抗生素的濫用誘導和加速了抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的產(chǎn)生、傳播以及抗生素耐藥菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)形成的風險, 并且ARGs的存在是細菌表現(xiàn)耐藥性的根本原因.ARGs作為一類新型的環(huán)境污染物, 可通過質(zhì)粒、整合子以及轉(zhuǎn)座子等可在細菌同種屬菌株間和不同種屬的菌株之間發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移, 即使ARB死亡后, 攜帶ARGs的裸露DNA會在脫氧核苷酸酶的保護作用下長期存在, 故ARGs在環(huán)境中的持久性殘留、傳播和擴散比抗生素本身的危害還要大.目前, ARGs廣泛存在于不同的生態(tài)環(huán)境中, 如水環(huán)境、土壤和大氣, 其中作為水環(huán)境之一的污水廠被認為是ARB和ARGs巨大的儲存地.以前針對ARGs的大多數(shù)研究主要集中在處理醫(yī)院和生活污水的城市污水廠上.然而, 迄今為止, 很少有報道從醫(yī)藥化工廢水中檢測出ARB和ARGs.

　　ARGs的檢測方法有可培方法和非培方法這兩大類.可培方法是通過培養(yǎng)基進行微生物分離, 而后根據(jù)所分離微生物的耐藥性, 結(jié)合各種分子生物學方法或者對ARB進行全基因組.但是由于自然環(huán)境中超過99%的微生物不能用傳統(tǒng)培養(yǎng)基方法進行分離培養(yǎng), 故可培方法會遺漏大量ARB和ARGs.非培方法有PCR技術、qPCR技術、基因芯片技術及宏基因組學技術.無論是普通PCR技術還是qPCR技術只能局限于已知序列的單一耐藥基因檢測, 并且只能對少數(shù)的ARGs進行同時檢測, 最后還需要測序分析來進一步確認.基因芯片技術雖然可以同時檢測出大量的ARGs, 但仍然要依賴于根據(jù)已知的耐藥基因序列設計出相應的特異性強的探針, 并且其制作復雜, 費用昂貴.而隨著生物技術的不斷發(fā)展, 宏基因組測序也越來越多地應用于醫(yī)學研究及臨床診斷領域, 如感染類型診斷、抗性基因的鑒定和傳染病的防控等.宏基因組技術通過高通量測序, 打破了傳統(tǒng)以培養(yǎng)為主的微生物研究方式, 直接提取遺傳物質(zhì)進行遺傳操作, 不僅可以準確獲得樣品微生物物種組成及豐度等信息, 進入數(shù)據(jù)庫預測微生物功能, 還能分析微生物代謝網(wǎng)絡等多方面的信息, 并且可同時檢測大量的ARGs, 為尋找新基因、研究微生物多樣性提供了便利的工具.

　　本研究借助宏基因組技術調(diào)查醫(yī)藥化工廢水廠中微生物群落組成, 并分析ARGs的多樣性及兩者之間的關系, 對掌握醫(yī)藥化工廢水中ARGs的污染現(xiàn)狀及控制其傳播, 保護微生態(tài)環(huán)境具有重要指導意義.

　　1 材料與方法

　　1.1 樣品采集

　　本實驗樣品取自江蘇某醫(yī)藥化工園區(qū)廢水處理廠, 該廢水廠主要功能是處理園區(qū)各醫(yī)藥化工企業(yè)排放的工業(yè)廢水, 納入廢水廠管網(wǎng)的廢水包括抗生素中間體廢水及農(nóng)藥中間體廢水等多種醫(yī)藥化工廢水.該廢水廠日處理量10萬t, 收集的廢水中含β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和四環(huán)素類等幾大類抗生素生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的高濃發(fā)酵廢水、化學合成廢水、其他制劑廢水及混合廢水(清洗水、冷卻循環(huán)水和生活污水等).廢水中含大量殘留的抗生素原材料、副反應產(chǎn)物, 還含有機溶劑二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、四氫呋喃和二氯甲烷等.廢水廠主要采用厭氧-缺氧-好氧(A2O)工藝.本實驗樣品為活性污泥, 具體取自完全混合式好氧生物處理池.取樣時先在池內(nèi)前中后三段各取約500 mL泥水混合樣品, 以保證樣品具有代表性, 現(xiàn)場混合均勻后, 用無菌50 mL離心管分裝后冰袋低溫冷藏, 當日即進行基因組DNA提取.

