申請(qǐng)日2015.07.18
公開(kāi)(公告)日2015.11.18
IPC分類號(hào)C12N1/20; C02F3/34; C12R1/05; C02F101/34; C12R1/40; C02F101/38; C12R1/01
摘要
一種用于廢水中生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法，其特點(diǎn)是，包括苯酚和苯胺兩種構(gòu)建方法，均含有：選擇菌株、菌株活化、菌株馴化、菌株保存、菌落形態(tài)觀察、菌懸液制備、不同菌株初始配比的混合菌懸液的制備和二元復(fù)合菌群最佳配比選擇，在兩株具有不同菌落特征，對(duì)同一種有機(jī)污染物具有降解能力的菌株的基礎(chǔ)上，將菌體以不同比例接種于含有目標(biāo)有機(jī)污染物的廢水中，在指定的反應(yīng)條件下，經(jīng)過(guò)指定的生化反應(yīng)時(shí)間后，測(cè)定不同接種比例下菌株對(duì)目標(biāo)污染物的降解情況，同時(shí)對(duì)反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)刻培養(yǎng)液中兩種菌的菌落形成單位進(jìn)行計(jì)量，最終通過(guò)污染物降解效率及兩株菌的相對(duì)菌落形成單位的計(jì)算結(jié)果確定用于目標(biāo)污染物生物降解的二元復(fù)合菌群的配比。
權(quán)利要求書(shū)
1.一種用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征在于，它包括以下 內(nèi)容：
1)選擇菌株：選擇糞產(chǎn)堿菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌，糞產(chǎn)堿菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌均來(lái)源于中 國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，糞產(chǎn)堿菌的菌株編號(hào)為CGMCCNo.1.2098，乙酸鈣不動(dòng)桿 菌的菌株編號(hào)為CGMCCNo.1.6186，將糞產(chǎn)堿菌的菌株簡(jiǎn)稱為PR1、乙酸鈣不動(dòng)桿菌的菌株 簡(jiǎn)稱為PR2;
2)菌株的活化：從營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂斜面上挑取PR1和PR2的菌苔分別接種于100mL牛肉 膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h進(jìn)行菌株的活化;
3)菌株的馴化：取活化后的PR1和PR2培養(yǎng)液各10mL，分別接種于含有苯酚的馴化培 養(yǎng)基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌株的馴化，培養(yǎng)24h后再重復(fù)上述過(guò)程 進(jìn)行第二個(gè)周期的馴化，共馴化5個(gè)周期，120h，前兩個(gè)馴化周期加入1.5mL經(jīng)過(guò)濾除菌的 10%(w/v)苯酚溶液，第三個(gè)周期加入3.0mL經(jīng)過(guò)濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液，最后兩個(gè)馴化 周期加入8mL經(jīng)過(guò)濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液;
4)菌株的保存：將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后，挑取單菌落接 種到斜面培養(yǎng)基上，待菌苔長(zhǎng)出后放入4℃冰箱中低溫保存?zhèn)溆?
