申請(qǐng)日2015.07.24

　　公開(kāi)(公告)日2015.11.04

　　IPC分類(lèi)號(hào)C12N1/21; C12N15/75; C02F101/38; C12R1/01; C02F3/34

　　摘要

　　本發(fā)明公開(kāi)了一種基因工程好氧硝化細(xì)菌及其構(gòu)建方法和在處理高濃度氨氮污水中的應(yīng)用�；�因工程硝化菌是表達(dá)AMO和HAO基因的重組好氧硝化細(xì)菌(具有高效去除氨氮的性能)，拉丁文學(xué)名為Brevibacillus?reuszeri，命名為Biodehiammonia菌株;保藏單位：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏時(shí)間：30年，保藏編號(hào)CMGCC10254�；�因工程好氧硝化細(xì)菌中插入外源基因AMO和HAO的核苷酸序列分別如序列編號(hào)1和2所示，基因工程硝化菌的AMO氨基酸序列如序列編號(hào)3所示，基因工程硝化菌的HAO氨基酸序列如序列編號(hào)4所示，基因工程好氧硝化細(xì)菌的AMO基因前帶有分泌型信號(hào)肽，其中信號(hào)肽的氨基酸序列如編號(hào)5所示。該基因工程好氧硝化細(xì)菌與膜生物反應(yīng)器聯(lián)合用于污水的處理，能取得非常好的處理效果。

　　權(quán)利要求書(shū)

　　1.一種基因工程好氧硝化細(xì)菌，其特征在于，所述基因工程好氧硝化菌是 Biodeammonianitrogen工程菌，拉丁文學(xué)名為Brevibacillus reuszeri，在中國(guó)微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CMGCC No.10254。

　　2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程好氧硝化細(xì)菌，其特征在于，所述基因工程 好氧硝化細(xì)菌中轉(zhuǎn)化的外源基因的核苷酸序列如序列編號(hào)1和2所示。

　　3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因工程好氧硝化細(xì)菌，其特征在于，所述基因 工程好氧硝化細(xì)菌的氨單加氧酶基因和羥胺氧化酶的氨基酸序列如序列編號(hào)3 和4所示。

　　4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程好氧硝化細(xì)菌，其特征在于，所述基因工程 好氧硝化細(xì)菌的氨單加氧酶基因前帶有分泌型信號(hào)肽，其中信號(hào)肽的氨基酸序列 如編號(hào)5所示。

　　5.權(quán)利要求1至4任一所述的基因工程好氧硝化細(xì)菌的構(gòu)建方法，其特征在于， 包括如下步驟：

　　(1)利用細(xì)菌分離技術(shù)分離具有氨氮去除效果的硝化細(xì)菌基因組;

　　(2)利用PCR技術(shù)克隆氨單加氧酶基因和羥胺氧化酶，與pSIM6載體連 接后重組至步驟(1)的好氧硝化細(xì)菌基因組的特定位點(diǎn)中;

　　(3)利用基因工程技術(shù)從步驟(2)的產(chǎn)物中篩選出表達(dá)氨單加氧酶和羥胺 氧化酶基因的好氧硝化細(xì)菌;

　　(4)將步驟(3)的產(chǎn)物在高濃度氨氮條件下馴化，得到具有處理高濃度氨 氮污水能力的基因工程好氧硝化細(xì)菌;

　　(5)利用發(fā)酵技術(shù)將步驟(4)所述具有處理高濃度氨氮污水能力的基因工 程硝化細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，得到所述基因工程好氧硝化細(xì)菌。

　　6.權(quán)利要求1至4任一所述的基因工程好氧硝化細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于，將 膜生物反應(yīng)系統(tǒng)與所述基因工程好氧硝化細(xì)菌聯(lián)合，在高濃度氨氮條件下，有效 去除污水中的高濃度氨氮;

　　所述膜生物反應(yīng)系統(tǒng)為流動(dòng)的需氧膜生物反應(yīng)系統(tǒng)，膜的材質(zhì)為樹(shù)脂;