　　1.2 基因組DNA提取

　　使用FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, CA, USA)試劑盒根據(jù)產(chǎn)品操作手冊提取樣品基因組DNA.采用1%瓊脂凝膠電泳檢測DNA樣品的質(zhì)量和完整性.用NanoDropTM 2 000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)和Qubit® 2.0熒光光譜儀(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)檢測DNA的產(chǎn)量和純度.基因組DNA樣品用干冰保藏并立即送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序.

　　1.3 ARGs生物信息學分析

　　采用Illumina HiSeq Xten平臺進行PE150雙端測序.首先對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制, 去除堿基數(shù)大于40 bp但是其質(zhì)量分數(shù)低于38的序列, 去掉歧義核苷酸超過10個的序列, 去掉與adapter序列有15 bp重疊的序列.采用SOAPdenovo軟件組裝clean reads.當選擇最高的scaffold N50 value來進行進一步分析時, 選擇不同的K-mer值(49、55和59)用于使用于不同的-d1、-M3、-u和-F參數(shù).將得到的scaffold片段在N段打斷, 進而得到scaftig片段.僅僅大于500 bp的scaftig片段被保留以作進一步分析.采用默認參數(shù)的MetaGeneMark軟件從組裝好的scaftig片段來預測開放閱讀框(ORFs), 采用CD-HIT來獲得非冗余基因.采用SOAPaligner軟件將保留的clean read與基因庫進行比對, 以計算匹配的數(shù)目.通過去除含有少于3個mapped reads映射片段的基因類別來獲得unigene.用DIAMOND軟件將unigene與NCBI-NR數(shù)據(jù)庫進行比對, 設置blastp參數(shù)e-value≤1e-5, 并且采用MEGAN軟件LCA算法進行注釋.采用DIAMOND軟件(blastp, evalue ≤ 1e-5)將unigene對應的蛋白序列在KEGG數(shù)據(jù)庫、eggNOG數(shù)據(jù)庫和CAZy數(shù)據(jù)庫中進行比對.利用BLAST軟件(blastp, evalue≤1e-5)將unigene在CARD數(shù)據(jù)庫進行比對, 進行ARGs注釋.采用Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡分析, 以研究ARGs與微生物分類的關系.具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關技術文檔。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 醫(yī)藥化工污水廠中微生物群落結(jié)構

　　在該好氧活性污泥樣品中, 經(jīng)過質(zhì)量控制后, 共得到reads數(shù)目109 523 076條, 并由此組裝得到55 255個scaftig, 并預測了105 892個unigene.利用DIAMOND軟件將unigene在NCBI-NR數(shù)據(jù)庫中進行比對, 后續(xù)用MEGAN軟件進行注釋, 統(tǒng)計樣本在門水平(表 1)及屬水平(圖 1)上的前10個豐度最大的群落組成.

表 1 廢水廠中10個最豐富門的相對豐度

  圖 1 廢水廠中10個最豐富屬的相對豐度

　　根據(jù)分類結(jié)果, 細菌域(Bacteria)是該醫(yī)藥化工園區(qū)廢水廠中主要的微生物類群.并由表 1可知, 該廢水廠豐度在前10的優(yōu)勢菌門是Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes、Acidobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、Firmicutes、Planctomycetes和Candidatus Saacharibacteria.其中最優(yōu)勢的菌門是Proteobacteria, 這與其他關于污水廠報道相符合, 豐度接近50%;其次是Chloroflexi, 豐度約占10%.Chloroflexi菌株可以在極端環(huán)境中生存, 比如熱泉和高鹽環(huán)境, 并且也經(jīng)常從污水廠環(huán)境中分離得到, Chloroflexi類群中的絲狀菌是污水處理廠活性污泥中的常見組成, 其大量出現(xiàn)會產(chǎn)生污泥膨脹現(xiàn)象.細菌菌群豐度居第三的是Bacteroidetes, 約占5%;其他7個優(yōu)勢菌群的豐度在0.5%~3%之間.

