申請(qǐng)日2014.10.21
公開(公告)日2015.01.21
IPC分類號(hào)G06F19/00; G01N21/31
摘要
本發(fā)明公開了一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，屬于城市生活污水處理領(lǐng)域。它包括制備試劑、建立數(shù)學(xué)模型、預(yù)處理樣品、測(cè)定蛋白質(zhì)濃度等步驟，基于Lowry法和改良Lowry法，采用Minitab響應(yīng)面法分析蛋白質(zhì)含量，克服了真實(shí)污水中蛋白測(cè)定低準(zhǔn)確性和低精度的問題，降低了二級(jí)出水中腐殖酸、碳水化合物和Ca2+、Mg2+等離子的干擾。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于城市生活污水廠二級(jí)出水低濃度蛋白質(zhì)的測(cè)定，且能同時(shí)測(cè)定出二級(jí)出水腐殖酸的濃度，適用范圍廣。
權(quán)利要求書
1.一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，其步驟為：
(a)制備試劑：將Na2CO3和NaOH溶解于蒸餾水中得到試劑甲，將CuSO4·5H2O和酒 石酸銻鉀溶解于蒸餾水中得到試劑乙，試劑甲和試劑乙混合得到試劑丙，將福林酚與蒸餾水 按體積比為3:1配制得到福林酚使用液;
(b)建立數(shù)學(xué)模型：利用Minitab響應(yīng)面法建立牛血清蛋白BSA和腐殖酸HS的濃度與 對(duì)應(yīng)吸光度值之間的數(shù)學(xué)模型，具體步驟為：
(1)用蒸餾水分別配制BSA標(biāo)準(zhǔn)液和HS標(biāo)準(zhǔn)液，備用;
(2)利用Minitab設(shè)計(jì)至少12組含有不同濃度BSA和HS的樣品，其中BSA的濃度范 圍為0.5-25 mg/L，HS的濃度范圍為2-25 mg/L;
(3)用步驟(1)中配制的BSA標(biāo)準(zhǔn)液和HS標(biāo)準(zhǔn)液按照步驟(2)中設(shè)計(jì)的濃度配制 樣品;
(4)將步驟(3)中配制的樣品每組分別取2.5 mL于試管中，然后往試管中加入2.5 mL 步驟(a)中配制的試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，在室溫放置10分鐘后，向其加入0.3 mL步驟(a)中配制的福林酚使用液并立即混勻，在室溫下放置45分鐘后，測(cè)定其在750 nm 處的吸光度值A(chǔ)1，利用Minitab響應(yīng)面法擬合得到吸光度A1與BSA和HS濃度關(guān)系的線性 方程1：A1=k1+m1*CBSA+n1*CHS，其中k1、m1和n1是二元線性回歸方程系數(shù)，CBSA和CHS分 別代表BSA和HS的濃度;
(5)將步驟(3)中配制的樣品每組分別取2.5 mL于試管中，然后往試管中加入2.5 mL 步驟(a)中配制的試劑丙，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫放置10分鐘后加入0.3 mL步 驟(a)中配制的福林酚使用液并立即混勻，在室溫下放置45分鐘后，測(cè)定其在750 nm處的 吸光度值A(chǔ)2，利用Minitab響應(yīng)面法擬合得到吸光度A2與BSA和HS濃度關(guān)系的線性方程2： A2=k2+m2*CBSA+n2*CHS，其中k2、m2和n2是二元線性回歸方程系數(shù)，CBSA和CHS分別代表 BSA和HS的濃度;
(6)由步驟(4)中得到的線性方程1和步驟(5)中得到的線性方程2可以計(jì)算得到 BSA濃度與吸光度值A(chǔ)1和A2之間的關(guān)系為：CBSA=(k2*n1-k1*n2+n2*A1-n1*A2)/(m1*n2-m2*n1);
(c)預(yù)處理樣品：將污水廠二級(jí)出水依次用濾膜和透析袋進(jìn)行預(yù)處理去除污水中的懸浮 物和雜質(zhì)離子;
(d)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度：取2.5 mL經(jīng)過步驟(c)預(yù)處理得到的水樣于兩只試管中，一只 試管中加入2.5 mL步驟(a)中配制的試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫放置10分 鐘后加入0.3 mL步驟(a)中配制的福林酚使用液并立即混勻，在室溫下放置45分鐘后，測(cè) 定其在750 nm處的吸光度值，另一只試管中加入2.5 mL步驟(a)中配制的試劑丙，在旋渦 混合器上迅速混合，于室溫放置10分鐘后加入0.3 mL步驟(a)中配制的福林酚使用液并立 即混勻，在室溫下放置45分鐘后，測(cè)定其在750 nm處的吸光度值，根據(jù)測(cè)得的吸光度值利 用步驟(b)中建立的數(shù)學(xué)模型計(jì)算出該水樣的蛋白質(zhì)濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，其特征在于： 所述的步驟(a)中制備試劑甲的Na2CO3質(zhì)量為10 