申請(qǐng)日2014.10.27

　　公開(kāi)(公告)日2015.01.28

　　IPC分類號(hào)C12N1/20

　　摘要

　　本發(fā)明公開(kāi)了一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，具體包括以下步驟：(1)SRB富集培養(yǎng)基的制備;(2)SRB分離培養(yǎng)基的制備;(3)SRB的富集培養(yǎng);(4)SRB的分離培養(yǎng);(5)SRB的純化培養(yǎng)，本發(fā)明具有分離純化的速度快，從SRB富集和分離培養(yǎng)基的制備到純化培養(yǎng)物只需要3d～5d，分離純化的成功率高，一次分離純化既可得到純化培養(yǎng)物，操作簡(jiǎn)單、對(duì)操作人員要求較低，針對(duì)性強(qiáng)，本方法只適合進(jìn)行SRB菌種分離純化，因此，可廣泛地應(yīng)用于油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化中。

　　權(quán)利要求書(shū)

　　1.一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：

　　(1)SRB富集培養(yǎng)基的制備

　　將富集培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，厭氧分裝到容積為7.8ml的厭氧瓶中，每瓶分 裝7ml，121℃高壓蒸汽滅菌，其中，富集培養(yǎng)基配方為乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%～ 0.6%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.05%～0.2%、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05%～0.1%、氯 化鈉質(zhì)量濃度0.5%～2.0%、氯化鎂質(zhì)量濃度0.01%～0.03%;

　　(2)SRB分離培養(yǎng)基的制備

　　將分離培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，加熱至充分溶解，然后厭氧分裝到容積為 7.8ml的厭氧瓶中，每管7ml，121℃高壓蒸汽滅菌，滅菌完后自然降溫至50℃～ 55℃?zhèn)溆�，其中，分離培養(yǎng)基配方為蛋白胨質(zhì)量濃度0.8%～1.2%、肉浸粉質(zhì)量 濃度0.9%～1.1%、乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%～0.6%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.05%～ 0.2%、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05%～0.1%、氯化鈉質(zhì)量濃度0.5%～2.0%、氯化鎂 質(zhì)量濃度0.01%～0.03%、瓊脂粉質(zhì)量濃度0.8%～1.5%;

　　(3)SRB的富集培養(yǎng)

　　取油田污水0.2ml注入上述制備好的富集培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液變黑 為止，得到富集培養(yǎng)物;

　　(4)SRB的分離培養(yǎng)

　　取0.77ml上述富集培養(yǎng)物用制備好的富集培養(yǎng)基按照10倍系列稀釋法稀釋 至10-4，將10-3和10-4梯度的稀釋液用1ml無(wú)菌注射器取0.1ml，分別緩慢注入 至上述50℃～55℃?zhèn)溆玫姆蛛x培養(yǎng)基中，混合均勻，垂直靜置放置0.5h～1h得 到透明的半固體培養(yǎng)基，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑 點(diǎn)為止，得到分離培養(yǎng)物;

　　(5)SRB的純化培養(yǎng)

　　取1管上述富集培養(yǎng)基，用1ml無(wú)菌注射器抽取0.2ml富集培養(yǎng)基，接著用 該注射器吸入分離培養(yǎng)物中輪廓清晰的黑點(diǎn)，然后注入該管富集培養(yǎng)基中，放 置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培養(yǎng)物。

　　2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特 征在于，所述的121℃高壓蒸汽滅菌，滅菌時(shí)間為20min～30min。

　　3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法， 其特征在于，所述的滅菌完后自然降溫，為確保降溫均勻，降溫過(guò)程中緩慢滾 動(dòng)厭氧管。

　　4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法， 其特征在于，所述取油田污水現(xiàn)場(chǎng)采集后進(jìn)行密封處理在4℃下保藏不超過(guò)7d。

　　5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特 征在于，所述的恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液變黑為止，得到富集培養(yǎng)物，恒溫培養(yǎng)溫度 為30℃～60℃。

　　6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法， 其特征在于，所述的置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑點(diǎn)為止， 得到分離培養(yǎng)物，恒溫培養(yǎng)溫度為30℃～60℃。

　　7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法， 其特征在于，所述的放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培 養(yǎng)物，恒溫培養(yǎng)溫度為30℃～60℃。

　　8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特 征在于，所述的放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培養(yǎng)物， 培養(yǎng)時(shí)間為1d～3d。

　　說(shuō)明書(shū)

　　一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法

　　一、技術(shù)領(lǐng)域

　　本發(fā)明屬于石油微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種油田污水中硫酸鹽還原菌 的分離純化方法。

　　二、背景技術(shù)

