申請日2013.11.28
公開(公告)日2014.03.05
IPC分類號G01N33/18
摘要
本發(fā)明屬環(huán)境毒理學領(lǐng)域，涉及一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法。它以斑馬魚為測試生物，將其暴露于典型抗生素廢水中，通過分析典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性、亞急性毒性，定量地測定典型抗生素廢水對斑馬魚的短期或長期毒性效應(yīng)，急性毒性以96小時半數(shù)致死濃度(96h LC50)(典型抗生素廢水體積百分比%)描述，亞急性毒性以魚體生化指標，如超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量等描述。采用該方法可以對典型抗生素廢水的毒性特征和毒性水平進行分析測試和定量描述，解決常規(guī)理化指標不能反映的典型抗生素廢水生物毒性，同時可作為典型抗生素廢水生物毒性監(jiān)測和評價的指標。
權(quán)利要求書
1.一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，其特征是，
該方法采用斑馬魚體內(nèi)試驗方法，分別利用短期即96小時和長期即20 天的暴露方式描述典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性和亞急性毒性，判 斷典型抗生素廢水對斑馬魚是否具有毒性的判據(jù)為：急性毒性以96h LC50描述;亞急性毒性以一組抗氧化指標描述;
利用短期暴露方式，測定得到典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性， 急性毒性測定得到96h LC50;以96h LC50描述急性毒性;
利用長期暴露方式，亞急性毒性以魚體的一組抗氧化指標表示，然后 利用顯著性t檢驗，檢驗暴露組與空白對照組間的差異，當t
本測試方法為，如果暴露組與空白對照組差異顯著，即0.01 2.如權(quán)利要求1所述的利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法， 其特征是，它包括以下具體步驟： (1)準備測試生物，選用斑馬魚為受試生物，雌雄個體各半，斑馬魚經(jīng) 5%食鹽水消毒后，用曝氣48h的脫氯自來水在實驗室馴養(yǎng)7天，在預實驗 前一天和試驗期間不予喂食，避免魚餌對測試結(jié)果產(chǎn)生影響; (2)準備測試條件，試驗溶液pH值為7.0～8.5;總硬度以CaCO3計為 240～250mg/L，試驗溫度為23～25℃;溶解氧高于5mg/L;采用自然光 照;試驗周期為96h或20d;試驗方式為靜水式，即每24h更換一次試液， 每天至少測定1次試驗溶液的水溫、硬度、pH值、溶解氧含量; (3)進行預實驗，在50cm×20cm×25cm的玻璃水族缸中，盛放20L 試驗溶液，分為5～6個暴露組，暴露組濃度以試驗溶液中含典型抗生素廢 水的體積百分比表示。三種典型抗生素廢水暴露組分別設(shè)置如下：青霉素 廢水暴露濃度組為5%、10%、15%、20%、25%和30%;土霉素廢水暴露 濃度組為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%;鏈霉素廢水暴露濃度 組為1%、3.2%、10%、32%、100%;不設(shè)平行組，每個暴露組放5尾斑馬 魚，連續(xù)實驗96h，每日至少兩次記錄各容器內(nèi)的死魚數(shù)并及時取出死魚; 計算得出預實驗結(jié)果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度; 青霉素廢水預實驗結(jié)果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死 亡濃度分別為20%和10%; 土霉素廢水預實驗結(jié)果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死 亡濃度分別為0.1%和0.5%; 鏈霉素廢水預實驗結(jié)果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死 亡濃度分別為100%和10%; (4)急性毒性測試方法根據(jù)所述步驟(3)的測試結(jié)果，在24h絕對 致死濃度和最高的96h無死亡濃度之間按等對數(shù)間距設(shè)置5個暴露組，暴 露組濃度以試驗溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。