5)菌落形態(tài)觀察：采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中， 置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察其菌落形態(tài)，主要通過(guò)菌落的顏色、透明度、表面 光滑性和邊緣形態(tài)對(duì)用于苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建的PR1和PR2菌株進(jìn)行區(qū)分;
6)菌懸液制備：將馴化后的PR1和PR2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于 30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液置于臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中以10000rpm離心 5min后，棄去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液重懸，再次離心后棄 去上清液，如此操作兩次清洗菌體，再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液重懸， 分別制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用，同時(shí)通過(guò)平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定菌懸液中 PR1和PR2的活菌數(shù);
7)不同PR1、PR2初始配比的混合菌懸液的制備：根據(jù)菌懸液中測(cè)定的PR1和PR2活 菌數(shù)，吸取PR1和PR2的菌懸液，使混合后的PR1、PR2菌懸液的總活菌量為2×108CFU/mL， 并使PR1和PR2活菌初始比例分別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和 10/0，其中10/0代表體系中僅有PR1，0/10代表體系中僅有PR2;
8)二元復(fù)合菌群最佳配比的選擇：將PR1和PR2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、3/7、 4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液以10%(v/v)的量分別接種于含有200mg/L 苯酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)12h后測(cè)定殘留的苯酚和TOC濃 度，同時(shí)通過(guò)倍比稀釋法依據(jù)菌落形態(tài)特征對(duì)生物降解反應(yīng)結(jié)束后體系中PR1和PR2的數(shù)量 進(jìn)行計(jì)量;定義CFUPR1為PR1在10/0體系中的活菌數(shù)，即僅接種PR1的體系，CFUPR2為 PR2在0/10體系中的活菌數(shù)，即僅接種PR2的體系，CFUPR1·PR2為PR1在PR2存在時(shí)的活菌 數(shù)，CFUPR2·PR1為PR2在PR1存在時(shí)的活菌數(shù)，PR1的相對(duì)活菌數(shù)PR2的相對(duì)活菌數(shù)當(dāng)RCFU<1時(shí)，代表一株菌生長(zhǎng)和繁殖受到了另 一株菌的抑制，而當(dāng)RCFU>1時(shí)，代表另一株菌的存在對(duì)該菌株的生長(zhǎng)和繁殖起到了促進(jìn)作 用;根據(jù)兩株菌在不同初始活菌比例下的苯酚降解率、TOC降解率以及RCFU計(jì)算結(jié)果，選 擇苯酚降解率、TOC降解率最高且RCFUPR1和RCFUPR2計(jì)算結(jié)果均大于1的初始活菌比例作 為苯酚生物降解二元復(fù)合菌群的構(gòu)建比例，此時(shí)二元復(fù)合菌群對(duì)苯酚的降解效果最佳且形成 了互利共生的關(guān)系。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征在于： 所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的組分為牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌20min后備用，制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基時(shí)加入20g瓊脂。
3.根據(jù)權(quán)利1所述的用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征在于： 所述的馴化培養(yǎng)基的組分為(NH4)2SO43g，KH2PO40.5g，NaHPO40.5g，MgSO4·7H2O0.3g， 微量元素液1mL，蒸餾水1000mL，pH7.5，121℃滅菌20min，待冷卻后加入經(jīng)過(guò)濾除菌的 10%(w/v)苯酚溶液。
4.根據(jù)權(quán)利1所述的用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征在于： 所述的微量元素液的組分為FeSO4·7H2O0.5g，MnSO4·H2O0.15g，ZnSO40.14g，CoCl20.2g， 蒸餾水1000mL。
5.根據(jù)權(quán)利1所述的用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征在于： 所述的苯酚降解率及TOC降解率采用以下公式進(jìn)行計(jì)算：
6.一種用于廢水中苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征在于：它包括以下 內(nèi)容：
1)選擇菌株：選擇惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌，惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌均 來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，糞產(chǎn)堿菌的菌株編號(hào)為CGMCCNo.1.1003，乙酸 鈣不動(dòng)桿菌的菌株編號(hào)為CGMCCNo.1.3615，將惡臭假單胞菌的菌株簡(jiǎn)稱為BA1、乙酸鈣 不動(dòng)桿菌的菌株簡(jiǎn)稱為BA2;
2)菌株的活化：從營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂斜面上挑取BA1和BA2的菌苔分別接種于100mL牛 肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h進(jìn)行菌株的活化;
3)菌株的馴化：取活化后的BA1和BA2培養(yǎng)液各10mL，分別接種于含有苯胺的馴化 培養(yǎng)基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌株的馴化，培養(yǎng)36h后再重復(fù)上述過(guò) 程進(jìn)行第二個(gè)周期的馴化，共馴化5個(gè)周期，180h，前兩個(gè)馴化周期加入1.5mL經(jīng)過(guò)濾除菌 的10%(w/v)苯胺溶液，第三個(gè)周期加入3.0mL經(jīng)過(guò)濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液，最后兩個(gè)馴 化周期加入8mL經(jīng)過(guò)濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液;
4)菌株的保存：將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后，挑取單菌落接 種到斜面培養(yǎng)基上，待菌苔長(zhǎng)出后放入4℃冰箱中低溫保存?zhèn)溆?
