng)時間分別需要29d和14d，EBCT為40min情況下的微生物培養(yǎng)時間短于EBCT為45min的，分析原因可能是EBCT降低，單位時間進水硝酸鹽量增加。
在第五階段，調整流速初期出現(xiàn)NO2--N積累，7d后達到最大值5.92mg/L，隨后逐漸降低，24d后完全消失。運行25d后，氮去除量連續(xù)3d可達10mg/L以上，隨后有所降低。
在第六階段，進水水質波動較小，進水NO3--N最大變化量為3.8mg/L，進水NO2--N均小于0.01mg/L，平均氮去除量為10.21mg/L，氮去除率達到90%以上，其間達到最大脫氮負荷即0.81kg/（m³·d）。
2.2.2 不同EBCT的脫氮效果比較
根據(jù)掛膜后穩(wěn)定運行7d的進出水水質數(shù)據(jù)，計算不同空床停留時間下的平均氮去除量和脫氮負荷，結果見圖4。
在EBCT為120、60、45、30、20min的條件下，對應的平均氮去除量分別為11.27、10.97、8.69、9.63、9.76mg/L，在空床停留時間縮短并培養(yǎng)穩(wěn)定后，氮去除量的變化不明顯。在EBCT=45min時，脫氮負荷增加量不大，這可能是由于實驗期間水溫變化使氮去除量降低導致的。各空床停留時間下的脫氮負荷分別為0.14、0.26、0.28、0.46、0.71kg/（m³·d），脫氮負荷隨空床停留時間縮短、流速增大而逐漸增加。
2.3 變?yōu)V速下兩種掛膜方式的脫氮效果比較
在變?yōu)V速接種掛膜的情況下（見圖5），分別在第9、26和66天調整空床停留時間，最終在EBCT=30min時平均氮去除量為7.88mg/L，最大脫氮負荷為0.52kg/（m³·d），平均氮去除率為66.86%。
對比接種掛膜（見圖5）和自然掛膜（見圖3）的脫氮效果，接種掛膜在初期可以較早地達到10mg/L的氮去除量，比自然掛膜早9d，說明污泥中存在好氧菌，能更快地消耗進水溶解氧，為上層濾料微生物提供缺氧條件。后續(xù)調整EBCT的時間接近，表明是否接種污泥對后期生物膜的生長速率沒有影響。在EBCT為30min的運行工況下，接種掛膜的氮去除量低于自然掛膜，且在進水水質相對穩(wěn)定的條件下，脫氮效果也不如自然掛膜穩(wěn)定。
對比不同空床停留時間下亞硝酸鹽積累情況，改變空床停留時間后接種掛膜和自然掛膜均會出現(xiàn)亞硝酸鹽積累的現(xiàn)象，說明在提高進水負荷以后微生物的生長隨著底物濃度的增加產(chǎn)生變化。硝酸鹽還原酶Nar的合成速率可能高于亞硝酸鹽還原酶Nir，導致Nar對電子的競爭能力高于Nir，在有限的空床停留時間內亞硝酸鹽還原不徹底，故出現(xiàn)出水亞硝酸鹽積累。隨著微生物和酶逐漸培養(yǎng)成熟，完成亞硝酸鹽還原過程，亞硝酸鹽含量逐漸降低。在EBCT為45min時，兩種掛膜方式的亞硝酸鹽消失時間相同，亞硝酸鹽積累量小于1mg/L所需的時間均為10d；在EBCT為30min時，自然掛膜的亞硝酸鹽消失時間比接種掛膜晚3d。
劉玲花等接種純脫氮硫桿菌株去除地下水中的硝酸鹽，發(fā)現(xiàn)當濾料中同時存在脫氮硫桿菌和異養(yǎng)反硝化菌時，接種純脫氮硫桿菌株意義不大，控制合適的pH、溫度和停留時間即可，本實驗結果進一步證明了此結論。
2.4 運行參數(shù)對脫氮效果的影響
2.4.1 DO對脫氮效率的影響
DO對反硝化有很大影響，主要是由于DO和NOx--N競爭電子供體。在氧分壓較低的情況下，反硝化作用為微生物的生長提供替代產(chǎn)能途徑；氧分壓過高會抑制硝酸鹽還原酶的合成及活性。相關研究認為脫氮硫桿菌是一類兼性厭氧菌，在好氧條件下其優(yōu)先利用氧為電子受體，反硝化過程受到抑制；在缺氧或厭氧條件下，脫氮硫桿菌利用硝酸鹽作為電子受體，完成生物反硝化過程。
自然掛膜反應器出水口的平均DO為0.19mg/L（見圖6），僅在啟動初期出現(xiàn)較高的DO，掛膜階段的進水DO平均為5.25mg/L，掛膜初期的氮去除量較低，出水DO剩余3.24mg/L，說明部分硫桿菌在好氧情況下利用氧為電子受體抑制了反硝化過程。在掛膜后期，雖然進水DO均大于6mg/L，但依然具有明顯的脫氮效果，表明反應器下層填料生物膜中存在好氧菌，先消耗了進水中的DO，為上層的生物膜創(chuàng)造了缺氧環(huán)境。