g，NaOH質(zhì)量為2 g，蒸餾水500 mL; 制備試劑乙的CuSO4·5H2O質(zhì)量為0.781 g，酒石酸銻鉀質(zhì)量為1 g，蒸餾水100 mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，其特征在于： 所述的步驟(a)中的試劑丙由49 mL試劑甲和2 mL試劑乙混合得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，其特征在于： 所述的步驟(1)中BSA標(biāo)準(zhǔn)液和HS標(biāo)準(zhǔn)液的濃度均為62.5 mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，其特征在于： 所述的步驟(c)中的濾膜孔徑為0.45μm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，其特征在于： 所述的步驟(c)中的透析袋為懸浮式，材質(zhì)為纖維素，截留分子量為100，透析時(shí)間為2.5-4.5 h。
說明書
一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于城市生活污水處理領(lǐng)域，具體地說，涉及一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度 蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)
溶解性有機(jī)氮(DON)普遍存在于生化處理二級(jí)出水中，是溶解性有機(jī)物的一部分。DON 是出水總氮中的一個(gè)重要組成部分，若不加以控制會(huì)加劇河流富營(yíng)養(yǎng)化。DON亦可導(dǎo)致膜污 染，在氯化過程中將產(chǎn)生強(qiáng)致癌性的亞硝胺化合物等，對(duì)水質(zhì)安全構(gòu)成重大威脅。污水處理 廠是DON降解、排放的重要場(chǎng)所，因此，對(duì)二級(jí)出水DON的監(jiān)測(cè)、控制已成為污水再生利 用和飲用水領(lǐng)域關(guān)注的問題之一。研究表明，出水蛋白質(zhì)是出水DON的主要組成部分(占 60%以上)(Westgate,P.J.,Park,C.,Evaluation of proteins and organic nitrogen in wastewater treatment effluents,Environ.Sci.Technol.,2010,44:5352-5357.)。了解二級(jí)出水蛋白質(zhì)的含量， 不僅可提供出水DON的組成信息，亦可反映污水廠的處理效果。
測(cè)定蛋白質(zhì)的方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、BCA法、Lowry法和考 馬斯亮藍(lán)G-250法。凱氏定氮法的原理：在催化劑作用下，將蛋白質(zhì)氮及其他有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為 氨態(tài)氮，通過總氮與非蛋白氮的差值計(jì)算出蛋白質(zhì)量，該方法靈敏度低，誤差大，耗時(shí)長(zhǎng); 雙縮脲法的原理：雙縮脲在堿性溶液中與Cu2+產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成 正比，該法可快速測(cè)定蛋白質(zhì)含量，但靈敏度低，適用于精度要求不高的蛋白質(zhì)含量測(cè)定; 紫外吸收法的原理：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸等殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì) 具有吸收紫外光的能力，該法簡(jiǎn)便、快速，缺點(diǎn)是測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量 差異較大的蛋白質(zhì)時(shí)存在誤差;BCA法原理：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，與 BCA作用形成紫紅色復(fù)合物，在一定條件下，此復(fù)合物在562nm處的光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì) 濃度成正比，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度，該法操作簡(jiǎn)單，但易受樣品中碳水化合 物的干擾;Lowry法原理：在堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅試劑生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，該 絡(luò)合物上的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸殘基將磷鉬酸-磷鎢酸試劑還原，生成深藍(lán)色的化 