申請日2014.02.26

　　公開(公告)日2015.08.12

　　IPC分類號C12N15/10

　　摘要

　　本發(fā)明涉及一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法，步驟如下：(1)取活性污泥，然后加入氯化鈉溶液洗滌，制得初洗污泥;(2)向初洗污泥中加入提取緩沖液和溶菌酶溶液;然后加入十二烷基硫酸鈉溶液，離心取上清液;(3)加入Tris-飽和酚溶液，再加入Tris-飽和酚溶液，離心取上清，制得提取液A;(4)加入混合溶液I，再加入混合溶液II，離心取上清，加入乙酸鈉溶液，再加入預冷無水乙醇，離心取沉淀，制得粗提物;(5)加入乙醇溶液，離心，收集沉淀，再加入TE緩沖液和RNaseA溶液，即得。本發(fā)明提高了活性污泥宏基因組DNA樣品的產(chǎn)量和質(zhì)量。

　　權(quán)利要求書

　　1.一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟如下：

　　(1)取0.5～2g活性污泥，離心，收集沉淀;然后加入5～20ml的質(zhì)量濃度為0.9%的 氯化鈉溶液洗滌1～5min，離心，收集沉淀，重復3～5次，制得初洗污泥;

　　(2)向步驟(1)制得的初洗污泥中加入600～2400μL提取緩沖液和20～80μL溶菌 酶溶液，混合均勻，36～38℃水浴保溫25～40min;然后加入200～800μL的質(zhì)量濃度為10% 的十二烷基硫酸鈉溶液，混合均勻，離心，取上清液;

　　所述提取緩沖液含有濃度為80～120mmol/L的三羥甲基氨基甲烷、濃度為80～120mmol/L 的乙二胺四乙酸二鈉、濃度為150～250mmol/L的NaCl、質(zhì)量濃度為1%的聚乙烯吡咯烷酮和 質(zhì)量濃度為2%的十六烷基三甲基溴化銨，pH7.5～8.5;

　　(3)向步驟(2)的上清液中加入800～3300μL Tris-飽和酚溶液，混合均勻，離心， 取上清，再加入等體積500～2000μL Tris-飽和酚溶液，混合均勻，離心，取上清，制得提 取液A;

　　(4)向步驟(3)制得的提取液A中加入等體積混合溶液I，混合均勻，離心，取上清， 再加入等體積混合溶液II，混合均勻，離心，取上清，加入上清1/10～1/5體積的乙酸鈉溶 液，再加入上清2～3倍體積的預冷無水乙醇，冰上放置30～40min;低溫離心，取沉淀，制 得粗提物;

　　所述混合溶液I是酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1的比例混合的混合溶液;

　　所述混合溶液II是氯仿、異戊醇按體積比25:1的比例混合的混合溶液;

　　(5)向步驟(4)制得的粗提物中加入500～2000μL的體積百分比為70%的乙醇溶液， 懸浮沉淀，離心，收集沉淀，重復1～3次;然后加入500～2000μL的無水乙醇，懸浮沉淀， 離心，收集沉淀，室溫干燥，再加入60～240μL的TE緩沖液和3～12μL的RNaseA溶液， 制得宏基因組DNA。

　　2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(1)中的離心，條件均為： 8000～10000g離心1～1.5min。

　　3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(2)中溶菌酶溶液濃度為10～ 15mg/ml。

　　4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(2)、(3)和(4)中的離心， 條件均為：8000～10000g離心10～15min。

　　5.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(4)中的低溫離心，條件為： -4～0℃，10000～12000g離心10～15min。

　　6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(4)中的乙酸鈉溶液濃度為 3mol/L，pH5.2。

　　7.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(5)中的離心，條件均為： 10000～12000g離心1～1.5min。

　　說明書

　　一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法

　　技術(shù)領域

　　本發(fā)明涉及一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法，屬于生物技術(shù) 技術(shù)領域。

　　背景技術(shù)

　　環(huán)氧丙烷皂化廢水是一種由氯醇法生產(chǎn)環(huán)氧丙烷過程產(chǎn)生的大量污水。根據(jù)相關(guān)報道， 每生產(chǎn)1t環(huán)氧丙烷就產(chǎn)生50-80t廢水。該廢水具有pH值高、氯化鈣含量高、COD高的特點， 其中含有大量難以生化降解的氯化物，如氯丙醇、二氯異丙醚、二氯丙烷等。這種高鹽、富 含有機物的廢水可造成嚴重的環(huán)境污染，采用合理有效的方式處理這種廢水不容忽視。

　　生物活性污泥法是當前環(huán)氧丙烷皂化廢水處理的主要方式，但這種方法受到微生物活性 及其耐鹽度的限制，處理效果有待提高。采用有效的方法研究分析活性污泥微生物群落的主 要的建群種，有針對性的進行馴化培養(yǎng)，可大大提高活性污泥菌種的活性及耐鹽度，進而提 高活性污泥處理廢水的工作能力。

　　活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)復雜，而且絕大多數(shù)的微生物是不能被傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)的， 通過傳統(tǒng)的富集、分離、培養(yǎng)很難對污泥微生物群落進行準確分析。宏基因組技術(shù)突破了傳 統(tǒng)微生物培養(yǎng)的局限性，是當前進行微生物群落分析最有效的方式之一，而獲得高質(zhì)量的宏 基因組DNA，是準確分析微生物群落的必要條件。