　　所述高濃度氨氮在所述污水中的含量是3000～6000mg/L。

　　7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因工程好氧硝化細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于，所述污 水中COD的去除率為98.44～99.84%。

　　8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因工程好氧硝化細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于，所述污 水中氨氮去除率為98.86～99.94%。

　　9.根據(jù)權(quán)利要求6～8任一所述的基因工程好氧硝化細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于， 所述污水包括生活污水、工業(yè)廢水、垃圾滲濾液以及高濃度氨氮廢水。

　　說(shuō)明書(shū)

　　一種基因工程好氧硝化細(xì)菌及其構(gòu)建方法和在處理高濃度氨氮污水中的應(yīng)用

　　發(fā)明領(lǐng)域

　　本發(fā)明涉及表達(dá)兩種外源基因的重組好氧硝化細(xì)菌菌劑及其構(gòu)建方法和在高 濃度氨氮污水處理中的應(yīng)用，具體地說(shuō)涉及表達(dá)亞硝酸鹽還原酶和羥胺氧化酶的 基因工程好氧硝化細(xì)菌。

　　背景技術(shù)

　　本發(fā)明中提到的膜生物反應(yīng)系統(tǒng)是流動(dòng)的需氧的膜生物反應(yīng)系統(tǒng)(fluidized bed membrance bioreactor,AFMBR)，基因工程好氧硝化細(xì)菌是在低溫條件下具有高 效去除高濃度氨氮的Biodehiammtrogen工程菌。

　　隨著人類(lèi)活動(dòng)的增多，產(chǎn)生的污水日益增加，高濃度氨氮污水的處理以成為 我國(guó)急需解決的問(wèn)題之一。雖然現(xiàn)在使用的微生物處理污水，取得一定的效果， 但是大多數(shù)均不能穩(wěn)定的運(yùn)行。綜上所述，急需新的技術(shù)和方案來(lái)解決此問(wèn)題。

　　生物脫氮法是現(xiàn)代工業(yè)污水處理中最有效的去除污水中氨氮的方法，其中由 硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌完成的硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)是將氨氮從污水中去除最為 關(guān)鍵的步驟。自然狀況下的化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)硝化細(xì)菌具有生長(zhǎng)速率低、生物量小和 對(duì)環(huán)境因子敏感等生理特點(diǎn)，使得污水處理廠的脫氮效果很不穩(wěn)定，尤其是在處 理高濃度氨氮污水時(shí)，對(duì)硝化細(xì)菌的數(shù)量及硝化反應(yīng)速率要求更高。

　　污水除氮的第一步就是在亞硝化細(xì)菌的作用下將銨離子轉(zhuǎn)化為羥氨，在這一 步中，發(fā)揮催化作用的是氨單加氧酶和羥胺氧化酶。氨單加氧酶和羥胺氧化酶就 是異養(yǎng)硝化菌代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶是AMO和HAO，AMO主要催化NH3氧化形成 羥胺(NH2OH)，而羥氨又在異養(yǎng)硝化菌特有的不含血紅素的羥氨氧化酶(HAO)的 作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽或N2O。

　　MBR可以達(dá)到與活性污泥系統(tǒng)相似的處理效果，如COD的去除、硝化、反 硝化以及化學(xué)或者生物除磷。作為摸分離技術(shù)與生物技術(shù)結(jié)合的污水處理新工藝， MBR由于其出水水質(zhì)優(yōu)良穩(wěn)定，裝置占地面積小等顯著優(yōu)點(diǎn)，使其在城市污水、 工業(yè)廢水、垃圾滲濾液的處理和回用方面表現(xiàn)出良好的競(jìng)爭(zhēng)力，并在全球范圍受 到高度重視，是公認(rèn)的21世紀(jì)最具有吸引力和競(jìng)爭(zhēng)力的污水處理與回用技術(shù)。我 國(guó)對(duì)MBR的應(yīng)用與研究起步相對(duì)較晚，但是發(fā)展很快。本設(shè)計(jì)使用MBR/活性污 泥混合系統(tǒng)結(jié)合基因工程好氧硝化細(xì)菌增強(qiáng)對(duì)高濃度氨氮污水的處理的效果。

