1 引言

　　近年來, 馴化和富集培養(yǎng)活性污泥微生物進(jìn)行脫氮除磷是污水處理工藝的研究熱點(diǎn).隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展, 很多研究者通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對活性污泥細(xì)菌的種類和數(shù)量進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量.實(shí)時(shí)熒光定量PCR準(zhǔn)確性的前提是活性污泥中的微生物盡可能的被抽提完全, 模板的質(zhì)量較好, 純度較高, 定量PCR時(shí)抑制效應(yīng)盡可能降到最低.污水處理的活性污泥樣品成分復(fù)雜, 在研究活性污泥主要化學(xué)成分時(shí)發(fā)現(xiàn), 腐殖酸是除蛋白質(zhì)之外所占比重最大的高分子化合物;佟娟等(2009)在剩余污泥堿性發(fā)酵液中也發(fā)現(xiàn)了腐殖酸的存在, 并且研究了采用堿破解方法提取污泥中腐殖酸的方法.腐殖酸廣泛地存在于天然水體和污泥中, 其中, 大量的腐殖酸在DNA抽提時(shí)較難去除, 基因組中殘留的腐殖酸會(huì)抑制酶的活性, 從而抑制PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 降低實(shí)時(shí)熒光定量PCR的準(zhǔn)確性, 影響對活性污泥樣品中微生物數(shù)量豐度或功能豐度的檢測及對污水處理工藝中微生物所扮演角色的意義的準(zhǔn)確解析.

　　已有的研究表明, 稀釋模板、去除腐殖酸都可以降低腐殖酸對定量PCR的抑制效應(yīng).目前主要的腐殖酸去除方法有兩大類, 一類是在基因組抽提前去除土壤中的腐殖酸, 另一類是在基因組抽提后去除基因組中殘留的腐殖酸.活性污泥本質(zhì)上是人工馴化培養(yǎng)的含有功能微生物的土壤, 腐殖酸的含量較高, 去除活性污泥腐殖酸和梯度稀釋活性污泥基因組模板對定量PCR抑制效應(yīng)的影響尚未見報(bào)道, 模板稀釋到何種程度對于抑制效應(yīng)有明顯的改善尚不明確.

　　基于此, 本文通過研究不同方法去除活性污泥腐殖酸的效果, 以及外加內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒、梯度稀釋模板后定量PCR抑制效應(yīng)的變化, 以闡明腐殖酸的去除對活性污泥定量PCR準(zhǔn)確性的影響.

　　2 材料與方法

　　 2.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　取厭氧氨氧化中試反應(yīng)啟動(dòng)成功的活性污泥, 置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?

　　2.2 腐殖酸的去除

　　取上述活性污泥, 使用購自于上海生工的土壤腐殖酸清除劑, 按照說明書進(jìn)行抽提前活性污泥腐殖酸的去除;使用購自于上海生工的柱式腐殖酸清除劑, 按照說明書對抽提后的基因組DNA進(jìn)行腐殖酸的去除.實(shí)驗(yàn)共4組, 分別為抽提前腐殖酸去除組(前)、抽提后腐殖酸去除組(后)、無腐殖酸去除的對照組(對照)、抽提前后腐殖酸共同處理組(前+后).

　　2.3 基因組DNA的抽提

　　在抽提DNA前為了防止活性污泥的異質(zhì)性帶來的誤差, 準(zhǔn)確稱取厭氧氨氧化中試反應(yīng)啟動(dòng)成功的1.00 g(濕重)活性污泥和1.00 g(濕重)抽提前去除腐殖酸的活性污泥于帶刻度的10 mL試管中, 用PBS緩沖液(pH=7.4, 濃度為0.20 mol·L-1)定容至10 mL后, 充分混勻成土壤勻液, 混勻后確保試管底部沒有固體顆粒物殘留.吸取5 mL勻液于5 mL的離心管中(合0.5 g鮮土), 4 ℃、12000 r·min-1離心2 min, 倒掉上清液.離心管中的活性污泥再用PBS洗滌2次后, 用美國MP公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(FastDNA Spin kit for soil, MP-116560)對活性污泥進(jìn)行基因組的提取.