5)菌落形態(tài)觀察：采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中， 置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察其菌落形態(tài)，主要通過(guò)菌落的顏色、透明度、表面 光滑性和邊緣形態(tài)對(duì)用于苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建的BA1和BA2菌株進(jìn)行區(qū)分;
6)菌懸液制備：將馴化后的BA1和BA2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于 30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液置于臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中以10000rpm離心 5min后，棄去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液重懸，再次離心后棄 去上清液，如此操作兩次清洗菌體，再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液重懸， 分別制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用，同時(shí)通過(guò)平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定菌懸液中 BA1和BA2的活菌數(shù);
7)不同BA1、BA2初始配比的混合菌懸液的制備：根據(jù)菌懸液中測(cè)定的BA1和BA2 活菌數(shù)，吸取BA1和BA2的菌懸液，使混合后的BA1、BA2菌懸液的總活菌量為 2×108CFU/mL，并使BA1和BA2活菌初始比例分別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、 7/3、8/2、9/1和10/0，其中10/0代表體系中僅有BA1，0/10代表體系中僅有BA2;
8)二元復(fù)合菌群最佳配比的選擇：將BA1和BA2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、3/7、 4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液分別以10%(v/v)的量分別接種于含苯胺300mg/L 的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)36h后測(cè)定殘留的苯胺和TOC濃度， 同時(shí)通過(guò)倍比稀釋法依據(jù)菌落形態(tài)特征對(duì)生物降解反應(yīng)結(jié)束后體系中BA1和BA2的數(shù)量進(jìn) 行計(jì)量;定義CFUBA1為BA1在10/0體系中的活菌數(shù)，即僅接種BA1的體系，CFUBA2為BA2 在0/10體系中的活菌數(shù)，即僅接種BA2的體系，CFUBA1·BA2為BA1在BA2存在時(shí)的活菌數(shù)， CFUBA2·BA1為BA2在BA1存在時(shí)的活菌數(shù)，BA1的相對(duì)活菌數(shù)PR2 的相對(duì)活菌數(shù)當(dāng)RCFU<1時(shí)，代表一株菌生長(zhǎng)和繁殖受到了另一株 菌的抑制，而當(dāng)RCFU>1時(shí)，代表另一株菌的存在對(duì)該菌株的生長(zhǎng)和繁殖起到了促進(jìn)作用; 根據(jù)兩株菌在不同初始活菌比例下的苯胺降解率、TOC降解率以及RCFU計(jì)算結(jié)果，選擇苯 胺降解率、TOC降解率最高且RCFUBA1和RCFUBA2計(jì)算結(jié)果均大于1的初始活菌比例作為 苯胺生物降解二元復(fù)合菌群的構(gòu)建比例，此時(shí)二元復(fù)合菌群對(duì)苯胺的降解效果最佳且形成了 互利共生的關(guān)系。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于廢水中苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征 在于：所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的組分為牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾水 1000mL，pH7.0，121℃滅菌20min后備用，制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基時(shí)加入20g瓊脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于廢水中苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征 