　　在該混合污泥樣品中, 共檢測到265個屬, 豐度在前10的優(yōu)勢屬為Hyphomicrobium、Ardenticatena、Paracoccus、Thauera、Leptolyngbya、Filomicrobium、Methyloversatilis、Truepera、Ottowia和Aromatoleum, 其中Hyphomicrobium是最主要的類群, 屬于革蘭氏陰性菌, 占據(jù)約12%;Ardenticatena、Paracoccus和Thauera這3個優(yōu)勢屬的豐度相似, 均在4.5%左右, 其中Ardenticatena豐度稍高, 為4.7%;其他6個優(yōu)勢屬的豐度在0.2%~1.0%之間(圖 1).在屬水平上,Hyphomicrobium是最優(yōu)勢屬, 而在種水平上, Hyphomicrobium zavarzinii是最優(yōu)勢種.根據(jù)報道, Hyphomicrobium屬類菌株也經(jīng)常出現(xiàn)在污水環(huán)境中, 屬于限制性的兼性甲基氧化菌, 能夠利用甲醇、甲基化胺或甲酸鹽等一碳化合物作為唯一碳源生長.而Hyphomicrobium zavarzinii能通過甲醇脫氫酶的過量表達, 在污水甲基營養(yǎng)型代謝中起著關鍵作用.

　　相比之下, 城市污水處理廠(wastewater treatment plants, WWTPs)中處理的廢水大部分為生活污水, 可生化性好, 廢水中的抗生素一般來源于醫(yī)院排放的醫(yī)療廢水, 含量較少, 尤其經(jīng)大量其他廢水稀釋之后濃度一般為痕量.從WWTPs中分析到的主要細菌種類屬于糞便污染的常見指標：大腸桿菌、總大腸菌群和腸球菌.監(jiān)測到的主要耐藥菌包括耐甲氧的Staphylococcus aureus、耐萬古霉素的Enterococcus spp.及革蘭氏陰性菌(如Enterobacteria、Pseudomonads和Acinetobacter), 這些菌對氟喹諾酮類、碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺類等抗生素具有抗性.醫(yī)藥化工廢水處理廠的抗生素濃度高于WWTPs的10~100倍, 因此其抗性菌種的種類和耐藥性也一般強于WWTPs.

　　2.2 醫(yī)藥化工廢水廠中微生物群落功能注釋

　　用DIAMOND軟件將unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對, 共注釋了54564個unigene, 結(jié)果如圖 2所示.從中可知, 該微生物菌群的功能通路相關的基因數(shù)量依次為：代謝>遺傳信息處理>環(huán)境信息處理>人類疾病>細胞過程>生物系統(tǒng), 其中最主要的功能通路是代謝相關, 其次是遺傳信息處理, 第三是環(huán)境信息處理.屬于代謝類別的功能分類中豐度依次為：碳代謝>氨基酸代謝>能量代謝>核苷酸代謝>輔因子和維生素的代謝>異生素生物降解與新陳代謝>脂質(zhì)代謝>萜類和聚酮化合物代謝>其他氨基酸代謝>其他次生代謝物生物合成>多糖生物合成與代謝, 其中碳代謝、氨基酸代謝和能量代謝的基因數(shù)量尤為豐富, 分別為7 788、6 155和5 067個.屬于遺傳信息處理類別的功能分類豐度依次為：復制與修復>折疊、分類與降解>翻譯>轉(zhuǎn)錄, 其中復制與修復是最主要部分, 基因數(shù)量為2 535個.該微生物菌群功能通路中還有一部分的環(huán)境信息處理類別的功能, 其分類類別豐度依次為：膜轉(zhuǎn)運>信號轉(zhuǎn)導>信號分子與相互作用, 其中最主要的是膜轉(zhuǎn)運, 基因數(shù)據(jù)為2 678個, 其他兩個類別的基因合計100個, 數(shù)目甚少.屬于人類疾病類別豐度依次為：傳染性疾病>神經(jīng)退行性疾病>內(nèi)分泌和代謝疾病>癌癥>物質(zhì)依賴>免疫疾病>心血管疾病, 其中細菌傳染性疾病相關的基因數(shù)目尤其突出, 為517個, 是其他人類疾病基因總數(shù)的約1.6倍.而在傳染病疾病中, 細菌感染性疾病相關的基因占據(jù)了大部分, 約80%.

