申請日2015.06.19
公開(公告)日2015.09.16
IPC分類號C12N15/10
摘要
同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法，屬于污水處理技術(shù)領(lǐng)域。先預(yù)處理;再分離胞內(nèi)和胞外DNA，然后分別提取純化胞內(nèi)DNA和胞外DNA。可以從活性污泥法等生物處理污水樣品中同時提取胞內(nèi)和胞外DNA并進(jìn)行準(zhǔn)確定量，收率高，純度高，并且菌體裂解的交叉污染小，簡單易行，非常適合對含大量微生物的污水樣品進(jìn)行對比實驗和科學(xué)研究使用，也具有開發(fā)加工成商業(yè)分析試劑盒的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求書
1.同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法，其特征在于，包括以下 步驟：
1)預(yù)處理
取污水樣品10mL，加入NaH2PO4溶液和聚乙烯基吡咯烷酮，常溫條件下放置搖床震蕩混 勻，得預(yù)處理樣品;
2)分離胞內(nèi)和胞外DNA
(1)將步驟1)預(yù)處理所得樣品進(jìn)行離心，得到沉淀物A和上清液A;
(2)將步驟(1)所得沉淀物A重懸于NaH2PO4溶液中，得重懸液A;
(3)將步驟(1)所得上清液A用無菌濾膜過濾，收集濾液放冰盒內(nèi)保藏，含截留物的 濾膜重懸于NaH2PO4溶液中震蕩，濾膜洗脫截留物后棄除，得重懸液B;
(4)合并重懸液A和重懸液B，再重復(fù)步驟(1)～(3)，得到重懸液C，另將冰盒內(nèi) 保藏的樣品合并得總濾液;
(5)將重懸液C和總濾液分別進(jìn)行離心，分別得到沉淀物B1和沉淀物B2，以及上清液 B1和上清液B2;將沉淀物B1和沉淀物B2合并，得沉淀物C，沉淀物C用于提取胞內(nèi)DNA， 將上清液B1和上清液B2合并，得上清液C，上清液C用于提取胞外DNA;
3)提取純化胞內(nèi)DNA
(1)將沉淀物C加入DNA提取緩沖液和玻璃珠,渦旋震蕩，然后加入SDS緩沖液，得 混合液;
(2)將步驟(1)得到的混合液采用凍融法破胞，即將混合液交替進(jìn)行液氮浴和水浴， 然后進(jìn)行離心，離心后所得上清液D置于冰盒內(nèi)保藏，離心后所得沉淀物D重懸于DNA提取 緩沖液中，得重懸液D;
(3)將重懸液D進(jìn)行渦旋震蕩后水浴，再加入SDS緩沖液，然后水浴，接著離心，將 離心后所得上清液E置于冰盒內(nèi)保藏;
(4)對上清液E采用商用試劑盒純化DNA，得到胞內(nèi)DNA;
4)提取純化胞外DNA
將步驟2)中的步驟(5)所得上清液C加入CTAB后水浴，接著離心，離心后轉(zhuǎn)移上清 液，然后利用商用試劑盒純化其中DNA，得到胞外DNA。
2.如權(quán)利要求1所述同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步驟1)中，所述NaH2PO4溶液為0.12M，pH 8.0;NaH2PO4溶液加入量9～11mL; 所述聚乙烯基吡咯烷酮加入量為0.5g～1.5g。
3.如權(quán)利要求1所述同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步驟2)中，所述NaH2PO4溶液為0.12M，pH 8.0;所述無菌濾膜的孔徑為≥0.22 μm;所述重復(fù)步驟(1)～(3)的次數(shù)為1～5次;所述離心的條件為：離心溫度4℃，離 心力≥10000g，離心時間10～20min。
4.如權(quán)利要求1所述同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步驟3)中，其中步驟(1)使用的DNA提取緩沖液成分包括100mM Tris-HCl、 100mM Na2-EDTA、100mM Na3PO4、1.5M NaCl、1%CTAB以及0.001～0.1mg/mL蛋白酶K; DNA提取緩沖液的加入量是3～5mL;所述玻璃珠的直徑為1mm，玻璃珠加入量是0.5～1g; 所述SDS緩沖液為濃度10%SDS緩沖液，10%SDS緩沖液加入量為1～3mL。
5.如權(quán)利要求1所述同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步驟3)中，其中步驟(2)所述將混合液交替進(jìn)行液氮浴和水浴的次數(shù)為1～5 次;所述液氮浴的時間為1min，水浴的溫度為60℃，水浴的時間為20min;所述離心的條 件為：離心溫度4℃，離心力≥13000g，離心時間≥20min。
