申請日2013.10.24
公開(公告)日2016.01.20
IPC分類號C12N15/63; C12N1/21; C12N15/66; C02F3/34; C12R1/19
摘要
本發(fā)明公開了一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒、構建方法、重組工程菌及應用，所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入煙草葉綠體rrn16基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列、煙草葉綠體rps16基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌聚磷激酶基因ppk和假單胞菌K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構建而成。本發(fā)明通過merT-merP將廢水中的有機汞和無機汞轉運到細菌細胞內(nèi)，通過merB1和merB2將有機汞降解為二價汞，通過ppk將二價汞螯合在細胞內(nèi)，降低汞對細菌細胞的毒性，將廢水中的汞積累在細菌細胞內(nèi)，通過收集重組工程菌菌體清除廢水中的汞污染。
權利要求書
1.一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒，其特征在于：所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入煙草葉綠體rrn16基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列、煙草葉綠體rps16基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)聚磷激酶基因ppk和假單胞菌(Pseudomonas)K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構建而成;所述mer操縱子為merT-merP-merB1-merB2;所述重組質粒含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一種如權利要求1所述的用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：
(1)根據(jù)假單胞菌K-62菌株質粒pmr26和pmr28，合成人工操縱子merT-merP-merB1-merB2，將其與質粒pET28a進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為p1;
(2)以產(chǎn)氣腸桿菌DNA為模板，設計引物，擴增ppk基因;將ppk基因和質粒p1酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為p2;
(3)設計引物，擴增含有煙草葉綠體rrn16基因強啟動子和大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列;
(4)將含有煙草葉綠體rrn16基因強啟動子和大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列和質粒pET28a酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為p3;
(5)以質粒p2為模板，設計引物，擴增人工操縱子merT-merP-merB1-merB2-ppk;將merT-merP-merB1-merB2-ppk和質粒p3酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為p4;
(6)以煙草葉綠體DNA為模板，設計引物，擴增rps163’端非編碼區(qū)基因序列;將rps163’端非編碼區(qū)基因與質粒p4酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒即為用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒。
3.一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組工程菌，其特征在于：由權利要求1所述的重組質粒轉化大腸桿菌BL21得到。
4.一種如權利要求3所述的重組工程菌在清除工業(yè)廢水汞污染方面的應用。
說明書
一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒、構建方法、重組工程菌及應用
技術領域
本發(fā)明涉及一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒，同時還涉及該重組質粒的構建方法、包含該重組質粒的重組工程菌及該重組工程菌的應用，屬于基因工程技術領域。
背景技術
土壤是人類賴以生存的主要自然資源之一，也是人類生態(tài)環(huán)境的重要組成部分。隨著工業(yè)、城市污染的加劇和農(nóng)用化學物質種類、數(shù)量的增加，土壤重金屬污染日益嚴重。汞是其中一種主要的重金屬污染物。農(nóng)用土壤重金屬污染主要來自于污水灌溉。據(jù)我國農(nóng)業(yè)部進行的全國污灌區(qū)調查，在約140萬公頃的污水灌區(qū)中，遭受重金屬污染的土地面積占污水灌區(qū)面積的64.8%，其中輕度污染的占46.7%，中度污染的占9.7%，嚴重污染的占8.4%。因此，在廢水排出工廠前進行去汞處理，對于保障人類身體健康非常重要。
廢水中的汞主要有三種形態(tài)：金屬汞、無機汞和有機汞，其中有機汞的毒性最大。運用生物方法對被汞污染的廢水進行處理能夠將對周圍環(huán)境的影響降低到最小程度。在目前已知的對汞具有耐受性的生物中，假單胞菌(Pseudomonas)K-62菌株對汞的耐受性最強，其對汞的耐受性比大腸桿菌高1000倍左右。該菌具有對汞極強的耐受能力主要起因于該菌細胞內(nèi)的兩個質粒：pmr26和pmr28。pmr26含有兩個抗汞操縱子mer，這兩個操縱子之間相隔1kb 左右，其中一個操縱子使該菌對無機汞和有機汞都具有抗性，而另一個操縱子對有機汞則非常敏感。將這兩個操縱子分別插入到質粒pBluescriptII，并命名為pmra17和pmrb01。測序后發(fā)現(xiàn)操縱子pmra17含有6個開放閱讀框，其中5個分別被鑒定為merR、merT、merP、merA、 merB1。操縱子pmrb01含有三個開放閱讀框，分別被鑒定為merR、merB2、merD。MerR是一個調節(jié)基因，對結構基因的轉錄進行正向調控或負向調控;merD與轉錄共調控的功能相關; merT、merP、merA、merB分別編碼二價汞離子轉運蛋白、二價汞離子外周胞質結合蛋白、汞離子還原酶和有機汞裂解酶。在多數(shù)情況下，merB緊挨著位于merA的下游。Pseudomonas K-62對有機汞的抗性主要源于merB1和merB2編碼的裂解酶。MerB1負責將甲基汞轉化為二價汞，merB2負責將苯基汞轉化為二價汞，merA負責將二價汞還原為零價汞。轉運蛋白 merT和merP負責將有機汞和無機汞運輸?shù)郊毎麅?nèi)，并將零價汞從外周胞質中清除出去。MerG 位于merA和merB1之間，其預測的氨基酸序列含有一個引導序列，該引導序列包含一個親水區(qū)域和一個信號肽剪切位點;該信號序列與已知的外胞周質蛋白的引導序列同源。MerG位于外胞周質上;將merG刪除以后，細菌對二價汞的抗性并沒有發(fā)生改變，但是對苯基汞的抗性變?nèi)趿?刪除掉merG對于merA和merB編碼的酶的活性也沒有影響。表明merG只參與了對苯基汞的抗性，其機理可能是降低了細胞對苯基汞的通透性。