　　2.4 DNA酶消化基因組DNA

　　取50 μL上述4組抽提的基因組DNA, 分別加入DNA酶Ⅰ5 μL、10×Buffer 5 μL(普洛麥格公司), 37 ℃水浴30 min后，加終止液5 μL, 65 ℃水浴10 min, 即得到4組不含DNA的腐殖酸雜質(zhì).分別為DNA酶Ⅰ消化抽提前腐殖酸去除組(前+酶)、DNA酶Ⅰ消化抽提后腐殖酸去除組(后+酶)、DNA酶Ⅰ消化無腐殖酸去除的對照組(對照+酶)、DNA酶Ⅰ消化抽提前后腐殖酸共同處理組(前+后+酶).

　　2.5 DNA濃度的測定及PCR反應(yīng)

　　利用核酸蛋白測定儀NanoDrop2000檢測基因組的A260/230、A260/280和濃度.采用2%的瓊脂糖凝膠, 95 V電泳35 min, 檢測基因組抽提的完整性及質(zhì)量.以上述8種處理后的基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng), 引物序列見表 1.0.2 mL PCR管中配置20 μL體系如下：0.2 μL TaKaRa Taq (5 U·mL-1)、2 μL 10×PCR Buffer (Mg2+ Plus)、2 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol·L-1)、2 μL模板(10 ng·μL-1)、上、下游引物各1 μL(1 nmol·L-1)、滅菌蒸餾水加至20 μL.將上述反應(yīng)液離心、混勻、再離心, 在PCR儀中進(jìn)行以下循環(huán)：95 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s, 63 ℃退火30 s, 72 ℃延伸5 s, 30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;反應(yīng)體系溫度最后降至4 ℃, 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析.

 　　2.6 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

　　按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0的操作說明對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收(總細(xì)菌V3~V4區(qū)產(chǎn)物長度190 bp).回收的PCR產(chǎn)物根據(jù)天根pGM-T克隆試劑盒的說明進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、涂平板、挑取陽性單克隆菌落、搖菌、抽質(zhì)粒(質(zhì)粒快速提取試劑盒, 天根生化科技有限公司), 送上海生工生物公司進(jìn)行測序鑒定, 最終得到總細(xì)菌V3~V4區(qū)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品.用核酸蛋白測定儀測定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的A260/230、A260/280和濃度.根據(jù)公式(1)計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)G(copies·μL-1).

　　式中, M為拷貝DNA分子的堿基對數(shù)(bp·copy-1);W為1個(gè)堿基對的分子質(zhì)量(660 u·bp-1);CDNA為DNA濃度(ng·μL-1).

　　2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及總細(xì)菌16S rDNA V3~V4區(qū)的定量檢測

　　10倍梯度稀釋10 ng·μL-1的總細(xì)菌質(zhì)粒成5個(gè)濃度, 作為絕對定量PCR的模板, 建立總細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線.以10 ng·μL-1的4個(gè)處理組DNA及DNA酶Ⅰ消化的4個(gè)基因組DNA為模板, 進(jìn)行定量PCR.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組總細(xì)菌16S rDNA的絕對拷貝數(shù).將濃度為10 ng·μL-1的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒與2.4節(jié)中的前+酶組、對照+酶組混合后, 用滅菌的超純水將上述混合液10倍梯度稀釋成5個(gè)濃度, 作為絕對定量PCR的模板, 進(jìn)行定量PCR.將10 ng·μL-1的2.2節(jié)中的前組和對照組DNA10倍梯度稀釋成5個(gè)濃度, 作為絕對定量PCR的模板, 進(jìn)行定量PCR.反應(yīng)體系為20 μL, 反應(yīng)組分為：Mix 12.5 μL, 上、下游引物各0.58 μL(1 nmol·L-1), 模板2 μL, 滅菌三蒸水9.5 μL.反應(yīng)條件同常規(guī)PCR, 總延伸結(jié)束后, 加入熔解曲線的制備(95 ℃保持15 s, 60 ℃保持1 min, 95 ℃保持15 s)步驟.