圖 2 基于KEGG數(shù)據(jù)庫注釋的廢水廠微生物群落功能基因分布 

　　在該廢水廠中細菌傳染疾病涉及到9類(圖 3), 其豐度依次為軍團桿菌病>結(jié)核病>沙門氏菌感染>幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號傳導>金黃色葡萄球菌感染>上皮細胞的細菌入侵>百日咳>致病性大腸桿菌感染>霍亂弧菌感染, 其中最主要的傳染病為軍團桿菌病, 其基因數(shù)目為136個;其次是結(jié)核病, 基因數(shù)目為108個;沙門氏菌感染和幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號傳導, 基因數(shù)目均在60個左右;其他疾病的基因數(shù)目在15個以下.

圖 3 廢水廠中細菌感染疾病相關的基因數(shù)量

　　根據(jù)功能注釋結(jié)果, 該廢水廠菌群中最主要的功能通路是代謝相關, 并且還存在許多與人類疾病相關的基因, 其中主要是細菌感染性疾病.到目前為止, 全球新出現(xiàn)的傳染病事件的發(fā)生率有所增加, 廢水廠等特殊環(huán)境可以作為許多病原體的天然宿主對人類健康存在潛在威脅.

　　2.3 醫(yī)藥化工廢水廠中ARGs及耐藥機制

　　用BLAST軟件將unigene在抗性基因數(shù)據(jù)庫CARD中進行比對, 結(jié)果如圖 4所示.經(jīng)過氨基酸大于50%標準控制后, 共注釋到74類抗生素功能基因, 涉及包括β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類、喹諾酮類及磺胺類等多種抗生素抗性基因.

  圖 4 污水廠中不同ARGs的相對豐度

　　在這74類ARGs中sav1866、dfrE和mfd是最主要ARGs.sav1866基因?qū)儆诙嘀啬退幓��? 其編碼的蛋白是ABC膜轉(zhuǎn)運蛋白, 其耐藥機制屬于ABC外排泵.在細菌中, 許多ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白都與抗生素耐受性有關.sav1866被檢測為豐度最大的ARGs, 推測這與該廢水廠處理多種抗生素中間體廢水及多種農(nóng)藥中間體廢水密切相關.dfrE基因首次被發(fā)現(xiàn)在糞腸球菌中, 其編碼的蛋白是一種耐甲氧芐啶二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductases, DHFRs), 該種DHFRs具有高的甲氧芐啶抗性, 其耐藥機制是抗生素靶位點改變.mfd基因的產(chǎn)物Mfd是轉(zhuǎn)錄-修復偶聯(lián)因子蛋白, 屬于DNA移位酶, 也是DNA修復的必須因子, 其耐藥機制是抗生素靶位點保護.Mfd主要功能是促進DNA修復, 但在某些情況下, 如在復制-轉(zhuǎn)錄沖突區(qū)域和在穩(wěn)定階段的突變中, Mfd反而增加了突變, 如Mfd促使空腸彎曲桿菌產(chǎn)生了對喹諾酮藥物的抗性.在新的研究結(jié)果中, Mfd被認為是一種促進突變的進化因子, 加速了抗生素耐藥性的發(fā)展, 是不同類群的細菌快速獲得各種抗生素耐藥性所必須的[35].由此推測, mfd基因的大量存在及積累可能會促進廢水廠中微生物產(chǎn)生更多抗生素抗性.