合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，由于腐殖酸的存在，該法蛋白質(zhì)測(cè)量值高于實(shí)際 值，為了降低腐殖酸的影響，改良Lowry法被運(yùn)用于污泥蛋白質(zhì)的分析(Frolund B,Griebe T, Nielsen P.H.,Enzymatic activity in the activated-sludge floc matrix,Appl.Microbiol.Biotechnol., 1995,43(4):755-61);考馬斯亮藍(lán)G-250法原理：考馬斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白 質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色變?yōu)樗{(lán)色，結(jié)合物在 595nm波長(zhǎng)下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定，該法靈敏度比 Lowry法高，缺點(diǎn)是由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同 蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的誤差。
由于污水廠二級(jí)出水蛋白質(zhì)組成復(fù)雜、種類繁多且存在較多碳水化合物，因此紫外吸收 法、考馬斯亮藍(lán)G-250法和BCA法不適合二級(jí)出水蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。污水廠二級(jí)出水蛋白 質(zhì)的含量往往很低(≤12mg/L)，改良Lowry法用于測(cè)定出水蛋白質(zhì)時(shí)誤差較大，Westgate等 人發(fā)現(xiàn)用改良Lowry法測(cè)定二級(jí)出水中蛋白質(zhì)含量時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)負(fù)值的情況(Westgate,P.J., Park,C.,2010.Evaluation of proteins and organic nitrogen in wastewater treatment effluents. Environ.Sci.Technol.44,5352-5357)。凱氏定氮法、雙縮脲法和Lowry法由于其誤差較大，對(duì) 于低濃度蛋白質(zhì)的測(cè)定也存在局限性。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01310598562.6公開了一種利用考馬 斯亮藍(lán)法測(cè)定污泥中蛋白質(zhì)的方法，考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)- 色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收，其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋 白質(zhì)的定量測(cè)定，該方法靈敏度比Lowry法高，但是缺點(diǎn)是由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的誤差，適用范圍受到限制。因此急 需要開發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、適用范圍廣的測(cè)定二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)含量的方法。
發(fā)明內(nèi)容
1.要解決的問題
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)存在的靈敏度低、測(cè)定準(zhǔn)確性和精度低、操作不便以 及適用范圍小等問題，本發(fā)明提供一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，采用響 應(yīng)面法分析蛋白質(zhì)含量，克服了真實(shí)污水中蛋白測(cè)定準(zhǔn)確性低和精度低的問題，該檢測(cè)方法 簡(jiǎn)單易操作，適用于城市生活污水廠二級(jí)出水低濃度蛋白質(zhì)的測(cè)定。
2.技術(shù)方案
為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
一種測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，其步驟為：
(a)制備試劑：將Na2CO3和NaOH溶解于蒸餾水中得到試劑甲，將CuSO4·5H2O和酒 石酸銻鉀溶解于蒸餾水中得到試劑乙，試劑甲和試劑乙混合得到試劑丙，將福林酚與蒸餾水 按體積比為3:1配制得到福林酚使用液;
(b)建立數(shù)學(xué)模型：利用Minitab響應(yīng)面法建立牛血清蛋白BSA和腐殖酸HS的濃度與 對(duì)應(yīng)吸光度值之間的數(shù)學(xué)模型，具體步驟為：