在于：所述的馴化液體培養(yǎng)基的組分為(NH4)2SO43g，KH2PO40.5g，NaHPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，微量元素液1mL，蒸餾水1000mL，pH7.5，121℃滅菌20min，待冷卻后加入經(jīng)過(guò)濾 除菌的10%(w/v)苯胺溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于廢水中苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征 在于：所述的微量元素液的組分為FeSO4·7H2O0.5g，MnSO4·H2O0.15g，ZnSO40.14g，CoCl20.2g，蒸餾水1000mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于廢水中苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，其特征 在于：所述的苯胺降解率及TOC降解率采用以下公式進(jìn)行計(jì)算：
說(shuō)明書(shū)
一種用于廢水中生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于廢水生物處理領(lǐng)域，是一種用于廢水中生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法。
背景技術(shù)
近年來(lái)，隨著化學(xué)工業(yè)的飛速發(fā)展，新技術(shù)和新材料的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用使得廢水中含有大量 的有機(jī)污染物。由于這些物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和生物陌生性，污染環(huán)境中能降解轉(zhuǎn)化該類 污染物的土著微生物種類和數(shù)量較少，甚至沒(méi)有能降解某些特殊污染物的土著微生物，因此， 傳統(tǒng)的廢水生化處理工藝很難將其有效的去除，這些難降解有機(jī)污染物將隨廢水處理系統(tǒng)外 排水或生物固體廢棄物以第二污染源的形式最終反饋到水體、土壤及大氣中，對(duì)人類及其他 生命體的健康和生態(tài)環(huán)境都將構(gòu)成嚴(yán)重威脅。此外，城市化進(jìn)程使得城市用地逐年緊張，傳 統(tǒng)污水處理工藝流程長(zhǎng)、占地面積大、操作復(fù)雜等矛盾也日趨突出，提標(biāo)和提效改造成為城 市污水處理廠在現(xiàn)有基礎(chǔ)上節(jié)能降耗和更好發(fā)揮其污染治理效果的必經(jīng)途徑。
大量研究表明，通過(guò)向生化處理系統(tǒng)中投加復(fù)合菌群的生物增強(qiáng)技術(shù)可以最大限度發(fā)揮 微生物的潛力，有效解決傳統(tǒng)生化處理工藝難降解有機(jī)污染物去除效率低、運(yùn)行效果不穩(wěn)定 等突出問(wèn)題。復(fù)合菌群又稱復(fù)合菌劑、復(fù)合微生物、混合菌劑等，是基于微生態(tài)學(xué)理論，利 用微生物菌群的聯(lián)合作用，由兩種或兩種上的微生物共同培養(yǎng)、相互作用、相互影響，最終 達(dá)到發(fā)揮其最大群體優(yōu)勢(shì)的微生態(tài)系統(tǒng)。在污染環(huán)境中，單一菌株往往不能完成或只能對(duì)有 機(jī)物的降解起很微弱的作用，而復(fù)合菌群可以利用多種微生物的共生互利關(guān)系，通過(guò)多步轉(zhuǎn) 化將復(fù)雜的有機(jī)物協(xié)同代謝為對(duì)環(huán)境無(wú)害的終產(chǎn)物。復(fù)合菌群的出現(xiàn)是人類對(duì)于微生物認(rèn)識(shí) 的自然結(jié)果，很多生化反應(yīng)過(guò)程是單一微生物不能完成或只能微弱進(jìn)行的，而在兩種或多種 微生物共存的條件下，微生物之間的共生、共養(yǎng)和共榮等使得生化反應(yīng)過(guò)程朝著出現(xiàn)有益效 果的方向發(fā)展。隨著純培養(yǎng)技術(shù)的完善和對(duì)微生物間互生和共生現(xiàn)象的研究，人為的微生物 混合培養(yǎng)或混合發(fā)酵日益?zhèn)涫苤匾�，由此產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)和功能多樣的復(fù)合菌群。