　　統(tǒng)計這些ARGs的耐藥機制, 以調(diào)查該廢水廠的耐藥機制情況, 如圖 5中(a)所示.在該醫(yī)藥化工廢水好氧活性污泥處理系統(tǒng)中, 微生物存在耐藥的機制有5種, 分別是抗生素失活(8%)、抗生素靶位點改變(4%)、抗生素靶位點保護(7%)、抗生素靶位點替換(11%)和抗生素特異的外排泵(70%), 其中抗生素特異的外排泵是主要的耐藥機制, 占比50%以上.在所研究的菌群中的外排泵組成如圖 5(b)所以, 主要由ABC外排泵(18%)、MFS外排泵(10%)、RND外排泵(34%)和SMR外排泵(3%)組成, 其中RND外排泵是該微生物菌群抗生素外排泵耐藥機制的最主要類型, 其次是ABC外排泵.據(jù)報道, 細菌細胞膜上的主動外排泵可將抗菌藥物排至細菌外, 從而阻礙抗菌藥物與細菌內(nèi)的靶點結(jié)合, 引起耐藥.并且, 外排泵在細菌中廣泛存在, 在介導細菌多重耐藥中起著重要作用.本研究表明, 氯霉素、四環(huán)素、磺胺類、氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均能通過細菌的主動外排機制而被排出細胞外.而該研究的醫(yī)藥化工污水系統(tǒng)所具有的外排泵中, RND外排泵是主要機制.RND外排泵的外排底物比較廣泛, 包括多種抗菌藥物、消毒劑和染料等, 由此可推測該菌群對多種抗生素具有抗性.結(jié)合圖 4, 屬于RND外排泵的ARGs有smeD、mdtB、mexJ、smeR、cmeB和mexQ等, 涉及氨基香豆素抗生素、四環(huán)素抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌素、氨基糖苷抗生素、三氯沙抗生素和氟喹諾酮類抗生素、頭孢菌素等ARGs;屬于ABC外排泵的ARGs有l(wèi)mrD、otrC、novA、macB和sav1866, 涉及林可酰胺類抗生素、四環(huán)素類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥.

(a)微生物的抗生素耐藥機制; (b)抗生素特異的外排泵組成

圖 5 污水廠中抗生素耐藥機制類型占比

　　2.4 廢水廠中ARGs與微生物類群的關聯(lián)

　　對廢水廠中ARGs與微生物類群的共存模式進行網(wǎng)絡分析(圖 6), 結(jié)果顯示有44類ARGs與污水廠中屬級的微生物分類群高度相關, 并且主要類群的屬都是多重耐藥菌株, 同時攜帶多種ARGs, 涉及到4大類ARGs耐藥機制.Hyphomicrobium屬和Thauera屬均可能攜帶有近20個ARGs, Paracoccus屬和Methyloversatilis屬可能攜帶有近10個ARGs.如Hyphomicrobium屬中可能攜帶的抗性基因有dfrA26、mdsB、qepA、tetT、mexQ、mexF、mexL、rosB、sul2、dfrE、mfd和bacA等;Thauera屬則可能攜帶有mdtD、bacA、mexJ、tet36、oprM、acrB和novA等.

 圖 6 污水廠中ARGs與微生物類群的相關性網(wǎng)絡分析

　　3 結(jié)論

　　(1) 該醫(yī)藥化工廢水處理廠的菌群組成結(jié)構中, 細菌域是主要微生物類類群, 并且最優(yōu)勢的菌門是Proteobacteria, 其次是Chloroflexi.最優(yōu)勢屬是Hyphomicrobium, 最優(yōu)勢種為Hyphomicrobium zavarzinii.

　　(2) 該醫(yī)藥化工廢水廠中微生物群落最主要的功能通路是代謝相關, 并還存在許多與人類疾病相關的基因, 其中主要是細菌感染性疾病.

　　(3) 該醫(yī)藥化工廢水廠中ARGs共檢測到74類ARGs, 涉及包括β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類、喹諾酮類、磺胺類等多種抗生素抗性基因, 其中sav1866、dfrE和mfd是最主要ARGs, 而最主要的Hyphomicrobium屬也同時攜帶這3種主要的ARGs.該廢水廠菌群的耐藥機制主要是抗生素特異的外排泵, 其中RND外排泵是主要機制.

　　(4) 該廢水廠活性污泥中微生物屬級分類與ARGs高度相關, 并且主要類群的屬都是多重耐藥菌株.(來源：宿州學院食品與生物工程學院 作者：陳紅玲)