　　綜上所述，通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建的基因工程好氧硝化細(xì)菌使MBR/基因工程細(xì)菌混 合系統(tǒng)對(duì)高濃度氨氮污水的處理效果得到了增強(qiáng)，提高了出水質(zhì)量。

　　發(fā)明內(nèi)容

　　鑒于以上問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種基因工程好氧硝化細(xì)菌及其構(gòu)建方 法和在處理高濃度氨氮污水處理中的應(yīng)用。具體技術(shù)方案如下：

　　一種基因工程好氧硝化細(xì)菌，所述基因工程硝化菌是Biodeammonianitrogen工程 菌，拉丁文學(xué)名為Brevibacillus reuszeri，命名為Biodehiammonia菌株;保藏單位： 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地點(diǎn)：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏時(shí)間：2014年12月29日，保藏 編號(hào)CGMCC No.10254。

　　所述基因工程硝化菌中轉(zhuǎn)化的外源基因的核苷酸序列如序列編號(hào)1和2所示。

　　所述基因工程好氧硝化細(xì)菌表達(dá)的氨單加氧酶基因(ammonia monooxygenase，AMO)的氨基酸序列如序列編號(hào)3所示，基因工程好氧硝化細(xì)菌 表達(dá)的氨羥胺氧化酶(Hydroxylamine oxidase,HAO)的氨基酸序列如序列編號(hào)4 所示。

　　所述基因工程硝化菌的氨單加氧酶基因前帶有分泌型信號(hào)肽，其中信號(hào)肽的 氨基酸序列如編號(hào)5所示。

　　上述任一所述的基因工程硝化菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

　　(1)利用細(xì)菌分離技術(shù)分離具有氨氮去除效果的硝化細(xì)菌基因組;

　　(2)利用PCR技術(shù)克隆氨單加氧酶基因和羥胺氧化酶，與pSIM6載體連 接后重組至步驟(1)的好氧硝化細(xì)菌基因組的特定位點(diǎn)中;

　　(3)利用基因工程技術(shù)從步驟(2)的產(chǎn)物中篩選出表達(dá)氨單加氧酶和羥胺 氧化酶基因的好氧硝化細(xì)菌;

　　(4)將步驟(3)的產(chǎn)物在高濃度氨氮條件下馴化，得到具有處理高濃度氨 氮污水能力的基因工程好氧硝化細(xì)菌;

　　(5)利用發(fā)酵技術(shù)將步驟(4)所述具有處理高濃度氨氮污水能力的基因工 程硝化細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，得到所述基因工程好氧硝化細(xì)菌。

　　上述任一所述的基因工程硝化菌的應(yīng)用，將膜生物反應(yīng)系統(tǒng)與所述基因工程 硝化菌聯(lián)合，在高濃度氨氮條件下，有效去除污水中的高濃度氨氮;

　　所述膜生物反應(yīng)系統(tǒng)為流動(dòng)的需氧膜生物反應(yīng)系統(tǒng)，膜的材質(zhì)為樹(shù)脂;

　　所述高濃度氨氮在所述污水中的氨氮含量是3000～6000mg/L。

　　所述污水中COD的去除率為98.44～99.84%。

　　所述污水中氨氮去除率為98.86～99.94%。

　　所述污水包括生活污水、工業(yè)廢水、垃圾滲濾液以及高濃度氨氮廢水等。

　　本發(fā)明通過(guò)應(yīng)用基因工程操作技術(shù)，獲得了具有高效去除污水中高濃度氨氮 的基因工程硝化細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)表明表的達(dá)外源基因重組到細(xì)菌基因組中，沒(méi)有影響 硝化細(xì)菌的增值。高濃度氨氮污水處理實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，重組硝化細(xì)菌可以有 效去除工業(yè)廢水、垃圾滲濾液中的高濃度氨氮，達(dá)到國(guó)家要求出水標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明表 達(dá)功能基因的重組硝化細(xì)菌可作為理想高濃度氨氮去除菌劑。