綜上所述，PseudomonasK-62對汞具有極強抗性的機理是它能夠將細胞內(nèi)的有機汞轉化為二價汞，然后將二價汞轉化為零價汞，如下：
零價汞的毒性比有機汞和二價汞要小得多，而且能夠揮發(fā)掉。但這并不是解決問題的根本辦法，因為揮發(fā)到空氣中的零價汞會重新進入汞循環(huán)，繼續(xù)對人體造成危害。因此，最好的辦法是將周圍環(huán)境中的汞進行聚集固定，不讓它們重新進入汞循環(huán)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒。
本發(fā)明的目的還在于提供一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒的構建方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組工程菌。
本發(fā)明的目的還在于提供一種重組工程菌在清除工業(yè)廢水汞污染方面的應用。
為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是提供一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒，所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入煙草葉綠體rrn16基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR(OlinsandRangwala.Anovelsequenceelementderivedfrom bacteriophageT7mRNAactsasanenhanceroftranslationofthelacZgeneinEscherichiacoli.The JournalofBiologicalChemistry，1989，264(29):16973-16976)序列中的核糖體結合位點保守序列、煙草葉綠體rps16基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)聚磷激酶基因ppk和假單胞菌(Pseudomonas)K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構建而成。
所述重組質粒包含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒的構建方法，包括以下步驟：
(1)根據(jù)假單胞菌K-62菌株質粒pmr26和pmr28，合成人工操縱子 merT-merP-merB1-merB2，將其與質粒pET28a進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為p1;
(2)以產(chǎn)氣腸桿菌DNA為模板，設計引物，擴增ppk基因;將ppk基因和質粒p1酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為p2;
(3)設計引物，擴增含有煙草葉綠體rrn16基因強啟動子和大腸桿菌T7噬菌體基因10 的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列;
(4)將含有煙草葉綠體rrn16基因強啟動子和大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列和質粒pET28a酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌 DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為 p3;
(5)以質粒p2為模板，設計引物，擴增人工操縱子merT-merP-merB1-merB2-ppk;將 merT-merP-merB1-merB2-ppk和質粒p3酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為p4;
(6)以煙草葉綠體DNA為模板，設計引物，擴增rps163’端非編碼區(qū)基因序列;將rps 163’端非編碼區(qū)基因與質粒p4酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒即為用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒。
本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組工程菌，所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入煙草葉綠體rrn16基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列、煙草葉綠體rps16基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)聚磷激酶基因ppk和假單胞菌(Pseudomonas) K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構建而成。
所述重組工程菌的宿主為大腸桿菌。
本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種重組工程菌在清除工業(yè)廢水汞污染方面的應用。
本發(fā)明以煙草葉綠體rrn16基因啟動子為高表達啟動子，以大腸桿菌T7噬菌體基因10 的5’UTR(g10基因)核糖體結合位點保守序列為翻譯增強子，煙草葉綠體rsp16基因3’端非編碼區(qū)為強終止子，構建含merT-merP-merB1-merB2-ppk的重組表達系統(tǒng)，且將該系統(tǒng)整合到大腸桿菌BL21的染色體上，篩選成功轉化的菌株，通過rrn16基因啟動子、g10基因核糖體結合位點保守序列和rsp16基因3’端非編碼區(qū)的作用提高改造的mer操縱子和ppk蛋白表達的水平，通過merT-merP將廢水中的有機汞和無機汞轉運到細菌細胞內(nèi)，通過merB1將甲基汞降解為二價汞，通過merB2將苯基汞降解為二價汞，通過ppk將二價汞螯合在細胞內(nèi)，降低汞對細菌細胞的毒性，將廢水中的汞積累在細菌細胞內(nèi)，通過收集重組工程菌菌體清除廢水中的汞污染。
本發(fā)明的優(yōu)點如下：
1、在表達基因上游添加煙草葉綠體rrn16基因強啟動子，該啟動子對原核生物基因的啟動能力是T7啟動子啟動能力的6倍以上;
2、在表達基因起始密碼子上游添加g10核糖體結合位點，添加該位點后，重組工程菌耐汞能力能夠提高5倍左右;
3、在表達質粒中添加merB1和merB2，重組工程菌對苯基汞的耐受能力分別是現(xiàn)有文獻報道的9倍(Hidemitsuetal.PolyphosphateproducedinrecombinantEscherichiacoliconfers mercury.FEMSMicrobiologyLetters，2002，207(2):159-164)，重組工程菌對無機汞的耐受能力也比現(xiàn)有文獻報道的數(shù)值提高了7倍，重組工程菌對各種形態(tài)的汞耐受能力的大幅度提高，為其商業(yè)應用奠定了基礎;
4、重組工程菌細胞汞積累量大幅度提高，重組工程菌細胞汞積累量是現(xiàn)有文獻報道(Hidemitsuetal.PolyphosphateproducedinrecombinantEscherichiacoliconfersmercury. FEMSMicrobiologyLetters，2002，207(2):159-164)的5倍多;
5、重組工程菌在處理廢水的時候，會隨著處理進度而產(chǎn)生細胞團、細胞沉淀，顏色逐漸變?yōu)榘岛稚@些視覺上的變化為實際應用中的操作者帶來很大方便，可以直觀地通過觀察來判斷廢水去汞的進度。
