1 引言

　　水質基準是制定水質標準的科學依據(jù)，目前針對我國水域的水質基準研究較少，我國現(xiàn)行水質標準主要依據(jù)國外水質基準數(shù)值確定，但水質狀況與生物區(qū)系的不同會造成水質基準的明顯差異.因此，依據(jù)我國國情開展水質基準研究已經(jīng)成為我國水環(huán)境管理的迫切需求.

　　菲(Phenanthrene，PHE)，是多環(huán)芳烴中最具代表性的物質之一，屬于內(nèi)分泌干擾物質，由于它被廣泛應用于合成樹脂、農(nóng)藥、染料、醫(yī)藥、防霉劑和鞣料等工業(yè)里，因此在空氣、水體、土壤和動植物體內(nèi)的檢出率較高.目前在國內(nèi)外許多水體中都曾檢測出菲，如美國新澤西州河口PilesCree水域中菲含量為80~800 ng·g-1，尼日利亞Siokolo島水域中菲含量為1.46 μg·mL-1.有研究顯示，菲對雙殼貝類、甲殼類、魚類、水生昆蟲等動物都有潛在的毒性，原因是菲結構中的9、10雙鍵具有高電子密度，易與細胞內(nèi)的DNA、RNA等物質結合而引起致毒作用，并且菲的結構中還具有與致癌性相關的K區(qū)(K-region)和灣區(qū)(bayregion).通過開展菲的水生生物基準閾值研究，可以填補我國本土水生生物菲的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)空白，為我國菲的水生生物基準建立、環(huán)境管理工作提供技術支持.

　　本研究根據(jù)我國淡水生物區(qū)系特征綜合考慮物種篩選原則及影響因素，同時結合美國的水質基準“指南”中“三門八科”最低毒性數(shù)據(jù)要求，選擇具有代表性的“四門八科”9種本土水生生物(錦鯉、麥穗、泥鰍、澤蛙蝌蚪、大型溞、青蝦、搖蚊幼蟲、霍甫水絲蚓和水螅屬)進行生態(tài)毒理學急性和慢性實驗，在推導出菲本土水生生物基準閾值的同時，與美國水生生物已報道毒性數(shù)據(jù)進行本土與美國物種毒性敏感度分析比較，探究非美國水生生物毒性數(shù)據(jù)進行我國本土水生生物基準研究的可行性.

　　2 材料與方法 2.1 實驗材料

　　學術界一般認為，魚類、浮游生物、底棲動物和植物可表征復雜水生態(tài)系統(tǒng)的結構特征和功能.按照美國水質基準“指南”中“三門八科”最低毒性數(shù)據(jù)要求，參照《中國脊椎動物大全》(李明玉等，2000)和《中國生物多樣性國情研究報告》(國家環(huán)境保護總局，1998)等文獻資料，我國水質基準推導的試驗生物基本可采用“指南”規(guī)定的物種選擇原則，但必須包括鯉科魚類;另外由于我國鯉科數(shù)量龐大，因此本文選用兩種鯉科魚.根據(jù)我國淡水生物區(qū)系特征，結合美國和歐盟推導水質基準的物種選擇，初步確定了菲基準研究所需本土生物物種，分別是脊索動物門鯉科(錦鯉、麥穗魚)、鰍科(泥鰍)、蛙科(澤蛙蝌蚪)，節(jié)肢動物門溞科(大型溞)、蝦科(青蝦)、搖蚊科(搖蚊幼蟲)，環(huán)節(jié)動物門顫蚓科(霍甫水絲蚓)，腔腸動物門水螅蟲科(水螅屬)，共“四門八科”9種本土水生動物.另外，本研究系統(tǒng)全面的搜集了菲的水生植物毒性數(shù)據(jù)，但滿足毒性數(shù)據(jù)篩選原則(US EPA，1985)的數(shù)據(jù)十分匱乏，僅搜集到浮萍(Lemna minor)的LC50數(shù)據(jù)，本研究選用此數(shù)據(jù)進行基準閾值推導.

　　9種本土水生動物購自朝來春及大森林水產(chǎn)市場，正式試驗前均在實驗室馴養(yǎng)至少7 d;大型溞(Daphnia magna)，溞齡 < 24 h，由中國環(huán)境科學研究院環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室提供.水生生物培養(yǎng)條件為：pH為8.0±0.2，DO為(8.3±0.3) mg·L-1，溫度為(22±2) ℃，試驗類型采用換水式，每24 h換1次水，急性試驗不喂食，慢性試驗按照0.1%生物質量1 d喂食兩次;溞類光照周期為12 h:12 h.