　　2.8 絕對拷貝數(shù)及抑制效應(yīng)的計(jì)算

　　Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù).將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得的Ct值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系式中的Y值, 得到X值, 10X即為各組模板的絕對拷貝數(shù), 單位為copies·g-1.腐殖酸的抑制效率I=(P-T)/P×100%, 其中, P為加入的總細(xì)菌內(nèi)標(biāo)質(zhì)�？截悢�(shù)(copies·g-1), T為內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒與腐殖酸混合組的總細(xì)菌拷貝數(shù)(copies·g-1).

　　2.9 數(shù)據(jù)分析

　　所有的數(shù)據(jù)都來自于3個(gè)獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, 使用Dunnett′s檢驗(yàn)比較各個(gè)處理組與對照組的差異, 在0.05的水平上進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性差異分析.

　　3 結(jié)果(Results) 3.1 基因組DNA的濃度及質(zhì)量

　　為了研究不同腐殖酸去除方法對活性污泥基因組抽提質(zhì)量的影響, 表 2調(diào)查了不同去除方法和DNA酶Ⅰ消化后的模板濃度和質(zhì)量, 抽提前腐殖酸去除組的A260/230值(1.34)、A260/280值(1.80)較對照組高, 與其它各組相比, 更接近于高質(zhì)量基因組的標(biāo)準(zhǔn).這可能與抽提后的去除法引入了一些殘留的有機(jī)溶劑, 而抽提前的去除法引入的有機(jī)溶劑通過DNA提取過程得以消除有關(guān).表 2中抽提前腐殖酸去除組的DNA濃度(162.46 ng·μL-1)高于其它各組.以上結(jié)果表明, 抽提前腐殖酸去除的方法既保證了DNA的得率又提高了模板質(zhì)量.

　　對8種處理后的模板進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 由圖 1可知, 未用DNA酶Ⅰ消化后的各組都有基因組主帶, 明亮單一, 可以作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板;用DNA酶Ⅰ消化后的各組基因組被降解, 沒有條帶, 說明剩余雜質(zhì)的主要成分為腐殖酸.

 　　3.2 總細(xì)菌16S rDNA V3~V4區(qū)PCR瓊脂糖凝膠電泳

　　為了驗(yàn)證DNA酶處理后的基因組能否作為模板進(jìn)行總細(xì)菌V3~V4區(qū)的PCR擴(kuò)增, 以總細(xì)菌V3~V4區(qū)的引物進(jìn)行PCR, 瓊脂糖電泳結(jié)果如圖 2所示.由圖 2可知, 未經(jīng)DNA酶Ⅰ處理的組1、3、5、7在190 bp處擴(kuò)增出目的條帶, 經(jīng)過DNA酶Ⅰ處理的組2、4、6、8沒有擴(kuò)增出目的條帶.與此同時(shí), 以DNA酶Ⅰ消化過的4個(gè)組為模板, 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 所得的Ct值與陰性對照基本相同, 說明DNA酶Ⅰ已將各活性污泥基因組模板消化完全.

 　　3.3 活性污泥總細(xì)菌的絕對拷貝數(shù)

　　為了探究腐殖酸的去除是否影響活性污泥實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 分別以10 ng·μL-1的抽提前腐殖酸去除組、抽提后腐殖酸去除組、抽提前后腐殖酸同時(shí)去除組、對照的基因組為模板, 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 結(jié)果見圖 3.圖 3中, 抽提前腐殖酸去除組的拷貝數(shù)(3.71×109 copies·g-1)最高, 抽提后腐殖酸去除組的拷貝數(shù)(3.64×109 copies·g-1)和抽提前后腐殖酸共同去除組的拷貝數(shù)(3.62×109 copies·g-1)次之, 對照組的拷貝數(shù)(2.68×109 copies·g-1)顯著低于前3組(p < 0.05), 說明抽提前去除腐殖酸的擴(kuò)增效率最高, 抑制效應(yīng)最低.這與表 2的結(jié)果一致, 說明抽提前去除活性污泥腐殖酸的方法更為可取.