(1)用蒸餾水分別配制BSA標(biāo)準(zhǔn)液和HS標(biāo)準(zhǔn)液，備用;
(2)利用Minitab設(shè)計(jì)至少12組含有不同濃度BSA和HS的樣品，其中BSA的濃度范 圍為0.5-25mg/L，HS的濃度范圍為2-25mg/L;
(3)用步驟(1)中配制的BSA標(biāo)準(zhǔn)液和HS標(biāo)準(zhǔn)液按照步驟(2)中設(shè)計(jì)的濃度配制 樣品;
(4)將步驟(3)中配制的樣品每組分別取2.5mL于試管中，然后往試管中加入2.5mL 步驟(a)中配制的試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，在室溫放置10分鐘后，向其加入0.3 mL步驟(a)中配制的福林酚使用液并立即混勻，在室溫下放置45分鐘后，測(cè)定其在750nm 處的吸光度值A(chǔ)1，利用Minitab響應(yīng)面法擬合得到吸光度A1與BSA和HS濃度關(guān)系的線性 方程1：A1=k1+m1*CBSA+n1*CHS，其中k1、m1和n1是二元線性回歸方程系數(shù)，CBSA和CHS分 別代表BSA和HS的濃度;
(5)將步驟(3)中配制的樣品每組分別取2.5mL于試管中，然后往試管中加入2.5mL 步驟(a)中配制的試劑丙，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫放置10分鐘后加入0.3mL步 驟(a)中配制的福林酚使用液并立即混勻，在室溫下放置45分鐘后，測(cè)定其在750nm處的 吸光度值A(chǔ)2，利用Minitab響應(yīng)面法擬合得到吸光度A2與BSA和HS濃度關(guān)系的線性方程2： A2=k2+m2*CBSA+n2*CHS，其中k2、m2和n2是二元線性回歸方程系數(shù)，CBSA和CHS分別代表 BSA和HS的濃度;
(6)由步驟(4)中得到的線性方程1和步驟(5)中得到的線性方程2可以計(jì)算得到 BSA濃度與吸光度值A(chǔ)1和A2之間的關(guān)系為：CBSA=(k2*n1-k1*n2+n2*A1-n1*A2)/(m1*n2-m2*n1);
(c)預(yù)處理樣品：將污水廠二級(jí)出水依次用濾膜和透析袋進(jìn)行預(yù)處理去除污水中的懸浮 物和雜質(zhì)離子;
(d)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度：取2.5mL經(jīng)過步驟(c)預(yù)處理得到的水樣于兩只試管中，一只 試管中加入2.5mL步驟(a)中配制的試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫放置10分 鐘后加入0.3mL步驟(a)中配制的福林酚使用液并立即混勻，在室溫下放置45分鐘后，測(cè) 定其在750nm處的吸光度值，另一只試管中加入2.5mL步驟(a)中配制的試劑丙，在旋渦 混合器上迅速混合，于室溫放置10分鐘后加入0.3mL步驟(a)中配制的福林酚使用液并立 即混勻，在室溫下放置45分鐘后，測(cè)定其在750nm處的吸光度值，根據(jù)測(cè)得的吸光度值利 用步驟(b)中建立的數(shù)學(xué)模型計(jì)算出該水樣的蛋白質(zhì)濃度。
優(yōu)選地，所述的步驟(a)中制備試劑甲的Na2CO3質(zhì)量為10g，NaOH質(zhì)量為2g，蒸餾 水500mL;制備試劑乙的CuSO4·5H2O質(zhì)量為0.781g，酒石酸銻鉀質(zhì)量為1g，蒸餾水100mL。
優(yōu)選地，所述的步驟(a)中的試劑丙由49mL試劑甲和2mL試劑乙混合得到。
優(yōu)選地，所述的步驟(1)中BSA標(biāo)準(zhǔn)液和HS標(biāo)準(zhǔn)液的濃度均為62.5mg/L。
優(yōu)選地，所述的步驟(c)中的濾膜孔徑為0.45μm。
優(yōu)選地，所述的步驟(c)中的透析袋為懸浮式，材質(zhì)為纖維素，截留分子量為100，透 析時(shí)間為2.5-4.5h。
3.有益效果
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
(1)本發(fā)明綜合了不同蛋白質(zhì)的測(cè)定方法，基于Lowry法和改良Lowry法，采用響應(yīng) 面法分析蛋白質(zhì)含量，能有效降低由于二級(jí)出水蛋白質(zhì)組成復(fù)雜、種類繁多帶來的測(cè)定誤差， 步驟簡(jiǎn)便、易于操作;
(2)本發(fā)明利用Minitab軟件建立測(cè)定低濃度蛋白的數(shù)學(xué)模型，能降低污水中腐殖酸、 碳水化合物和Ca2+、Mg2+等離子的干擾，測(cè)定方法準(zhǔn)確度高;
(3)本發(fā)明中的測(cè)定蛋白質(zhì)方法靈敏度高，適用于低濃度蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，且能同時(shí) 測(cè)定出二級(jí)出水腐殖酸的濃度，適用范圍廣;
(4)本發(fā)明中的測(cè)定污水廠二級(jí)出水中低濃度蛋白質(zhì)的方法，步驟簡(jiǎn)潔，操作方便，適 用性強(qiáng)。