　　受試物種選擇依據(jù)如下：當受試物種為水溞或其他水溞類動物時，應使用齡期小于24 h的生物進行試驗;當受試物種為蚊類時，應使用其第2代或第3代幼蟲進行試驗;當受試物種為魚類或其他物種時，應使用幼齡期的生物(至少要先于性腺發(fā)育前60 d)進行試驗.

　　實驗用菲，C14H10，純度≥98%(HPLC), 為色譜純，購自美國Sigma Aldrich化學品公司;其他試劑均為分析純.全部玻璃器具使用前經(jīng)過高價酸液沖洗之后由氣相色譜分析從而保證不會產(chǎn)生干擾，同時操作過程中實驗員嚴格遵守操作規(guī)定.菲溶液配制使用的移液槍經(jīng)中國計量科學研究院校準，各個濃度組第一次實驗前由氣相色譜檢測確保濃度配制精準.在3組空白實驗中加入內(nèi)標菲-d10，96 h后測定其回收率，結果顯示，菲-d10的回收率為74.3%~89.6%，滿足70%~130%的US EPA(1985)公布的回收率要求，證明本實驗結果可靠準確.

　　2.2 實驗方法

　　急性實驗按照美國材料與試驗協(xié)會(American Society for Testing and Materials，ASTM)標準方法執(zhí)行，設空白對照組、助溶劑(二甲基亞砜, DMSO)對照組、濃度組，每組3個重復.溞類急性毒理學實驗進行48 h，其余8種水生生物要進行96 h;相關信息見表 1.

 　　慢性實驗根據(jù)菲對錦鯉、泥鰍和大型溞的急性毒性試驗結果，空白對照組、助溶劑(二甲基亞砜, DMSO)對照組、濃度組，每組3個重復.其中最高濃度組低于急性毒性LC50值.采用靜態(tài)更新試液法，每隔1 d更新1次受試液并喂食.錦鯉、泥鰍慢性毒理學實驗進行至少28 d以上，溞類至少21 d以上，具體實驗濃度設置如下：錦鯉為0.00、0.35、0.46、0.60、0.78、1.01和1.32 mg·L-1 PHE;泥鰍為0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22和1.59 mg·L-1PHE;大型溞為0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22和1.59 mg·L-1 PHE.試驗中每天記錄錦鯉和泥鰍體長、體重等生長指標，記錄大型蚤第一窩產(chǎn)卵時間、數(shù)量，總產(chǎn)卵窩數(shù)量和總產(chǎn)卵數(shù)量等.

　　2.3 數(shù)據(jù)搜集與分析

　　通過US EPA ECOTOX毒性數(shù)據(jù)庫、ELSEVIER數(shù)據(jù)庫和CNKI數(shù)據(jù)庫等進行數(shù)據(jù)搜集.篩選原則如下：①測試信息不完全、信息保密、受權限或其他原因不能傳播的數(shù)據(jù)不得使用;②具有高度揮發(fā)性、易水解或降解的物質，一般只有流水式試驗的結果可以使用;③測試終點為慢性NOEC或LOEC值，優(yōu)先使用NOEC值;④一些有問題或有疑點的數(shù)據(jù)(如：沒有設立對照組、試驗生物曾經(jīng)暴露于污染物、試驗設計不科學的數(shù)據(jù))均不能采用.

　　另外，在獲得毒性數(shù)據(jù)后，首先應該對數(shù)據(jù)或對數(shù)轉換的毒性數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，一般采用K-S檢驗或者t檢驗.本研究選用K-S檢驗(Two-sample Kolmogorov-Smirnov)PHE美國水生生物毒性數(shù)據(jù)(表 2)的正態(tài)分布，結果顯示，p=0.08>0.05，認為美國水生生物毒性數(shù)據(jù)對PHE毒性敏感的總體分布基本相同，符合正態(tài)分布.

 　　EC/LCx計算方法：EC/LCx和95%置信區(qū)間采用概率單位直線回歸法計算，急性毒性試驗x為50，慢性毒性實驗x為10.試驗開始和結束后溶液中PHE濃度檢測結果顯示實測和名義濃度比率在91.68%~103.47%之間，即濃度差異在20%以內(nèi)，符合測試標準對濃度的要求(Aldenberg et al., 2000)，因此本文中濃度采用名義濃度計算EC/LCx.