復(fù)合菌群的構(gòu)建原理是將不同的微生物菌株針對(duì)不同的處理體系進(jìn)行科學(xué)組合，構(gòu)建出 高效的或具有特定功能的菌群。其構(gòu)建過(guò)程首先是對(duì)微生物進(jìn)行優(yōu)選、馴化，將具有不同功 能的菌群提取出來(lái)，然后針對(duì)各類工業(yè)廢水、天然水體和市政污水等不同處理對(duì)象、環(huán)境， 經(jīng)多次組合搭配，構(gòu)建出最優(yōu)組合的復(fù)合菌群。處理對(duì)象和應(yīng)用場(chǎng)合的不同使目前復(fù)合菌群 的開(kāi)發(fā)呈多樣化的發(fā)展趨勢(shì)。目前，我國(guó)環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域?qū)?fù)合菌群的研究主要集中于兩大類： 一類是對(duì)現(xiàn)有以日本比嘉照夫教授研制的有效微生物菌群(HighEffectiveComplex Microorganisms，簡(jiǎn)稱EM)為代表的商品化復(fù)合菌劑進(jìn)行研究和應(yīng)用，另一類是根據(jù)所應(yīng)用的 環(huán)境條件和所達(dá)的目的，利用篩選到的微生物配置、優(yōu)化的微生物制劑。商品化的復(fù)合菌群 細(xì)菌種類和配比固定，難以適應(yīng)生產(chǎn)實(shí)踐中含有多種污染物的廢水處理的需要;此外，利用 篩選到的菌株進(jìn)行復(fù)合菌群的構(gòu)建時(shí)往往要經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)周期的馴化和反復(fù)的配比實(shí)驗(yàn)以獲得菌 株復(fù)合的最佳比例，且實(shí)驗(yàn)室條件下確定的最佳比例投加到實(shí)際污染場(chǎng)地后能否長(zhǎng)期維持穩(wěn) 定的群落結(jié)構(gòu)并形成良好的互利共生關(guān)系很難預(yù)知。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速和有效的復(fù)合菌 群構(gòu)建方法是將其更好地規(guī)�；瘧�(yīng)用到廢水中所含有機(jī)污染物的生物分解和轉(zhuǎn)化過(guò)程中亟待 解決的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，為強(qiáng)化微生物對(duì)廢水中苯酚和苯胺的分解和轉(zhuǎn)化，而提供科學(xué)合理， 便于實(shí)施，配比明確，降解效果好，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù)合菌 群的構(gòu)建方法和用于廢水中苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的之一是由以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù) 合菌群構(gòu)建方法，其特征在于，它包括以下內(nèi)容：
1)選擇菌株：選擇糞產(chǎn)堿菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌，糞產(chǎn)堿菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌均來(lái)源于中 國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，糞產(chǎn)堿菌的菌株編號(hào)為CGMCCNo.1.2098，乙酸鈣不動(dòng)桿 菌的菌株編號(hào)為CGMCCNo.1.6186，將糞產(chǎn)堿菌的菌株簡(jiǎn)稱為PR1、乙酸鈣不動(dòng)桿菌的菌株 簡(jiǎn)稱為PR2;
2)菌株的活化：從營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂斜面上挑取PR1和PR2的菌苔分別接種于100mL牛肉 膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h進(jìn)行菌株的活化;
3)菌株的馴化：取活化后的PR1和PR2培養(yǎng)液各10mL，分別接種于含有苯酚的馴化培 養(yǎng)基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌株的馴化，培養(yǎng)24h后再重復(fù)上述過(guò)程 進(jìn)行第二個(gè)周期的馴化，共馴化5個(gè)周期，120h，前兩個(gè)馴化周期加入1.5mL經(jīng)過(guò)濾除菌的 10%(w/v)苯酚溶液，第三個(gè)周期加入3.0mL經(jīng)過(guò)濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液，最后兩個(gè)馴化 周期加入8mL經(jīng)過(guò)濾除菌的10%(w/v)苯酚溶液;
4)菌株的保存：將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后，挑取單菌落接 種到斜面培養(yǎng)基上，待菌苔長(zhǎng)出后放入4℃冰箱中低溫保存?zhèn)溆?