2.4.2 pH變化
考察了變?yōu)V速自然掛膜運行周期內NO3--N去除量與pH變化量的關系，結果見圖7。pH變化量隨NO3--N去除量的增大而增加。pH會改變底物和菌體酶蛋白的帶電狀態(tài)，從而影響細菌對營養(yǎng)物質的吸收以及代謝過程中酶的活性。合適的進水pH可保證生物自養(yǎng)反硝化所需要的還原性環(huán)境，根據(jù)其反應方程式，自養(yǎng)反硝化1mgNO3--N需要消耗4.57mg堿度（以CaCO3計）。
pH變化量不能完全反映堿度變化，但有學者發(fā)現(xiàn)當pH為6.5~8.0時，NO3--N去除速率均在3.1mg/（L·h）以上，硫桿菌能取得較為滿意的反硝化效果。本實驗進水pH范圍為6.74~8.07，平均NO3--N去除速率為28.92mg/（L·h），表明該再生水廠二沉池出水滿足自養(yǎng)反硝化過程中的堿度消耗，無需控制進水pH。
2.4.3 氮去除量對硫酸鹽濃度的影響
硫自養(yǎng)反硝化過程中硫單質提供電子供體被氧化成SO42-，由于市政污水排放標準對硫酸鹽濃度沒有具體要求，《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB5749—2022）要求SO42-不超過250mg/L，該裝置出水SO42-最大值為224.78mg/L，平均值為157.3mg/L，克服了一般硫自養(yǎng)反硝化出水SO42-過高的問題。圖8（a）反映了掛膜過程中去除單位無機氮產(chǎn)生SO42-量（SO42-/ΔTIN）的變化情況。參照硫自養(yǎng)反硝化反應方程式，SO42-/ΔTIN的理論值為7.54，實際平均值為9.42，說明反應器中主要進行的是硫自養(yǎng)反硝化過程。
由圖8（b）可知，掛膜過程中去除單位TIN產(chǎn)生的SO42-量并非完全與理論值相同，在第17～23、38～44、78～83、88～94、100~105天出現(xiàn)實際值低于理論值的現(xiàn)象，推測可能的原因有：反應器中存在異養(yǎng)反硝化；硫氧化不完全生成了副產(chǎn)物，比如SO32-、S2O32-等；硫酸鹽還原菌（SRB）利用水中的有機物將SO42-還原為S2-。在運行過程中也出現(xiàn)了高于理論值的現(xiàn)象，其主要出現(xiàn)在啟動初期和調整濾速后，分析原因可能為：進行不完全的反硝化，TIN去除量沒有增加，但該過程中消耗電子供體；一些好氧菌利用水中微量溶解氧將硫單質氧化為SO42-。
2.5 微生物群落結構解析
2.5.1 變?yōu)V速接種和自然掛膜的微生物群落
變?yōu)V速接種掛膜和自然掛膜兩種方式培養(yǎng)的生物膜中，在門水平上占比較多的為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycete），豐度分別為58.12%、9.98%、15.49%、3.41%和71.66%、14.64%、5.44%、2.51%，與前人研究的硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)微生物群落一致。
變形菌門中大部分微生物可以利用氫、氨、甲烷和揮發(fā)性脂肪酸等進行反硝化作用。綠彎菌門的某些菌屬被發(fā)現(xiàn)有異養(yǎng)特性，可利用系統(tǒng)中溶解性微生物產(chǎn)物作為碳源將NO3--N轉化為NO2--N，反映了NO3--N在反應器中的去除過程。擬桿菌門的部分微生物具有降解高分子化合物（纖維素、蛋白質和脂類等）為簡單有機物并還原NO3--N的能力，說明反應器中可能存在異養(yǎng)反硝化菌利用污泥中的內碳源進行協(xié)同反硝化，一定程度上解釋了SO42-的產(chǎn)生量低于理論值的現(xiàn)象。此外，酸桿菌門（Acidobacteriota）也被證明有脫氮基因（兩種方式下的豐度分別為2.24%和1.06%），具有相應的反硝化能力。
