申請(qǐng)日2014.02.27

　　公開(公告)日2014.05.21

　　IPC分類號(hào)G01N1/28; G01N21/64

　　摘要

　　本發(fā)明公開了一種測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，包括以下步驟：將處理廢水后的黃孢原毛平革菌菌球清洗后，加入液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，再向培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基中加入2′,7′-二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉得混合液，將混合液孵育、過(guò)濾，過(guò)濾后得到的菌球經(jīng)超聲破碎、離心后，提取上懸液，最后測(cè)定上懸液中氧化型二氯熒光素的熒光強(qiáng)度。該發(fā)明具有操作條件簡(jiǎn)單、易于實(shí)施、能夠準(zhǔn)確直觀的測(cè)定處理廢水后的黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的優(yōu)點(diǎn)。

　　權(quán)利要求書

　　1.一種測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，其特征在于包括以下 步驟：將處理廢水后的黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)菌球清洗后，加入液體 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，再向培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基中加入2′,7′-二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉得混合液， 將混合液孵育、過(guò)濾，過(guò)濾后得到的菌球經(jīng)超聲破碎、離心后，提取上懸液，最后測(cè)定上懸 液中氧化型二氯熒光素的熒光強(qiáng)度。

　　2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，其 特征在于：所述液體培養(yǎng)基中菌體的濕重為4g～8g，所述混合液中2′,7′-二氯二氫熒光黃雙乙 酸鈉的摩爾濃度為2μM～10μM。

　　3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法， 其特征在于：所述液體培養(yǎng)基為Kirk液體培養(yǎng)基。

　　4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法， 其特征在于：所述孵育的條件為室溫、避光孵育，孵育時(shí)間為0.5h～1.5h。

　　5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，其 特征在于：所述超聲破碎的溫度為0℃～4℃，功率為400w～600w，總超聲破碎時(shí)間為4min～ 6min，單次超聲持續(xù)3s～4s，單次超聲間隔8s～9s。

　　說(shuō)明書

　　測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法

　　技術(shù)領(lǐng)域

　　本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域和廢水處理領(lǐng)域，尤其涉及一種測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平 革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法。

　　背景技術(shù)

　　當(dāng)下，重金屬和有機(jī)污染物對(duì)環(huán)境的危害已經(jīng)成為一個(gè)全球性的問(wèn)題。在目前廢水處理 領(lǐng)域，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)能夠利用黃孢原毛平革菌去除廢水中的重金屬和有機(jī)物，然而廢水中的 污染物對(duì)菌體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激作用以及菌體本身對(duì)廢水的一個(gè)耐受性也值得我們關(guān)注。

　　現(xiàn)有活性氧水平的檢測(cè)方法主要集中用于動(dòng)植物等高等生物體內(nèi)活性氧的檢測(cè)，其使用 的檢測(cè)方法基本為流式細(xì)胞術(shù)，但流式細(xì)胞儀價(jià)格高昂，檢測(cè)費(fèi)用高，儀器操作復(fù)雜，且不 宜批量檢測(cè)。在現(xiàn)有的2′,7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)熒光探針技術(shù)中，會(huì)存在 探針載入細(xì)胞失敗，以及細(xì)胞外殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針沒(méi)有被洗凈，導(dǎo)致背景值較高等 問(wèn)題。

　　發(fā)明內(nèi)容

　　本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種準(zhǔn)確直觀、操作簡(jiǎn)單、易于 實(shí)施的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法。

　　為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

　　一種測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)菌體內(nèi)活性氧水平的 方法，包括以下步驟：將處理廢水后的黃孢原毛平革菌菌球清洗后，加入液體培養(yǎng)基中繼續(xù) 培養(yǎng)，再向培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基中加入2′,7′-二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉得混合液，將混合液孵 育、過(guò)濾，過(guò)濾后得到的菌球經(jīng)超聲破碎、離心后，提取上懸液，最后測(cè)定上懸液中氧化型 二氯熒光素的熒光強(qiáng)度。

　　作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，

　　所述液體培養(yǎng)基中菌體的濕重為4g～8g，所述混合液中2′,7′-二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉的 摩爾濃度為2μM～10μM。

　　所述液體培養(yǎng)基為Kirk液體培養(yǎng)基。

　　所述孵育的條件為室溫、避光孵育，孵育時(shí)間為0.5h～1.5h。

　　所述超聲破碎的溫度為0℃～4℃，功率為400w～600w，總超聲破碎時(shí)間為4min～6min， 單次超聲持續(xù)3s～4s，單次超聲間隔8s～9s。

