酵母菌在處理高濃度有機(jī)廢水時(shí)具有一定的優(yōu)勢，如處理負(fù)荷高、需氧量低、可降解油和脂肪以及可回收單細(xì)胞蛋白等，但系統(tǒng)運(yùn)行的穩(wěn)定性問題一直限制著該技術(shù)的工程化應(yīng)用. SRT是活性污泥法處理廢水中一個(gè)重要參數(shù)，影響著系統(tǒng)中的污泥濃度、污泥產(chǎn)率、污泥沉降性、微生物群落結(jié)構(gòu)以及胞外聚合物 (EPS) 的組成及含量等. EPS是活性污泥絮體中促使微生物凝聚的關(guān)鍵物質(zhì)，是影響活性污泥絮凝沉降性能及表面性質(zhì)的重要因素.目前關(guān)于活性污泥中EPS與污泥沉降性的研究表明，EPS總量與污泥絮凝性存在正相關(guān)性.但對于酵母菌廢水處理系統(tǒng)而言，主體微生物是酵母菌群，有別于以細(xì)菌為主體的活性污泥.迄今為止，尚未見有關(guān)SRT對酵母菌在廢水處理系統(tǒng)中產(chǎn)EPS及EPS對酵母沉降性的影響的報(bào)道.本研究在小型SBR反應(yīng)器中考察不同SRT對酵母菌產(chǎn)EPS、EPS組成以及EPS對酵母沉降性的影響，并利用PCR-DGGE及克隆測序解析了長、短SRT下的酵母群落結(jié)構(gòu)，試圖探明SRT對酵母菌處理油脂廢水穩(wěn)定性的影響，以期為建立高效穩(wěn)定的酵母廢水處理系統(tǒng)奠定基礎(chǔ).

　　1 材料及方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　本研究使用3株酵母菌：分別是O2(Candida tropidalis)、G1(Candida lipolytica)、W1(Candida halophila).菌株活化方法參見文獻(xiàn).

　　油脂廢水取自寧波市某油脂生產(chǎn)企業(yè)的堿煉車間，廢水COD在20 000 mg ·L-1左右.將所取廢水根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需進(jìn)行稀釋，稀釋后的廢水水質(zhì)為：COD 6 500~8 500mg ·L-1;TN 3.4~5.8 mg ·L-1;TP 32.4~45.4 mg ·L-1;BOD5 1 950~3 200mg ·L-1;油1 817~2 258 mg ·L-1;pH 6.5~8.8.

　　1.2 實(shí)驗(yàn)裝置以及運(yùn)行條件

　　實(shí)驗(yàn)在4個(gè)有效容積為2 L的小型SBR反應(yīng)器中進(jìn)行，由程序控制器控制周期性運(yùn)行.廢水稀釋后，根據(jù)廢水的BOD5添加 (NH4)2SO4、KH2PO4使BOD5 :N :P為100 :5 :1.一個(gè)運(yùn)行周期為曝氣9 h，靜置沉降3 h，排水比為1/2.靜置期間更換新配制的廢水，同時(shí)將混合液pH調(diào)整至5.0~5.5，溫度控制在28℃左右，溶解氧維持在0.5~1.5mg ·L-1.

　　1.3 實(shí)驗(yàn)方法

　　將活化的復(fù)合酵母培養(yǎng)物投入到一個(gè)有效體積為10 L的有機(jī)玻璃容器內(nèi)，加入COD為3 000~4 000 mg ·L-1的含油廢水，添加氮源、磷源使廢水BOD :N :P為100 :5 :1，同時(shí)調(diào)節(jié)廢水的pH至5.0~5.5，進(jìn)行曝氣培養(yǎng).培養(yǎng)4 d后將廢水COD逐漸提升至7500mg ·L-1左右，待系統(tǒng)的MLSS增長至5.3 g ·L-1，轉(zhuǎn)移酵母至小型SBR反應(yīng)器中.本實(shí)驗(yàn)酵母的MLVSS/MLSS為90.93%，接種MLSS為4.5 g ·L-1.本實(shí)驗(yàn)采用每天定時(shí)定量排泥的方式控制SRT，各反應(yīng)器的SRT依次設(shè)計(jì)為5、10、20、40 d.為保證反應(yīng)器基本進(jìn)入穩(wěn)態(tài)運(yùn)行，每個(gè)SBR基本運(yùn)行兩倍以上的SRT時(shí)間 (除了SRT=40 d的系統(tǒng)，后期出現(xiàn)了SVI急劇上升).

