申請日2015.07.08

　　公開(公告)日2015.09.23

　　IPC分類號(hào)C12N1/20; C12R1/01; C12Q1/02

　　摘要

　　本發(fā)明涉及一株海洋污泥來源的水萊茵海默式菌菌株(Rheinheimera aquimaris)QSI02及其在細(xì)菌群體感應(yīng)抑制篩選方面的應(yīng)用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏日期為2015年4月23日，保藏號(hào)為CCTCC NO:M2015245。本發(fā)明是首次報(bào)道Rheinheimera屬的菌株具有細(xì)菌群體感應(yīng)抑制活性。由該菌株發(fā)酵液制備的代謝物對紫色桿菌和銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)具有雙重抑制作用，并且在有效濃度范圍內(nèi)對篩選模型紫色桿菌CV026的菌體生成不產(chǎn)生抑制作用。該菌株提取物能夠顯著降低紫色桿菌紫色素的產(chǎn)量以及銅綠假單胞菌的群集運(yùn)動(dòng)，減弱致病菌的耐藥性，從而在解決細(xì)菌耐藥性問題、研發(fā)新型抗菌藥物方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

　　權(quán)利要求書

　　1.一株海洋污泥來源的水萊茵海默氏菌(Rheinheimera aquimaris)QSI02，其特征在于：該菌株已于2015年4月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)是CCTCC NO:M2015245。

　　2.水萊茵海默氏菌(Rheinheimera aquimaris)QSI02的發(fā)酵提取物在細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑篩選方面的應(yīng)用。

　　說明書

　　一株海洋污泥來源的水萊茵海默氏菌菌株及其應(yīng)用

　　技術(shù)領(lǐng)域

　　本發(fā)明屬于海洋微生物領(lǐng)域，具體涉及一株海洋污泥來源的水萊茵海默氏菌(Rheinheimera aquimaris)QSI02菌株及其代謝產(chǎn)物在細(xì)菌群體感應(yīng)抑制篩選方面的應(yīng)用。

　　背景技術(shù)

　　群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)是廣泛存在于細(xì)菌間的一種信息交流現(xiàn)象。近年來的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以通過生產(chǎn)、識(shí)別、感應(yīng)一種或多種可溶性的化學(xué)信號(hào)分子來實(shí)現(xiàn)相互間信息的傳遞和交流。盡管早在20世紀(jì)60年代就已經(jīng)在一種海洋費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)中發(fā)現(xiàn)了群體感應(yīng)現(xiàn)象，但是直到1994 年細(xì)菌群體感應(yīng)這一概念才被提出(J. Bacteriol.,1994,176:269-275)。許多細(xì)菌都能合成并釋放一種稱作自誘導(dǎo)物質(zhì)(auto inducer, AI)的信號(hào)分子，當(dāng)一個(gè)特定環(huán)境中細(xì)菌的數(shù)量急劇增加時(shí)，其所分泌的信號(hào)分子的濃度也會(huì)相應(yīng)的升高，當(dāng)?shù)玫揭欢ǖ拈撝禃r(shí)細(xì)菌與細(xì)菌之間就會(huì)通過這種信號(hào)分子來調(diào)控基因的表達(dá)，比如生物發(fā)光、生物被膜形成、抗生素產(chǎn)生、毒素產(chǎn)生、生產(chǎn)孢子等。

　　近些年來細(xì)菌耐藥性問題日益突出，傳統(tǒng)的抗菌藥物由于產(chǎn)生生存壓力很容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此，以傳統(tǒng)的靶點(diǎn)和篩選方法獲得的抗菌藥物無法從根本上解決細(xì)菌性感染疾病問題。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌QS系統(tǒng)使作為單細(xì)胞生物的細(xì)菌，具備了部分類似于多細(xì)胞生物的功能，讓細(xì)菌在應(yīng)對環(huán)境挑戰(zhàn)時(shí)，能協(xié)調(diào)一致，使細(xì)菌形成一種群體行為來有效的抵御外界環(huán)境壓力、攻擊宿主等。以細(xì)菌QS系統(tǒng)為靶標(biāo)篩得的抗菌藥物，與傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)制完全不同，它不殺死細(xì)菌或抑制單個(gè)細(xì)菌的生長，只抑制細(xì)菌QS調(diào)控的致病行為，不易誘導(dǎo)耐藥突變。

　　海洋相對獨(dú)特的高鹽、高壓、寡營養(yǎng)、低光照等復(fù)雜生態(tài)環(huán)境造就了海洋微生物不同于陸生微生物的獨(dú)特的生理功能與代謝機(jī)制，大大提高了結(jié)構(gòu)多樣性和活性多樣性的先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)概率。目前，已從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了大量的具有化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、生物活性特異的化合物，其中有些已經(jīng)作為藥物廣泛應(yīng)用于臨床。同時(shí)，海洋微生物種類多、易于培養(yǎng)，可通過人工發(fā)酵培養(yǎng)獲得活性代謝產(chǎn)物因此海洋微生物資源已成為一種重要的環(huán)境友好的生物資源。

　　發(fā)明內(nèi)容

　　本發(fā)明旨在提供一株具有細(xì)菌群體感應(yīng)抑制活性的海洋細(xì)菌，該菌株代謝產(chǎn)物具有抑制紫色桿菌和銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的活性，并且能夠降低致病菌致病行為的產(chǎn)生，減弱致病菌的耐藥性。

　　本發(fā)明從黃海青島海域海洋污泥樣品中分離海洋細(xì)菌，采用紫色桿菌CV026篩選模型對分離得到的菌株進(jìn)行細(xì)菌群體感應(yīng)抑制活性的篩選，得到一株具有高效淬滅細(xì)菌群體感應(yīng)活性的菌株。通過16S rDNA序列分析結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征，鑒定其為Rheinheimera aquimaris QSI02，與GenBank中一株水萊茵海默氏菌的相似性達(dá)到99%。

　　本發(fā)明所述的具有細(xì)菌群體感應(yīng)抑制活性的海洋細(xì)菌是水萊茵海默氏菌(Rheinheimera aquimaris)QSI02，于2015年4月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢，武漢大學(xué))，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2015245。

　　本發(fā)明所述的活性代謝物的獲得方法主要包括海洋細(xì)菌R.aquimaris QSI02的分離、培養(yǎng)與提取物的制備兩個(gè)步驟。取活化后的海洋細(xì)菌R.aquimaris QSI02，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，離心、真空低溫濃縮至膏狀，用甲醇浸提得甲醇提取物，將甲醇提取物用0.22μm有機(jī)相濾器過濾后用于生物活性檢測。

　　本發(fā)明所涉及的海洋細(xì)菌R.aquimaris QSI02制備的代謝物具有抑制紫色桿菌和銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用;在加入0-300μl范圍內(nèi)該代謝物不抑制紫色桿菌CV026的菌體生長，但能顯著的降低紫色桿菌紫色素的產(chǎn)生，當(dāng)加入100μl代謝物時(shí)其抑制率達(dá)到50%。在加入200μl代謝物時(shí)能顯著減弱銅綠假單胞菌的群集運(yùn)動(dòng)。

　　本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有海洋細(xì)菌R.aquimaris QSI02菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件簡單，活性代謝物的制備工藝過程簡單易控，制備的代謝物具有明顯的淬滅細(xì)菌群體感應(yīng)的活性等特點(diǎn)。