5)菌落形態(tài)觀察：采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中， 置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察其菌落形態(tài)，主要通過(guò)菌落的顏色、透明度、表面 光滑性和邊緣形態(tài)對(duì)用于苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建的PR1和PR2菌株進(jìn)行區(qū)分;
6)菌懸液制備：將馴化后的PR1和PR2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于 30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液置于臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中以10000rpm離心 5min后，棄去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液重懸，再次離心后棄 去上清液，如此操作兩次清洗菌體，再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液重懸， 分別制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用，同時(shí)通過(guò)平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定菌懸液中 PR1和PR2的活菌數(shù);
7)不同PR1、PR2初始配比的混合菌懸液的制備：根據(jù)菌懸液中測(cè)定的PR1和PR2活 菌數(shù)，吸取PR1和PR2的菌懸液，使混合后的PR1、PR2菌懸液的總活菌量為2×108CFU/mL， 并使PR1和PR2活菌初始比例分別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和 10/0，其中10/0代表體系中僅有PR1，0/10代表體系中僅有PR2;
8)二元復(fù)合菌群最佳配比的選擇：將PR1和PR2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、3/7、 4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液以10%(v/v)的量分別接種于含有200mg/L 苯酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)12h后測(cè)定殘留的苯酚和TOC濃 度，同時(shí)通過(guò)倍比稀釋法依據(jù)菌落形態(tài)特征對(duì)生物降解反應(yīng)結(jié)束后體系中PR1和PR2的數(shù)量 進(jìn)行計(jì)量;定義CFUPR1為PR1在10/0體系中的活菌數(shù)，即僅接種PR1的體系，CFUPR2為 PR2在0/10體系中的活菌數(shù)，即僅接種PR2的體系，CFUPR1·PR2為PR1在PR2存在時(shí)的活菌 數(shù)，CFUPR2·PR1為PR2在PR1存在時(shí)的活菌數(shù)，PR1的相對(duì)活菌數(shù)PR2的相對(duì)活菌數(shù)當(dāng)RCFU<1時(shí)，代表一株菌生長(zhǎng)和繁殖受到了另 一株菌的抑制，而當(dāng)RCFU>1時(shí)，代表另一株菌的存在對(duì)該菌株的生長(zhǎng)和繁殖起到了促進(jìn)作 用;根據(jù)兩株菌在不同初始活菌比例下的苯酚降解率、TOC降解率以及RCFU計(jì)算結(jié)果，選 擇苯酚降解率、TOC降解率最高且RCFUPR1和RCFUPR2計(jì)算結(jié)果均大于1的初始活菌比例作 為苯酚生物降解二元復(fù)合菌群的構(gòu)建比例，此時(shí)二元復(fù)合菌群對(duì)苯酚的降解效果最佳且形成 了互利共生的關(guān)系。
所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的組分為牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾水1000mL， pH7.0，121℃滅菌20min后備用，制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基時(shí)加入20g瓊脂。
所述的馴化培養(yǎng)基的組分為(NH4)2SO43g，KH2PO40.5g，NaHPO40.5g，MgSO4·7H2O0.3g， 微量元素液1mL，蒸餾水1000mL，pH7.5，121℃滅菌20min，待冷卻后加入經(jīng)過(guò)濾除菌的 10%(w/v)苯酚溶液。
所述的微量元素液的組分為FeSO4·7H2O0.5g，MnSO4·H2O0.15g，ZnSO40.14g，CoCl20.2g，蒸餾水1000mL。
所述的苯酚降解率及TOC降解率采用以下公式進(jìn)行計(jì)算：
(1)
(2)
本發(fā)明的目的之二是，一種用于廢水中苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法，其特征 在于：它包括以下內(nèi)容：
1)選擇菌株：選擇惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌，惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動(dòng)桿菌均 來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，糞產(chǎn)堿菌的菌株編號(hào)為CGMCCNo.1.1003，乙酸 鈣不動(dòng)桿菌的菌株編號(hào)為CGMCCNo.1.3615，將惡臭假單胞菌的菌株簡(jiǎn)稱為BA1、乙酸鈣 不動(dòng)桿菌的菌株簡(jiǎn)稱為BA2;
2)菌株的活化：從營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂斜面上挑取BA1和BA2的菌苔分別接種于100mL牛 肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h進(jìn)行菌株的活化;
3)菌株的馴化：取活化后的BA1和BA2培養(yǎng)液各10mL，分別接種于含有苯胺的馴化 培養(yǎng)基中，置于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌株的馴化，培養(yǎng)36h后再重復(fù)上述過(guò) 程進(jìn)行第二個(gè)周期的馴化，共馴化5個(gè)周期，180h，前兩個(gè)馴化周期加入1.5mL經(jīng)過(guò)濾除菌 的10%(w/v)苯胺溶液，第三個(gè)周期加入3.0mL經(jīng)過(guò)濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液，最后兩個(gè)馴 化周期加入8mL經(jīng)過(guò)濾除菌的10%(w/v)苯胺溶液;
4)菌株的保存：將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后，挑取單菌落接 種到斜面培養(yǎng)基上，待菌苔長(zhǎng)出后放入4℃冰箱中低溫保存?zhèn)溆?