　　中國專利文獻CN101392248A(申請?zhí)?00810064771.1)公開了一種厭氧活性污泥DNA 的提取方法，按照以下步驟進行：一、污泥清洗;二、裂解細胞;三、DNA的純化;即提取出厭 氧活性污泥DNA。

　　中國專利文獻CN102732504A(申請?zhí)?01110096525.6)公開了一種由油/氣藏復雜環(huán)境 樣品中直接提取微生物宏基因組的簡易方法，包括以有機相/水相萃取獲得油樣/油水樣中微 生物組份，真空過濾水相富集微生物，以溶菌酶、蛋白酶、十二烷基硫酸鈉(SDS)等裂解細胞， 在高鹽條件下通過十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)去除蛋白質(zhì)以及多糖等有機大分子組份，隨 后通過核酸抽提及沉淀，獲得無偏好的油/氣藏微生物宏基因組成分。

　　但上述方法應用與環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA提取是，均出現(xiàn)DNA樣品條 帶彌散，無法獲得較高質(zhì)量的宏基因組DNA樣本的問題。

　　發(fā)明內(nèi)容

　　本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取 方法。

　　本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

　　一種環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟如下：

　　(1)取0.5～2g活性污泥，離心，收集沉淀;然后加入5～20ml的質(zhì)量濃度為0.9%的 氯化鈉溶液洗滌1～5min，離心，收集沉淀，重復3～5次，制得初洗污泥;

　　(2)向步驟(1)制得的初洗污泥中加入600～2400μL提取緩沖液和20～80μL溶菌 酶溶液，混合均勻，36～38℃水浴保溫25～40min;然后加入200～800μL的質(zhì)量濃度為10% 的十二烷基硫酸鈉溶液，混合均勻，離心，取上清液;

　　所述提取緩沖液含有濃度為80～120mmol/L的三羥甲基氨基甲烷、濃度為80～120mmol/L 的乙二胺四乙酸二鈉、濃度為150～250mmol/L的NaCl、質(zhì)量濃度為1%的聚乙烯吡咯烷酮和 質(zhì)量濃度為2%的十六烷基三甲基溴化銨，pH7.5～8.5;

　　(3)向步驟(2)的上清液中加入800～3300μL Tris-飽和酚溶液，混合均勻，離心， 取上清，再加入等體積500～2000μL Tris-飽和酚溶液，混合均勻，離心，取上清，制得提 取液A;

　　(4)向步驟(3)制得的提取液A中加入等體積混合溶液I，混合均勻，離心，取上清， 再加入等體積混合溶液II，混合均勻，離心，取上清，加入上清1/10～1/5體積的乙酸鈉溶 液，再加入上清2～3倍體積的預冷無水乙醇，冰上放置30～40min;低溫離心，取沉淀，制 得粗提物;

　　所述混合溶液I是酚、氯仿、異戊醇按體積比25:24:1的比例混合的混合溶液;

　　所述混合溶液II是氯仿、異戊醇按體積比25:1的比例混合的混合溶液;

　　(5)向步驟(4)制得的粗提物中加入500～2000μL的體積百分比為70%的乙醇溶液， 懸浮沉淀，離心，收集沉淀，重復1～3次;然后加入500～2000μL的無水乙醇，懸浮沉淀， 離心，收集沉淀，室溫干燥，再加入60～240μL的TE緩沖液和3～12μL的RNaseA溶液， 制得宏基因組DNA。該宏基因組DNA需置于-20℃進行冷凍保存。

　　根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的離心，條件均為：8000～10000g離心1～1.5min。

　　根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中溶菌酶溶液濃度為10～15mg/ml。溶菌酶的作用是 通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細胞壁不溶 性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。溶菌酶為市售產(chǎn)品， 本領域技術(shù)人員可以根據(jù)該溶菌酶的目的選擇合適廠家生產(chǎn)的溶菌酶。

　　根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)、(3)和(4)中的離心，條件均為：8000～10000g 離心10～15min。

　　根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中的低溫離心，條件為：-4～0℃，10000～12000g 離心10～15min。

　　根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中的乙酸鈉溶液濃度為3mol/L，pH5.2。

　　根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(5)中的離心，條件均為：10000～12000g離心1～1.5min。

　　如無特殊說明，上述工藝條件均可采用本領域慣用條件，常用試劑如：Tris-飽和酚溶液、 TE緩沖液、RNaseA溶液等如無特殊說明，均采用本領域常用試劑。

　　有益效果

　　本發(fā)明克服了現(xiàn)有宏基因組DNA提取方法無法提取環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥中宏基因 組DNA的弊端，通過采用質(zhì)量濃度為0.9%的氯化鈉溶液—提取緩沖液—溶菌酶—十二烷基硫 酸鈉溶液對活性污泥樣品進行預處理和微生物細胞壁破碎，將獲得的高純度、高含量的宏基 因組DNA樣品用酚、氯仿、異戊醇的混合溶液反復多次處理，并將上述處理后DNA樣品進行 無水乙醇/乙酸鈉沉淀提取獲得宏基因組DNA。本發(fā)明所述方法大大提高了活性污泥宏基因組 DNA樣品的產(chǎn)量和質(zhì)量，獲得豐富度較高的環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥宏基因組DNA樣品， 并且操作簡單、可行性強，成本低，具有廣闊的應用前景。