另外，在屬水平上，Dokdonella、Thiobacillus、Comamonadaceae、Terrimonas、SBR1031、Thermmonas、Ferritrophicum、Ferruginibacter、Xanthomonadaceae、A4b、others（豐度<1.0%都歸為others）的相對豐度分別為21.13%、10.94%、2.45%、2.82%、5.41%、2.66%、2.67%、1.26%、2.62%、2.57%、48.04%和31.49%、6.38%、6.82%、4.04%、1.43%、3.86%、3.66%、3.82%、2.48%、1.52%、34.49%。硫桿菌屬（Thiobacillus）是以還原態(tài)硫為電子供體還原NO3-、NO2-的專性化能自養(yǎng)菌，其相對豐度較大，說明系統(tǒng)內進行硫自養(yǎng)反硝化過程，和TIN去除量與SO42-產(chǎn)生量關系的分析結果一致。接種掛膜（10.94%）的硫桿菌屬占比高于自然掛膜（6.38%）。
孤島桿菌（Dokdonella）中部分微生物為嚴格異養(yǎng)和好氧菌，有學者曾在需要曝氣的同步硝化反硝化工藝中檢出，孤島桿菌的檢出驗證了濾池底部存在好氧菌消耗進水DO的猜想，自然掛膜中的孤島桿菌豐度高于接種掛膜，說明自然掛膜方式更易去除進水中的溶解氧，為硫桿菌創(chuàng)造缺氧環(huán)境，解釋了自然掛膜濾池的脫氮負荷高于接種掛膜的現(xiàn)象。
此外在生物膜中也檢測到了具有硫自養(yǎng)反硝化功能的熱單胞菌屬（Thermomonas）細菌，其在接種掛膜法和自然掛膜法系統(tǒng)中的相對豐度分別為2.66%和3.86%。
2.5.2 二沉池回流污泥的微生物群落
二沉池回流污泥中主要優(yōu)勢菌屬不動桿菌屬（Acinetobacter）和Tetrasphaera菌屬的相對豐度分別為16.22%和10.46%（見圖9）。Acinetobacter是活性污泥中常見的好氧菌，解釋了接種掛膜初期較早達到10mg/L氮去除量負荷的現(xiàn)象。Tetrasphaera菌屬可以進行反硝化，將硝酸鹽還原至亞硝酸鹽但不能完全反硝化至氮氣。硫桿菌屬和熱單胞菌屬在二沉池回流污泥中含量較低，均未檢出，說明在兩種掛膜方法的反應器中均存在明顯的菌種馴化過程。從另一個角度看，由于都需要重新馴化硫自養(yǎng)反硝化相關菌屬，那么采用二沉池回流污泥的接種掛膜法和自然掛膜法相比，在操作上多了運輸污泥的步驟，故此方法在實際工程中沒有顯著優(yōu)勢。
3、結論
①固定濾速掛膜會出現(xiàn)亞硝酸鹽積累和脫氮效果不穩(wěn)定的問題，硫自養(yǎng)反硝化工藝用于實際工程時，在保證出水水質的前提下，建議采用變?yōu)V速自然掛膜。
②變?yōu)V速自然掛膜的脫氮負荷最高可達0.81kg/（m³·d），高于變?yōu)V速接種掛膜的0.52kg/（m³·d）。在改變水力停留時間后接種掛膜和自然掛膜均會出現(xiàn)亞硝酸鹽積累的現(xiàn)象，在穩(wěn)定運行期間，自然掛膜的脫氮負荷優(yōu)于接種掛膜。
③針對實際二沉池出水，進水溶解氧過高會抑制脫氮過程，對于pH無需額外控制，SO42-實際產(chǎn)生量略高于理論值。
④反應器中進行硫自養(yǎng)反硝化的細菌在屬水平上主要有Thiobacillus和Thermomonas屬，相對豐度分別為6.38%和3.86%，其與二沉池回流污泥相比存在明顯的馴化過程。接種掛膜和自然掛膜過程都需要重新馴化硫自養(yǎng)反硝化相關菌屬，接種掛膜在實際工程應用中沒有顯著優(yōu)勢。（來源：北京工業(yè)大學北京市水質科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室，北京城市排水集團有限責任公司，北京城市排水集團有限責任公司科技研發(fā)中心）