 　　3.4 梯度稀釋后活性污泥總細(xì)菌定量PCR的Ct值

　　為了深入研究抽提前活性污泥腐殖酸的去除及模板濃度對定量PCR擴(kuò)增的影響, 以雜質(zhì)腐殖酸10倍梯度稀釋已知濃度的總細(xì)菌內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒, 定量的Ct值如圖 4a所示.由圖 4a可知, 隨著目的基因拷貝數(shù)(GA)對數(shù)值的降低, 抽提前去除過腐殖酸的內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒組Ct值逐漸低于對照組, 梯度稀釋模板1~100倍的Ct值差值增加, 梯度稀釋模板100~10000倍的Ct值基本無變化, 說明梯度稀釋去除腐殖酸的活性污泥基因組模板100倍以上(含100倍), 可提高定量PCR的擴(kuò)增效率, 降低腐殖酸對活性污泥定量PCR的抑制效應(yīng).

 　　為了研究梯度稀釋抽提前去除腐殖酸的活性污泥總細(xì)菌定量PCR結(jié)果是否與上述結(jié)果一致, 以10倍梯度稀釋抽提前去除腐殖酸的基因組為模板, 進(jìn)行定量PCR(圖 4b).圖 4b中抽提前腐殖酸去除組1~1000倍梯度稀釋模板的Ct值稍低于對照組;10000倍梯度稀釋模板的Ct值較對照組有明顯的降低.圖 4說明, 去除腐殖酸與一定濃度的稀釋模板都能降低腐殖酸對活性污泥總細(xì)菌定量PCR的抑制, 模板稀釋雖然降低了腐殖酸的抑制效應(yīng), 但Ct值可能會(huì)超出可信的范圍, 直接去除活性污泥腐殖酸比稀釋活性污泥基因組模板更實(shí)用.

　　3.5 腐殖酸去除后的抑制效應(yīng)

　　為了進(jìn)一步研究活性污泥腐殖酸的去除及活性污泥基因組模板濃度的變化對抑制效應(yīng)的影響, 表 3對腐殖酸去除后的抑制效應(yīng)進(jìn)行了調(diào)查.表 3結(jié)果顯示, 抽提前腐殖酸去除組和對照組的雜質(zhì)中加入的內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒濃度為1.53×105 copies·g-1, 抽提前腐殖酸去除的雜質(zhì)組抑制效應(yīng)為6.16%，顯著低于對照雜質(zhì)組的72.68%(p < 0.05), 說明抽提前去除腐殖酸降低了抑制效應(yīng), 顯著提高了活性污泥定量PCR的準(zhǔn)確性.

 　　4 討論

　　 4.1 不同階段活性污泥的腐殖酸含量

　　反應(yīng)器不同運(yùn)行階段, 其含水率、pH、溶解氧、反應(yīng)速率和效能不同, 活性污泥樣品引入的干擾可能不同, 特別是通過影響酶活性來影響定量PCR擴(kuò)增效率的雜質(zhì)腐殖酸)發(fā)現(xiàn), 湖泊沉積物中的內(nèi)參基因受到腐殖酸的抑制明顯.厭氧氨氧化活性污泥樣品提取的DNA顏色有點(diǎn)發(fā)黃, 與圖 3、圖 4和表 3的結(jié)果一起說明活性污泥中存在腐殖酸.通常情況下, 通過DNA提取過程中的純化步驟來減弱腐殖酸對PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng).本研究通過基因組抽提前腐殖酸去除試劑盒和梯度稀釋模板100倍降低定量PCR的抑制效率, 顯著提高了定量PCR的準(zhǔn)確性.