三種典型抗 生素廢水暴露組分別設(shè)置如下：青霉素廢水暴露濃度組為10%、12.57%、 15.81%、19.88%、24.99%;土霉素廢水暴露濃度組為0.1%、0.15%、0.22%、 0.33%、0.5%;鏈霉素廢水暴露濃度組為17.78%、23.71%、31.62%、42.17%、 56.23%;每個暴露組設(shè)2個平行組，并設(shè)置空白對照組，共計11個組，每 個暴露組隨機放入8尾斑馬魚，試驗周期為96h，試驗結(jié)果以半數(shù)致死濃 度表示，每隔24h更換1次試驗溶液，采用寇式法和概率單位法兩種方法 計算得出96h LC50及其95%的置信限; 急性毒性測試結(jié)果為：青霉素廢水96h LC50為以寇式法計算的13.46% 和以概率單位法計算的13.66%;土霉素廢水96h LC50為以寇式法計算的 0.22%和以概率單位法計算的0.19%;鏈霉素廢水96h LC50為以寇式法計算 的25.56%和以概率單位法計算的29.51%; (5)亞急性毒性測試方法參照步驟(4)的測試結(jié)果設(shè)置亞急性的暴 露組，暴露組濃度在1/6 96h LC50和1/2 96h LC50之間，設(shè)置5個暴露組， 青霉素廢水、土霉素和鏈霉素暴露濃度組均為1/256 96h LC50、1/64 96h LC50、1/16 96h LC50、1/4 96h LC50、1/2 96h LC50，暴露組濃度以試驗溶液 中含典型抗生素廢水的體積百分比表示，每個暴露組設(shè)置2個平行組，1 個空白對照組，共計16個組。暴露時間為20天，選取健康的斑馬魚，雌 雄個體各半，每個組15尾斑馬魚，每天換水。5個暴露組分別于第4、8、 12、16和20天取生物樣進行分析，每次各暴露組分別取2尾斑馬魚，測 定POD活性、SOD活性和MDA含量，測試結(jié)果為暴露組與空白對照組相 比，POD活性、SOD活性和MDA含量有顯著差異; 所述試驗溶液為典型抗生素廢水和除氯自來水的混合溶液。 說明書 一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法 技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明屬于環(huán)境毒理學領(lǐng)域，涉及一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒 性的方法。 背景技術(shù) 抗生素廢水是一類色度高、含難降解和生物毒性物質(zhì)多的高濃度有機廢水。 2010年7月國家環(huán)保部頒布了《制藥工業(yè)水污染物排放標準》，其中規(guī)定了以抗 生素等為主的發(fā)酵類制藥工業(yè)企業(yè)水污染物的排放限值、監(jiān)測和監(jiān)控要求。涉 及毒性的排放指標只有急性毒性指標(HgCl2毒性當量)，測試方法為發(fā)光細菌 法，該指標僅能反映抗生素廢水是否對發(fā)光菌有毒性，但發(fā)光菌為低等生物， 其結(jié)果不能代表抗生素廢水對高等生物的影響，為此需要尋找新的方法和指標 來評價抗生素廢水的生物毒性。 發(fā)明內(nèi)容 本發(fā)明為解決現(xiàn)在抗生素廢水生物毒性定性和定量評估的問題，提供了一 種采用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法。該方法采用急性毒性、亞急性 毒性測試，定性和定量兩種指標描述典型抗生素廢水的生物毒性，彌補抗生素 廢水生物毒性監(jiān)測指標的不足。 本發(fā)明的思路是，采用短期(96小時)暴露方式，測定得到典型抗生素廢 水對斑馬魚的急性毒性，以96h LC50(典型抗生素廢水的體積百分比%)描述， 采用長期(20天)暴露方式，亞急性毒性以魚體的一組抗氧化指標表示。 判斷典型抗生素廢水對斑馬魚是否具有毒性的判據(jù)為：急性毒性測定得到 96h LC50(典型抗生素廢水的體積百分比%);亞急性毒性為典型抗生素廢水對 斑馬魚魚體抗氧化指標的影響是否顯著。如果暴露組與空白對照組差異顯著： 認為典型抗生素廢水有亞急性生物毒性。暴露組與空白對照組差異不顯著：認 為典型抗生素廢水無亞急性生物毒性。依據(jù)上述判據(jù)評估典型抗生素廢水對斑 馬魚的毒性類型以及毒性水平，從而可以確定典型抗生素廢水的毒性類型(屬 于急性毒性還是亞急性毒性)和毒性水平(毒性的顯著性水平)。 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)： 一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，該方法采用斑馬魚 體內(nèi)試驗方法，分別利用短期(96小時)和長期(20天)暴露方式描述典 型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性和亞急性毒性，判斷典型抗生素廢水對 斑馬魚是否具有毒性的判據(jù)為：急性毒性以96h LC50(典型抗生素廢水體 積百分比%)描述;亞急性毒性以一組抗氧化指標描述; 利用短期(96小時)暴露方式，測定得到典型抗生素廢水對斑馬魚的 急性毒性，急性毒性測定得到96h LC50(典型抗生素廢水體積百分比%); 以96h LC50描述急性毒性; 利用長期(20天)暴露方式，亞急性毒性以魚體的一組抗氧化指標表 示，然后利用顯著性t檢驗，檢驗暴露組與空白對照組間的差異，當t 本測試方法為，如果暴露組與空白對照組差異顯著(0.01 所述的利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，它包括以下具體 步驟： (1)準備測試生物，選用斑馬魚(Zebra Fish)為受試生物，雌雄個體 各半，斑馬魚經(jīng)5%食鹽水消毒后，用曝氣48h的脫氯自來水在實驗室馴養(yǎng) 7天，在預實驗前一天和試驗期間不予喂食，避免魚餌對測試結(jié)果產(chǎn)生影 響; (2)準備測試條件，試驗溶液pH值為7.0～8.5;總硬度為240～250 mg/L(以CaCO3計)，試驗溫度為23～25℃;溶解氧高于5mg/L;采用 自然光照;試驗周期為96h(預實驗和急性毒性實驗持續(xù)時間)或20d(亞 急性毒性實驗持續(xù)時間);試驗方式為靜水式(每24h更換一次試液)， 每天至少測定1次試驗溶液的水溫、硬度、pH值、溶解氧含量; (3)進行預實驗，在50cm×20cm×25cm的玻璃水族缸中，盛放20L 試驗溶液，分為5～6個暴露組，暴露組濃度以試驗溶液中含典型抗生素廢 水的體積百分比表示。