6.如權(quán)利要求1所述同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步驟3)中，其中步驟(3)所述渦旋震蕩的轉(zhuǎn)速為2500rpm，時間為5min，水 浴的溫度為37℃，水浴的時間為2h;所述SDS緩沖液為濃度10%SDS緩沖液，10%SDS緩 沖液加入量是1～3mL。
7.如權(quán)利要求1所述同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步驟4)中，所述CTAB的質(zhì)量百分濃度為1%，1%CTAB的加入量與上清液C的體 積比為1∶1;水浴的溫度為65℃，水浴的時間為30min;所述離心的條件為：離心溫度4 ℃，離心力≥13000g，離心時間≥20min。
說明書
同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于污水處理技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物胞內(nèi)和胞外DNA的提取方法，尤其是涉及一 種同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法。
背景技術(shù)
通過微生物降解可溶性和懸浮性有機(jī)污染物是目前污水處理廠的核心工藝，最有代表性 的即活性污泥法。只要為微生物提供適宜的生長環(huán)境，微生物充分生長，就可以最大限度的 去除有機(jī)污染物，提高出水水質(zhì)。換言之，微生物的數(shù)量和類別直接決定了污水生物處理的 效果。而污水中微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，傳統(tǒng)的微生物純種培養(yǎng)方法費時費力且效果不佳，故 目前關(guān)于環(huán)境微生物的研究大都采用以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)研究。同時，盡管胞外 DNA在水體中數(shù)量極低且容易分解,一些胞外DNA也被發(fā)現(xiàn)對于環(huán)境微生物群體和污水處理效 果有重要作用。當(dāng)前胞外DNA對環(huán)境的影響越來越受到重視，但是胞外DNA提取工藝的研究 很少，特別針對污水生物處理水樣同時提取其中胞內(nèi)胞外DNA的方法更是未見報道。
現(xiàn)有活性污泥DNA提取的方法中，一般是通過簡單的污水水樣預(yù)處理(如離心、過濾) 等收獲微生物泥渣，然后采用溶菌酶、珠磨、凍融等手段破胞釋放胞內(nèi)DNA，再進(jìn)一步提取 純化(王愛杰，張運晴，闞洪靜，劉充.一種厭氧活性污泥DNA的提取方法[P].中國，2009: CN101392248A;趙曉祥，張灣，鄧航.一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法[P].中國， 2013:CN103215254A)，這時甚至可以使用一些市售的DNA提取試劑盒。這樣的污泥DNA提取 流程，并沒有特別考慮胞外基因問題，胞外DNA被當(dāng)作雜質(zhì)在預(yù)處理過程中被清除，或者僅 提取樣品總DNA不區(qū)分來源于胞內(nèi)或胞外。因此，若要同時提取污水水樣中的胞內(nèi)和胞外DNA， 面臨很多困難，首先污水生物處理中的水樣，除了含有微生物絮體，還有其他一些固體雜質(zhì)， 胞外DNA分子容易吸附在這些固體顆粒上，很難獲得。其次，如同時提取污水水樣中的胞內(nèi) 胞外DNA，還需防止污水微生物細(xì)胞裂解后的胞內(nèi)DNA污染胞外DNA。
但目前尚未見適于同時提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于從污水生物降解工藝過程中的水樣同時提取其中微生 物胞內(nèi)和胞外DNA的方法。
本發(fā)明包括以下步驟：
1、預(yù)處理
取污水樣品10mL，加入NaH2PO4溶液和聚乙烯基吡咯烷酮，常溫條件下放置搖床震蕩混 勻，得預(yù)處理樣品;
2、分離胞內(nèi)和胞外DNA
1)將步驟1預(yù)處理所得樣品進(jìn)行離心，得到沉淀物A和上清液A;