　　4.2 影響活性污泥定量準(zhǔn)確性的因素

　　活性污泥的含水率和雜質(zhì)不同, 可能會(huì)導(dǎo)致基因組抽提時(shí)DNA得率的差異較大, 影響定量PCR檢測的準(zhǔn)確性.本研究通過抽提前3次PBS的重復(fù)清洗及3組重復(fù)抽提混合后使用, 減少樣本的異質(zhì)性和抽提隨機(jī)性的誤差, 提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確率.在定量PCR之前, 通過提高DNA得率的方法可以間接提高目標(biāo)基因絕對定量的準(zhǔn)確性, 然而得率的提高往往意味著DNA條帶斷裂的增加及樣品純度的降低.本研究通過基因組瓊脂糖電泳圖證明DNA抽提的完整性較好(圖 1), 在腐殖酸有效去除的同時(shí), 保證了較高的基因組得率162.46 ng·μL-1(表 2).此外, 當(dāng)腐殖酸無法有效去除時(shí), 也可通過在基因組抽提前加入特異性基因作為內(nèi)參加標(biāo)物計(jì)算腐殖酸的抑制效應(yīng)，來評估定量PCR結(jié)果以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量.

　　4.3 抽提前去除腐殖酸的意義

　　活性污泥中的細(xì)菌緊緊地粘附在泥樣上, 反應(yīng)器進(jìn)水和出水時(shí), 細(xì)菌隨泥樣一起停留在反應(yīng)器中得以擴(kuò)大培養(yǎng).這種污泥微生物聚集體可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌裂解不完全, 抽提的基因組低于污泥中的總細(xì)菌含量.降低細(xì)菌與污泥之間的粘附力, 使其在抽提時(shí)較好的分離, 對定量PCR準(zhǔn)確性的提高意義重大.腐殖酸對系統(tǒng)內(nèi)菌群種類、數(shù)量及系統(tǒng)的運(yùn)行效能有較大影響, 可以促進(jìn)污泥良好結(jié)構(gòu)體的形成, 影響污泥表面性質(zhì), 抽提前去除活性污泥中的腐殖酸可能對細(xì)菌與污泥的分離具有積極意義.抽提前去除也減少了抽提過程中或抽提后的純化對DNA完整性的破壞.本研究中的圖 1和表 2顯示, 抽提前去除較抽提后去除腐殖酸, DNA的得率和質(zhì)量更好.此外, 稀釋基因組模板100倍以上, 基因組中腐殖酸的濃度得到了稀釋, 對定量PCR的抑制效應(yīng)降低, 但活性污泥抽提的基因組濃度有限, 較大倍比地稀釋基因組, 定量PCR的Ct值可能會(huì)超出可信的范圍, 降低定量PCR的可信度.圖 4表明, 基因組抽提前去除活性污泥中的腐殖酸較稀釋模板更能有效地降低腐殖酸對定量的抑制效應(yīng), 提高定量PCR的準(zhǔn)確性.

　　5 結(jié)論

　　1) 基因組抽提前通過反復(fù)洗脫的方式對活性污泥中的腐殖酸進(jìn)行去除, 基因組的得率(162.46 ng·μg-1)最多, A260/230值為1.34, A260/280值為1.80, 腐殖酸的殘留最少, 基因組質(zhì)量最高.

　　2) 腐殖酸對定量PCR的擴(kuò)增具有抑制效應(yīng), 隨著濃度的降低抑制效應(yīng)先降低后保持不變.具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3) 使用基因組抽提前腐殖酸去除試劑盒去除活性污泥腐殖酸, 稀釋模板100倍(0.1 ng·μg-1), 定量PCR的抑制效率由72.68%降低到6.16%(p < 0.05), 顯著提高了定量PCR的準(zhǔn)確性.