　　1.4 分析方法

　　COD：采用快速消解儀DRB200及DR1010 COD (美國HACH) 分析儀測定，處理后出水經(jīng)過5 000 r ·min-1，5 min離心后取上清液測定COD;油含量：采用四氯化碳萃取法，使用OIL480紅外測油儀 (北京華夏科創(chuàng)) 測定;BOD5采用BOD Trak (美國HACH) 測定;pH: HM-30P便攜式pH儀 (日本DKK-TOA);MLSS及MLVSS采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定.

　　本實(shí)驗(yàn)中，緊密黏附胞外聚合物 (TBEPS) 中蛋白質(zhì)和多糖含量視為TBEPS總量;松散附著胞外聚合物 (LBEPS) 中2種組分之和視為LBEPS總量. LBEPS提取方法：分別取一定體積的污泥混合液，8 000 r ·min-1離心10 min，去上清液.將上述污泥沉淀重新懸浮于0.9%NaCl溶液中，放置于超聲分離器中，超聲分離5 min, 然后在12 000 r ·min-1離心15 min, 上清液即為LBEPS，收集上清液測定其中多糖及蛋白質(zhì)含量. TBEPS提取方法[14]：將提取LBEPS后的污泥重新懸浮，然后在80℃下水浴提取30 min, 在12 000 r ·min-1離心15 min，獲得的上清液即為TBEPS，收集上清液測定其中多糖及蛋白質(zhì)含量.多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定.

　　1.5 系統(tǒng)中酵母群落結(jié)構(gòu)分析1.5.1 DNA提取

　　取各SBR中混合液1.5 mL于2 mL的離心管中，8 000 r ·min-1下離心2min，棄上清，使用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒 (美國Mpbio) 提取生物樣的DNA.提取的DNA存放于-20℃冰箱保存.

　　1.5.2 PCR-DGGE

　　PCR擴(kuò)增：上游引物GC1-NL1(5′-GCATAT CAA TAAGCG GAG GAA AAG-3′) 和下游引物L(fēng)S2(5′-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3′).引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成. 50 μL PCR反應(yīng)體系包含：1 μL模板DNA，1 μL引物 (正向和反向引物各0.5 μL)，23 μL RNA Freewater, 25 μL Premix (Takara Taq Version 2.0 plus dye).

　　PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性條件為95℃ 5 min;30個(gè)循環(huán)為變性95℃ 60 s退火52℃ 45 s，延伸72℃ 60 s;最后在72℃下延伸7 min. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

　　DGGE電泳：在變性梯度凝膠電泳儀 (Bio-Rad) 上進(jìn)行.丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑梯度為30%~50%.向PCR擴(kuò)增的50 μL體系中加入6×loading buffer 10 μL，充分混合后點(diǎn)樣35 μL.電泳條件：60℃、120 V下運(yùn)行6~8 h，電泳完畢后，將凝膠在含0.01% SYBR (Biotium) 的高純水中染色20 min，取出后用去離子水清洗2次，每次5 min，最后置于Gel DocXR (Bio-Rad, USA) 凝膠成像系統(tǒng)拍照.