5)菌落形態(tài)觀察：采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中， 置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察其菌落形態(tài)，主要通過(guò)菌落的顏色、透明度、表面 光滑性和邊緣形態(tài)對(duì)用于苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建的BA1和BA2菌株進(jìn)行區(qū)分;
6)菌懸液制備：將馴化后的BA1和BA2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于 30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液置于臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中以10000rpm離心 5min后，棄去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液重懸，再次離心后棄 去上清液，如此操作兩次清洗菌體，再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液重懸， 分別制成OD600=1.2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用，同時(shí)通過(guò)平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定菌懸液中 BA1和BA2的活菌數(shù);
7)不同BA1、BA2初始配比的混合菌懸液的制備：根據(jù)菌懸液中測(cè)定的BA1和BA2 活菌數(shù)，吸取BA1和BA2的菌懸液，使混合后的BA1、BA2菌懸液的總活菌量為 2×108CFU/mL，并使BA1和BA2活菌初始比例分別為0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、 7/3、8/2、9/1和10/0，其中10/0代表體系中僅有BA1，0/10代表體系中僅有BA2;
8)二元復(fù)合菌群最佳配比的選擇：將BA1和BA2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、3/7、 4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液分別以10%(v/v)的量分別接種于含苯胺300mg/L 的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，于30℃，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)36h后測(cè)定殘留的苯胺和TOC濃度， 同時(shí)通過(guò)倍比稀釋法依據(jù)菌落形態(tài)特征對(duì)生物降解反應(yīng)結(jié)束后體系中BA1和BA2的數(shù)量進(jìn) 行計(jì)量;定義CFUBA1為BA1在10/0體系中的活菌數(shù)，即僅接種BA1的體系，CFUBA2為BA2 在0/10體系中的活菌數(shù)，即僅接種BA2的體系，CFUBA1·BA2為BA1在BA2存在時(shí)的活菌數(shù)， CFUBA2·BA1為BA2在BA1存在時(shí)的活菌數(shù)，BA1的相對(duì)活菌數(shù)PR2 的相對(duì)活菌數(shù)當(dāng)RCFU<1時(shí)，代表一株菌生長(zhǎng)和繁殖受到了另一株 菌的抑制，而當(dāng)RCFU>1時(shí)，代表另一株菌的存在對(duì)該菌株的生長(zhǎng)和繁殖起到了促進(jìn)作用; 根據(jù)兩株菌在不同初始活菌比例下的苯胺降解率、TOC降解率以及RCFU計(jì)算結(jié)果，選擇苯 胺降解率、TOC降解率最高且RCFUBA1和RCFUBA2計(jì)算結(jié)果均大于1的初始活菌比例作為 苯胺生物降解二元復(fù)合菌群的構(gòu)建比例，此時(shí)二元復(fù)合菌群對(duì)苯胺的降解效果最佳且形成了 互利共生的關(guān)系。
所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的組分為牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾水 1000mL，pH7.0，121℃滅菌20min后備用，制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基時(shí)加入20g瓊脂。
所述的馴化液體培養(yǎng)基的組分為(NH4)2SO43g，KH2PO40.5g，NaHPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，微量元素液1mL，蒸餾水1000mL，pH7.5，121℃滅菌20min，待冷卻后加入經(jīng)過(guò)濾 除菌的10%(w/v)苯胺溶液。
所述的微量元素液的組分為FeSO4·7H2O0.5g，MnSO4·H2O0.15g，ZnSO40.14g，Cocl20.2g，蒸餾水1000mL。
所述的苯胺降解率及TOC降解率采用以下公式進(jìn)行計(jì)算：
(1)
(2)
將本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，結(jié)果如下：
中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110287122.X，名稱為一種用于降解城市廢水的優(yōu)勢(shì)菌群及其制備方 法，公開(kāi)了制備構(gòu)成優(yōu)勢(shì)菌群的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、戈登氏菌(Gordonia)和惡 臭假單胞菌(Pseudomonasputida)體積百分比分別是20～24%、54～58%和26～18%，然而并未明 確指出獲得該體積百分的具體方法。而本發(fā)明通過(guò)測(cè)定不同比例的兩株菌投加到待處理廢水 中后對(duì)目標(biāo)污染物的濃度及活菌數(shù)量，綜合考察污染物處理效果和微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性， 從而獲得二元復(fù)合菌群的精確配比;