　　3 結果與分析 3.1 急性毒性實驗

　　9種本土水生生物的急性毒性試驗結果見表 3，空白對照組和助溶劑對照組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象.結果顯示水螅屬的96 h LC50為0.096 mg·L-1，水螅屬對PHE暴露的敏感性最高，其次是大型溞、搖蚊幼蟲、麥穗魚、澤蛙蝌蚪、霍甫水絲蚓、青蝦和錦鯉，對PHE最不敏感的是泥鰍，其96 h LC50為3.684 mg·L-1.

 　　本文也進行了PHE對美國水生生物毒性的對比，前人研究發(fā)現(xiàn)藍鰓太陽魚、虹鱒和大鱗大麻哈魚的96 h LC50為0.234、0.375和0.478 mg·L-1 PHE，這和本文的試驗結果比較接近.同時本文研究得到的浮游甲殼類水生生物大型溞96 h LC50為0.275 mg·L-1，這與前人研究的另外一種浮游甲殼類生物蚤狀溞(0.350 mg·L-1)也極為接近.本研究中本土底棲甲殼類生物青蝦96 h LC50為1.079 mg·L-1，而美國底棲甲殼類生物俄勒岡蝦96 h LC50為0.027 mg·L-1，兩者之間相差了40倍左右;環(huán)節(jié)動物之間同樣存在著較顯著差異，本土霍甫水絲蚓96 h LC50為0.799 mg·L-1，美國夾雜帶絲蚓對PHE毒性更加敏感，96 h LC50為0.419 mg·L-1.由于缺乏相應的毒性數(shù)據(jù)，因此本文未進行昆蟲類及兩棲類對比.

　　3.2 慢性毒性數(shù)據(jù)

　　對于慢性毒性數(shù)據(jù)(表 4)，Call等報道稱大型溞的存活率21 d NOEC為0.163 mg·L-1，與本試驗中大型溞總繁殖數(shù)量的21 d EC10(0.060 mg·L-1)處在一個數(shù)量級之內(nèi).同時所有試驗濃度組中均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，表中可見大型溞對PHE暴露的繁殖總數(shù)試驗終點要比存活率更為敏感.本試驗中錦鯉和泥鰍生長的28 d EC10分別為0.435和0.540 mg·L-1 PHE，前人研究發(fā)現(xiàn)PHE對虹鱒生長的28 d NOEC分別為0.66 mg·L-1.在慢性毒性試驗中，大型溞仍然是對PHE暴露最敏感的物種.

 　　3.3 基于本土與美國生物毒性數(shù)據(jù)擬合SSD曲線比較

　　Davies等提出“靈活使用毒性數(shù)據(jù)”的設想，即使用一個地區(qū)的生物毒性數(shù)據(jù)去進行另一個區(qū)域的生態(tài)風險評估.不過該設想提出后受到多方面質疑，因為不同地區(qū)水溫、水中溶解氧濃度不同，而且不同種類生物對同一有害物質的敏感性也存在差異(Hose et al., 2007).本研究針對本土(表 2)與美國(表 3)生物毒性數(shù)據(jù)擬合的SSD曲線進行比較，從而初步探索“靈活使用毒性數(shù)據(jù)”設想的可行性.由于慢性數(shù)據(jù)相對匱乏，因此本研究僅使用急性毒性數(shù)據(jù).本研究針對PHE毒性數(shù)據(jù)共擬合出3條SSD曲線，分別是本土生物毒性數(shù)據(jù)(黑線)、美國生物毒性數(shù)據(jù)(紅線)及本土+美國生物全部毒性數(shù)據(jù)(藍線).如圖 1所示，由左向右分別是美國數(shù)據(jù)、總體數(shù)據(jù)及本土數(shù)據(jù)，這意味著美國相對于本土生物對PHE暴露表現(xiàn)出更加敏感的趨勢.經(jīng)過計算，3條曲線的HC5值分別是0.0780、0.0785及0.0854 mg·L-1.

 　　數(shù)學統(tǒng)計檢驗中，two-sample Kolmogorov-Smirnov(K-S test)檢驗通常用于推斷兩樣本分別代表的兩總體分布是否相同.因此借助Kolmogorov-Smirnov檢驗分析本土與美國毒性數(shù)據(jù)二者之間是否存在顯著性差異具有十分重要的學術價值：①如果兩者有顯著性差異，那么驗證了我們學術界有必要進行選取本土水生生物進行相關的基準閾值研究;②如果兩者無顯著性差異，那么證明在本土基準閾值推導過程中可以采用已經(jīng)報道過的美國水生生物毒性數(shù)據(jù)，從而減少重復的人力物力投入及受試生物的消耗.K-S結果如下：(Ks = 1.342, n1 = 10, n2 = 9, p = 0.08).p =0.08>0.05，按a=0.05水準，認為兩組數(shù)據(jù)對PHE毒性敏感的總體分布基本相同，兩組數(shù)據(jù)之間不存在顯著性差異性(圖 1).