　　硫酸鹽還原菌(SRB)是利用油田產(chǎn)出液中的硫酸鹽或者其它氧化態(tài)硫化物 作為電子受體來(lái)異化有機(jī)物質(zhì)的微生物，它將SO42-還原成H2S，進(jìn)而改變油田 水質(zhì)的pH值和金屬的腐蝕狀態(tài)，是金屬腐蝕速率顯著增加的重要因素，對(duì)油田 管網(wǎng)帶來(lái)腐蝕、堵塞等諸多有害作用。

　　分離和純化SRB獲得純種的SRB單菌株，可以為油田環(huán)境的菌落結(jié)構(gòu)分析 以及腐蝕現(xiàn)狀和水質(zhì)情況的評(píng)價(jià)提供重要的理論依據(jù)。

　　現(xiàn)有的SRB分離純化方法有以下三種：稀釋搖管法、疊皿夾層法和Hungate 滾管法，但目前的方法存在著以下問(wèn)題：(1)稀釋搖管法觀察和挑取菌落比較 困難，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力效率低;(2)疊皿夾層法適用范圍小，分離純化的成功率低， 往往需要3次～6次重復(fù)的分離純化才能得到相對(duì)純化培養(yǎng)物;(3)Hungate滾 管對(duì)設(shè)備操作人員要求較高，操作復(fù)雜，分離純化效果低;(4)三種方法分離 方法時(shí)間均需要10d以上。

　　三、發(fā)明內(nèi)容

　　本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種油田污水中硫酸鹽還原菌 的分離純化方法。該方法具有工藝簡(jiǎn)單、操作方便、材料易得、針對(duì)性強(qiáng)，對(duì) 操作人員及設(shè)備要求較低、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、分離純化速度快和成功率高的優(yōu)點(diǎn)。

　　一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，具體包括以 下步驟：

　　1、SRB富集培養(yǎng)基的制備

　　將富集培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管分 裝9ml，121℃高壓蒸汽滅菌30min。

　　其中，富集培養(yǎng)基配方為乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%～0.6%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃 度0.05%～0.2%、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05%～0.1%、氯化鈉質(zhì)量濃度0.5%～2.0%、 氯化鎂質(zhì)量濃度0.01%～0.03%。

　　2、SRB分離培養(yǎng)基的制備

　　將分離培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，加熱至充分溶解，然后厭氧分裝到容積為25ml 的厭氧管中，每管15ml，121℃高壓蒸汽滅菌30min，滅菌完后自然降溫至50℃～ 55℃?zhèn)溆谩?/P>

　　其中，分離培養(yǎng)基配方為蛋白胨質(zhì)量濃度0.8%～1.2%、肉浸粉質(zhì)量濃度 0.9%～1.1%、乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%～0.6%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.05%～0.2%、 酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05%～0.1%、氯化鈉質(zhì)量濃度0.5%～2.0%、氯化鎂質(zhì)量濃 度0.01%～0.03%、瓊脂粉質(zhì)量濃度0.8%～1.5%。

　　3、SRB的富集培養(yǎng)

　　取油田污水1ml注入上述制備好的富集培養(yǎng)基中，30℃～60℃恒溫培養(yǎng)至 培養(yǎng)液變黑為止，得到富集培養(yǎng)物。

　　4、SRB的分離培養(yǎng)

　　取1ml上述富集培養(yǎng)物用制備好的富集培養(yǎng)基按照10倍系列稀釋法稀釋至 10-4，將10-3和10-4梯度的稀釋液用1ml無(wú)菌注射器取0.1ml，分別緩慢注入至 上述50℃～55℃?zhèn)溆玫姆蛛x培養(yǎng)基中，混合均勻，垂直靜置放置0.5h～1h得到 透明的半固體培養(yǎng)基，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃～60℃， 培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑點(diǎn)為止，得到分離培養(yǎng)物。

　　5、SRB的純化培養(yǎng)

　　取1管上述富集培養(yǎng)基，用1ml無(wú)菌注射器抽取0.2ml富集培養(yǎng)基，接著用 該注射器吸入分離培養(yǎng)物中輪廓清晰的黑點(diǎn)，然后注入該管富集培養(yǎng)基中，放 置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃～60℃，培養(yǎng)1d～3d直到培養(yǎng)液變黑， 得到純化培養(yǎng)物。

　　其中，所述步驟2中的滅菌完后自然降溫，為確保降溫均勻，降溫過(guò)程中 緩慢滾動(dòng)厭氧管。

　　所述步驟3中的油田污水，其現(xiàn)場(chǎng)采集后進(jìn)行密封處理在4℃下保藏不超過(guò) 7d。

　　本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

　　(1)操作簡(jiǎn)單、對(duì)操作人員要求較低;

　　(2)針對(duì)性強(qiáng)，本方法只適合進(jìn)行SRB菌種分離純化;

　　(3)分離純化的速度快，從SRB富集和分離培養(yǎng)基的制備到純化培養(yǎng)物只 需要3d～5d;

　　(4)分離純化的成功率高，一次分離純化既可得到純化培養(yǎng)物。