三種典型抗生素廢水暴露組分別設(shè)置如下：青霉素 廢水暴露濃度組為5%、10%、15%、20%、25%和30%;土霉素廢水暴露 濃度組為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%;鏈霉素廢水暴露濃度 組為1%、3.2%、10%、32%、100%;不設(shè)平行組，每個暴露組放5尾斑馬 魚，連續(xù)實驗96h，每日至少兩次記錄各容器內(nèi)的死魚數(shù)并及時取出死魚; 計算得出預實驗結(jié)果：最低的24h絕對致死濃度(典型抗生素廢水的體積 百分比%)和最高的96h無死亡濃度(典型抗生素廢水的體積百分比%)。 青霉素廢水預實驗結(jié)果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死 亡濃度分別為20%(青霉素廢水的體積百分比%)和10%(青霉素廢水的 體積百分比%)。 土霉素廢水預實驗結(jié)果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死 亡濃度分別為0.1%(土霉素廢水的體積百分比%)和0.5%(土霉素廢水的 體積百分比%)。 鏈霉素廢水預實驗結(jié)果：最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死 亡濃度分別為100%(鏈霉素廢水的體積百分比%)和10%(鏈霉素廢水的 體積百分比%)。 (4)急性毒性測試方法根據(jù)所述步驟(3)的測試結(jié)果，在24h絕對 致死濃度(典型抗生素廢水的體積百分比%)和最高的96h無死亡濃度(典 型抗生素廢水的體積百分比%)之間按等對數(shù)間距設(shè)置5個暴露組，暴露 組濃度以試驗溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。三種典型抗生 素廢水暴露組分別設(shè)置如下：青霉素廢水暴露濃度組為10%、12.57%、 15.81%、19.88%、24.99%;土霉素廢水暴露濃度組為0.1%、0.15%、0.22%、 0.33%、0.5%;鏈霉素廢水暴露濃度組為17.78%、23.71%、31.62%、42.17%、 56.23%。每個暴露組設(shè)2個平行組，并設(shè)置空白對照組，共計11個組，每 個暴露組隨機放入8尾斑馬魚，試驗周期為96h，試驗結(jié)果以半數(shù)致死濃 度(典型抗生素廢水的體積百分比%)表示，每隔24h更換1次試驗溶液， 采用寇式法和概率單位法兩種方法計算得出96h LC50(典型抗生素廢水的 體積百分比%)及其95%的置信限。 急性毒性測試結(jié)果為：青霉素廢水96h LC50為13.46%(寇式法)和 13.66%(概率單位法);土霉素廢水96h LC50為0.22%(寇式法)和0.19% (概率單位法);鏈霉素廢水96h LC50為25.56%(寇式法)和29.51%(概 率單位法)。 (5)亞急性毒性測試方法參照步驟(4)的測試結(jié)果設(shè)置亞急性的暴 露組，暴露組濃度在1/6 96h LC50和1/2 96h LC50之間，設(shè)置5個暴露組， 青霉素廢水、土霉素和鏈霉素暴露濃度組均為1/256 96h LC50、1/64 96h LC50、1/16 96h LC50、1/4 96h LC50、1/2 96h LC50。暴露組濃度以試驗溶液 中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。每個暴露組設(shè)置2個平行組，1 個空白對照組，共計16個組。暴露時間為20天，選取健康的斑馬魚，雌 雄個體各半，每個組15尾斑馬魚，每天換水。5個暴露組分別于第4、8、 12、16和20天取生物樣進行分析，每次各暴露組分別取2尾斑馬魚，測 定POD活性、SOD活性和MDA含量，測試結(jié)果為暴露組與空白對照組相 比，POD活性、SOD活性和MDA含量有顯著差異; 所述試驗溶液為典型抗生素廢水和除氯自來水的混合溶液。 測試結(jié)果為對比暴露組與空白對照組的POD活性、SOD活性和MDA含量， 利用顯著性t檢驗，檢驗暴露組與空白對照組間的差異，當t 本發(fā)明測試方法為，如果暴露組與空白對照組差異顯著(0.01 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的顯著效果為： 本發(fā)明方法可以對典型抗生素廢水的毒性特征和毒性水平進行分析測試和 定量描述，解決常規(guī)理化指標，如化學需氧量(COD)、生化需氧量(BOD)、 pH等不能反映的典型抗生素廢水生物毒性，同時可以作為典型抗生素廢水生物 毒性監(jiān)測和評價的指標。