　　本發(fā)明中黃孢原毛平革菌菌懸液的制備步驟包括：將黃孢原毛平革菌孢子粉末懸浮于無(wú) 菌水中制成孢子懸液，并調(diào)節(jié)濁度值為60%，即每毫升孢子懸液中含2.5×106個(gè)孢子，再將孢 子懸液接種到Kirk液體培養(yǎng)基中于35℃～39℃，140r/min～160r/min條件下，振蕩培養(yǎng)60h～ 72h，得黃孢原毛平革菌菌懸液。

　　本發(fā)明中黃孢原毛平革菌菌球處理廢水的步驟包括：將黃孢原毛平革菌菌懸液中的菌球 加入至pH6.0～7.0的鎘廢水或二氯酚廢水中，于35℃～39℃，140r/min～160r/min條件下處 理12h，過(guò)濾廢水，回收菌球，黃孢原毛平革菌菌懸液中菌球的干重質(zhì)量與廢水的體積比為 0.3∶1g/L～0.5∶1g/L。

　　活性氧(ROS)是具有高度反應(yīng)性的小分子，包括超氧陰離子(O2-)、羥基自由基(OH) 和過(guò)氧化氫(H2O2)等;其存在于人類和生物體內(nèi)并源于氧。ROS能夠通過(guò)與DNA、蛋白質(zhì) 和脂質(zhì)分子反應(yīng)而改變細(xì)胞的功能，其通常作為不同代謝途徑的副產(chǎn)物存在于生物系統(tǒng)中。 它們還在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫系統(tǒng)細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵作用，過(guò)量的ROS會(huì)對(duì)菌體細(xì) 胞結(jié)構(gòu)和功能造成很大損害。

　　氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致 中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是由自由基在體 內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。氧化應(yīng)激本身是難以 被抓住并在體內(nèi)進(jìn)行測(cè)定的現(xiàn)象，因此，只能通過(guò)間接方法來(lái)測(cè)定它們的水平。

　　2′,7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)是活性氧的特異探針，它本身不發(fā)熒光，可 自由穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，被胞內(nèi)的酯酶分解為無(wú)熒光的還原型二氯熒光素(DCFH) 而保留在胞內(nèi)，各類ROS會(huì)氧化DCFH為發(fā)強(qiáng)綠色熒光的氧化型二氯熒光素(DCF)，DCFH 被氧化成DCF的量(或熒光強(qiáng)度)與自由基的含量成正比，即細(xì)胞內(nèi)DCF的量(或熒光強(qiáng)度) 能直接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)自由基的含量，因此利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)胞內(nèi)的DCF熒光強(qiáng)度即可反 映細(xì)胞的ROS水平。

　　與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：

　　1.本發(fā)明將活性氧水平的檢測(cè)方法從動(dòng)植物領(lǐng)域擴(kuò)展到了白腐真菌領(lǐng)域，能夠直觀、準(zhǔn) 確的對(duì)廢水處理后受污染物脅迫的黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平進(jìn)行表征，操作條 件簡(jiǎn)單且容易實(shí)施。

　　2.本發(fā)明將處理廢水回收后的菌球經(jīng)去離子水清洗后加入培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，再向混合 液中加入2′,7′-二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉。通過(guò)繼續(xù)培養(yǎng)可以使DCFH-DA順利地通過(guò)細(xì)胞膜 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)過(guò)濾洗凈后的細(xì)胞外幾乎沒(méi)有殘余的探針，不會(huì)產(chǎn)生誤差。并且使用超聲 破碎，大大提高了白腐真菌的破碎效率，能夠快速可靠地檢測(cè)其胞內(nèi)活性氧的水平。

　　3.本發(fā)明所使用的黃孢原毛平革菌菌球是由孢子粉末加入液體培養(yǎng)基中制備而成，制備 工藝簡(jiǎn)單，易于擴(kuò)大培養(yǎng)，實(shí)用性強(qiáng)。

　　4.本發(fā)明除了可以測(cè)定處理廢水后的黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)的活性氧水平，同樣可以測(cè) 定未處理廢水的黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)的活性氧水平，甚至包括其他白腐真菌。并且通過(guò)本 發(fā)明檢測(cè)處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度，可以得出黃孢原毛平革菌處理 廢水的最佳濃度，能為重金屬和有機(jī)污染物對(duì)黃孢原毛平革菌產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的毒性機(jī)制的 研究提供基礎(chǔ)。本發(fā)明對(duì)于進(jìn)一步研究黃孢原毛平革菌在處理重金屬和難降解有機(jī)污染物等 異生物質(zhì)時(shí)，菌體內(nèi)特殊抗氧化系統(tǒng)的變化具有重要意義，本發(fā)明也對(duì)白腐真菌在環(huán)境生物 治理上的應(yīng)用具有促進(jìn)作用。

　　本發(fā)明采用的菌種為黃孢原毛平革菌(BKM-F1767)購(gòu)自位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC ATTC24725，優(yōu)選采用該菌株，但不限于此。