中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00710064363.1，名稱為一種降解酚類有機(jī)物的方法及其專用菌群，公 開(kāi)了一種采用含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9CGMCCNo.1893在溫和條件下高效降 解酚類有機(jī)物的方法，然而并未給出混合菌群的具體群落結(jié)構(gòu)組成及所涉及微生物的相對(duì)比 例，而本發(fā)明是在獲得具體菌株并了解其污染物降解特性的基礎(chǔ)上，通過(guò)簡(jiǎn)便而快速的構(gòu)建 方法，綜合二元復(fù)合菌群的污染物降解效果和群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，給出菌株的確切配比;
中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00810063737.2，名稱為降解“三苯”VOCs廢氣的復(fù)合微生物菌劑的制備 方法，公開(kāi)了的用于“三苯”VOCs廢氣降解的復(fù)合微生物菌劑是以含目標(biāo)污染物的培養(yǎng)基馴化 活性污泥的方法獲得的，馴化周期長(zhǎng)，且該發(fā)明并未對(duì)經(jīng)干燥后碾磨成粉末狀的復(fù)合微生物 菌劑發(fā)酵物經(jīng)長(zhǎng)期保存后的污染物效果進(jìn)行驗(yàn)證，由于群落結(jié)構(gòu)未知，該復(fù)合菌群的規(guī)�；� 生產(chǎn)及應(yīng)用效果難以得到保證，而本發(fā)明是在分離純化高效降解菌株的基礎(chǔ)上，采用復(fù)合菌 群的構(gòu)建方法，對(duì)復(fù)合菌群的配比進(jìn)行優(yōu)化，其穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)組成能夠保證其高效穩(wěn)定的 污染物降解效果，且在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，其種子液的發(fā)酵過(guò)程可分別進(jìn)行，以獲得活性高的 初始菌株，為復(fù)合菌群的構(gòu)建奠定了必要的基礎(chǔ);
中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110128285.3，名稱為一種降解多環(huán)芳烴的混合菌劑，公開(kāi)了混合菌 劑的具體組成，然而并未涉及混合菌劑中不同微生物在種子液中的相對(duì)比例和投加到待處理 廢水中后其相對(duì)數(shù)量的變化規(guī)律，由于不同污染場(chǎng)地中污染物的濃度及環(huán)境條件存在著不同 程度的差異，因而該混合菌劑的針對(duì)性和實(shí)用性有待考證，而本發(fā)明直接以含有目標(biāo)難降解 有機(jī)污染物的待處理廢水為環(huán)境介質(zhì)，通過(guò)污染物降解效果及群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的考察，能獲 得針對(duì)性強(qiáng)、污染物降解效果好和群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二元復(fù)合菌群，因而能保證良好的實(shí)地應(yīng) 用效果;
中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?013105523877，名稱為一種用于降解造紙廢水的復(fù)合菌群及其制備方 法，公開(kāi)了構(gòu)成降解造紙廢水復(fù)合菌群的土壤桿菌、桿狀菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌和 施氏假單胞菌的體積百分比分別為5-8%、2-5%、10-15%、26-41%和34-56%，但是并未給出 獲得該體積比的依據(jù)，同時(shí)由于各菌株培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)條件不同，其對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期培養(yǎng)液中各菌株的 相對(duì)數(shù)量也有所不同，以體積比作為定量化依據(jù)降低了該復(fù)合菌群在實(shí)際生產(chǎn)中的可操作性。 而本發(fā)明中涉及了兩種獨(dú)立的高效菌株，在實(shí)際操作中，可以采用測(cè)定殘余目標(biāo)污染物濃度 和RCFU的方法，對(duì)降解效果和菌株在待處理污染中的存在狀態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)的把握，從而能構(gòu) 建出配比明確、降解效果好和群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二元復(fù)合菌群;
本發(fā)明的用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法和用于廢水中苯胺生物降解 的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建方法均具有科學(xué)合理，便于實(shí)施，配比明確，降解效果好，群落結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