　　3.4 PHE水生生物水質基準閾值推導

　　本文采用USEPA“指南”推薦的SSR方法對基于實測數(shù)據(jù)的PHE水生生物基準閾值進行了計算，本土物種SMAV值和GMAV值排序見表 5，計算得出我國PHE的急性基準閾值CMC為0.033 mg·L-1，該值是由FAV(0.066 mg·L-1)除以評價因子(通常取值為2)所得.由于我國PHE慢性毒性數(shù)據(jù)稀少，本文采用“指南”推薦的FCV=FAV/FACR方法計算FCV值，F(xiàn)ACR(5.51)是通過3種水生生物SACR的幾何平均值算出(本研究中大型溞、錦鯉和泥鰍的SACR分別是4.18、5.86和6.82)，最終得出FCV值為0.012 mg·L-1，而FCV值遠遠低于PHE植物毒性值(浮萍，0.658 mg·L-1)，因此能對植物起到保護作用.“指南”指出，CCC是由FCV、FPV和FRV中較小的值確定.由于我國相應的MPC和BCF值缺乏，而且植物的敏感性通常遠遠低于動物，因此在很多情況下可以不計算FRV，直接用FCV值計算CCC.最終得出我國PHE的慢性基準閾值CCC為0.012 mg·L-1.

 　　4 討論

　　前人研究報道大型溞的96 h LC50為0.230 mg·L-1，這與本研究的結果(0.275 mg·L-1)相似.前人通過物種敏感性比較得出麥穗魚對有機污染物特別是殺蟲劑的敏感性較高，Yan等通過毒性試驗發(fā)現(xiàn)麥穗魚對溴代阻燃劑(TBBPA)的敏感性較高，因此，可以初步判斷本土水生生物中，魚類中的麥穗可能是一種對有機化合物相對敏感的物種.Edsall等研究發(fā)現(xiàn)虹鱒魚苗對有機氯農(nóng)藥(OCPs)較為敏感.另外，Wang等通過毒性試驗發(fā)現(xiàn)，泥鰍對廣譜抗菌劑三氯生(TCS)的敏感性較高，但本文的試驗結果發(fā)現(xiàn)泥鰍對PHE的敏感性最低，這可能是由于不同化合物對水體底層的水生生物產(chǎn)生毒性影響不盡相同導致的(Paolo et al., 2004).

　　由于美國生物毒性數(shù)據(jù)不包括昆蟲和兩棲類水生生物，將本土昆蟲類搖蚊幼蟲、兩棲類動物澤蛙蝌蚪的毒性數(shù)據(jù)去除之后再次進行K-S檢驗，p=0.13>0.05(Ks= 0.830, n1 = 8, n2= 7).因此，這表明PHE本土與美國生物的敏感性不存在顯著性差異，這表明直接使用美國水生生物毒性數(shù)據(jù)來推導我國本土水生生物基準閾值是可行的，這與前人研究結果相符.

　　另外，借助荷蘭RIVM公布的ETX2.0軟件及環(huán)保部《淡水水生生物水質基準制定技術指南》推薦的敏感度分布(SSD)法求出HC5值，分別是0.102和0.0854 mg·L-1.因此當評價因子確定為2時，這兩種SSD曲線計算得出的CMC分別為0.051和0.0427 mg·L-1，可以看出，與US EPA“指南”中推薦的SSR法求出的CMC(0.033 mg·L-1)相比較同在一個數(shù)量級.

　　5 結論

　　1) 采用US EPA“指南”推薦的方法對菲本土水生生物急性基準閾值(CMC)和慢性基準閾值(CCC)進行了推導，分別為0.033 mg·L-1和0.012 mg·L-1;另外，借助荷蘭RIVM公布的ETX2.0軟件及歐盟推薦的SSD方法進行基準閾值的驗證，結果顯示兩種方法所得閾值與SSR法處在同一數(shù)量級.具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關技術文檔。

　　2) 本土與美國物種之間敏感性不存在顯著性差異，這表明存在使用美國水生生物毒性數(shù)據(jù)來推導我國菲水生生物基準閾值的可能性.