2)將步驟1)所得沉淀物A重懸于NaH2PO4溶液中，得重懸液A;
3)將步驟1)所得上清液A用無菌濾膜過濾，收集濾液放冰盒內(nèi)保藏，含截留物的濾膜 重懸于NaH2PO4溶液中震蕩，濾膜洗脫截留物后棄除，得重懸液B;
4)合并重懸液A和重懸液B，再重復(fù)步驟1)～3)，得到重懸液C，另將冰盒內(nèi)保藏的 樣品合并得總濾液;
5)將重懸液C和總濾液分別進(jìn)行離心，分別得到沉淀物B1和沉淀物B2，以及上清液B1 和上清液B2;將沉淀物B1和沉淀物B2合并，得沉淀物C，沉淀物C用于提取胞內(nèi)DNA，將 上清液B1和上清液B2合并，得上清液C，上清液C用于提取胞外DNA;
3、提取純化胞內(nèi)DNA
1)將沉淀物C加入DNA提取緩沖液和玻璃珠,渦旋震蕩，然后加入SDS緩沖液，得混 合液;
2)將步驟1)得到的混合液采用凍融法破胞，即將混合液交替進(jìn)行液氮浴和水浴，然后 進(jìn)行離心，離心后所得上清液D置于冰盒內(nèi)保藏，離心后所得沉淀物D重懸于DNA提取緩沖 液中，得重懸液D;
3)將重懸液D進(jìn)行渦旋震蕩后水浴，再加入SDS緩沖液，然后水浴，接著離心，將離 心后所得上清液E置于冰盒內(nèi)保藏;
4)對上清液E采用商用試劑盒純化DNA，得到胞內(nèi)DNA;
4、提取純化胞外DNA
將步驟2中的步驟5)所得上清液C加入CTAB后水浴，接著離心，離心后轉(zhuǎn)移上清液， 然后利用商用試劑盒純化其中DNA，得到胞外DNA。
下面進(jìn)一步給出較佳的附加技術(shù)條件：
在步驟1中，所述NaH2PO4溶液為0.12M，pH 8.0;NaH2PO4溶液加入量9～11mL;所述 聚乙烯基吡咯烷酮加入量為0.5～1.5g。
在步驟2中，所述NaH2PO4溶液為0.12M，pH 8.0;所述無菌濾膜的孔徑為≥0.22μm; 所述重復(fù)步驟1)～3)的次數(shù)可為1～5次;所述離心的條件為：離心溫度4℃，離心力≥ 10000g，離心時間10～20min。
在步驟3中，其中步驟1)使用的DNA提取緩沖液成分包括100mM Tris-HCl、100mM Na2-EDTA、100mM Na3PO4、1.5M NaCl、1%CTAB以及0.001～0.1mg/mL蛋白酶K;DNA提 取緩沖液的加入量是3～5mL;所述玻璃珠的直徑為1mm，玻璃珠加入量是0.5～1g;所述 SDS緩沖液為濃度10%SDS緩沖液，10%SDS緩沖液加入量為1～3mL;其中步驟2)所述將 混合液交替進(jìn)行液氮浴和水浴的次數(shù)可為1～5次;所述液氮浴的時間為1min，水浴的溫度 為60℃，水浴的時間為20min;所述離心的條件為：離心溫度4℃，離心力≥13000g，離心 時間≥20min;其中步驟3)所述渦旋震蕩的轉(zhuǎn)速為2500rpm，時間為5min，水浴的溫度為 37℃，水浴的時間為2h;所述SDS緩沖液為濃度10%SDS緩沖液，10%SDS緩沖液加入量是 1～3mL。
在步驟4中，所述CTAB的濃度為1%(w/v)，1%CTAB的加入量與上清液C的體積比為1∶ 1;水浴的溫度為65℃，水浴的時間為30min;所述離心的條件為：離心溫度4℃，離心力 ≥13000g，離心時間≥20min。
與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的有益效果如下：
本發(fā)明可以從活性污泥法等生物處理污水樣品中同時提取胞內(nèi)和胞外DNA并進(jìn)行準(zhǔn)確定 量，收率高，純度高，并且菌體裂解的交叉污染小，簡單易行，非常適合對含大量微生物的 污水樣品進(jìn)行對比實驗和科學(xué)研究使用，也具有開發(fā)加工成商業(yè)分析試劑盒的應(yīng)用前景。在 步驟1中加入NaH2PO4和聚乙烯基吡咯烷酮，不僅可以去除腐殖酸等雜質(zhì)，而且對菌體細(xì)胞有 保護(hù)緩沖作用，防止細(xì)胞裂解造成胞內(nèi)DNA污染胞外DNA。解決了目前胞外DNA容易被胞內(nèi) DNA污染，不宜獲得的難題。在其它步驟中使用離心和過濾等物理手段，可避免使用化學(xué)方 法對DNA造成污染，同時NaH2PO4溶液對菌體細(xì)胞有保護(hù)緩沖作用。在步驟3中的步驟1)中 使用的SDS緩沖液對污水中高濃度的菌體有很好的裂解效果，充分提高了DNA的回收率。步 驟4提取胞外DNA過程中采用CTAB法，未添加其他對DNA有吸附作用的物質(zhì)，利用高速離心 一次性沉淀雜質(zhì)，充分避免了胞外DNA的損失。