　　1.5.3 16S rRNA克隆和測序

　　對DGGE凝膠中出現(xiàn)的新的條帶進(jìn)行切膠回收及純化，純化后的樣品再用PMD19-T (Takara) 載體進(jìn)行連接 (16℃連接16h)，然后取-80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli DH5α(Takara) 迅速融合并置于冰上，加入10 μL連接液，輕輕搖勻置于42℃水浴鍋靜置90 s，然后轉(zhuǎn)入冰浴1~2 min后加入新鮮LB培養(yǎng)基890 μL，放置在預(yù)設(shè)為37℃的恒溫振蕩器中170r ·min-1處理1 h.然后涂布到含有氨芐青霉素/IPTG/X-Gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃下培養(yǎng)16 h，并設(shè)置對照.隨機(jī)選取一定數(shù)量的白色陽性克隆子，經(jīng)液體培養(yǎng)后送至上海英駿公司進(jìn)行序列測定.將測定的目的基因片段序列與GenBank中已知序列進(jìn)行比對 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

　　2 結(jié)果與討論2.1 SRT對COD和油去除率的影響

　　不同SRT下酵母菌對COD和油的去除效果如圖 1所示.從中可以看出，在運(yùn)行初期，SRT為20 d的系統(tǒng)對COD和油的去除率均較高，第5 d后SRT為5 d的系統(tǒng)對COD和油的去除效果最好，而SRT為10 d和20 d的效果較接近.可能的原因是，將擴(kuò)大培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞投入到不同SRT的系統(tǒng)中時(shí)，細(xì)胞需要經(jīng)過適應(yīng)新F/M的調(diào)整期，而SRT為20 d的系統(tǒng)是最接近原培養(yǎng)系統(tǒng)SRT的，所以適應(yīng)期短;而SRT=5 d的系統(tǒng)由于周期排泥量最大，因而對系統(tǒng)中酵母生物量沖擊較大，所以運(yùn)行初期處理效果較差，而隨后酵母細(xì)胞適應(yīng)此排泥周期，且該SRT條件下酵母新陳代謝快，所以處理效果逐漸變?yōu)樽詈?對SRT為40 d的系統(tǒng)，運(yùn)行到30 d后處理效果逐漸變?yōu)樽畈�，這是由于對于SRT為40 d的系統(tǒng)排泥量少，老齡化酵母細(xì)胞多，代謝活力低.就不同SRT對油去除率的影響來看，除了SRT為40 d的系統(tǒng)以外，其他SRT下油的去除率差異不大.

圖 1 SRT對COD和油去除率的影響

　　2.2 SRT對EPS的組成及含量的影響

　　EPS是活性污泥絮體中繼水分和細(xì)胞后的第三大組成部分，主要是細(xì)菌細(xì)胞新陳代謝分泌的高分子聚合物聚集在細(xì)胞外部，形成絮凝膠體物質(zhì)，同時(shí)還含有廢水中的某些物質(zhì)，即污泥所處的基質(zhì)環(huán)境. Ravella等研究表明酵母菌也能產(chǎn)生EPS. TBEPS位于里層，與細(xì)胞表面結(jié)合較緊，穩(wěn)定地附著于細(xì)胞壁外，具有一定外形;LBEPS位于TBEPS外層，具有較松散的結(jié)構(gòu)，是可向周圍環(huán)境擴(kuò)展、無明顯邊緣的黏液層. EPS的主要成分是糖類和蛋白質(zhì)，兩者的總有機(jī)碳占整個(gè)EPS的70%~80%.有研究表明，SRT不僅影響著EPS的總量，還影響其組成成分及比例.

　　不同SRT條件下酵母系統(tǒng)中LBEPS的組成和含量的變化如圖 2所示，可以看出，對于酵母菌來說，LBEPS的主要成分是多糖，蛋白質(zhì)含量很少，且EPS總量隨SRT的增大而減少.根據(jù)勞倫斯-麥卡蒂方程及其衍生關(guān)系式1/θC=Y×Nrs-Kd可知SRT與負(fù)荷呈負(fù)相關(guān). Batstone等、李久義等認(rèn)為EPS與污泥負(fù)荷呈正比 (即與SRT呈反比)，所以在低SRT情況下F/M較高，微生物細(xì)胞不能將所有碳源用于細(xì)胞合成，多余的含碳基質(zhì)可以轉(zhuǎn)化成胞內(nèi)存儲(chǔ)粒子和在EPS中積累的胞外高分子.從圖 2可看出，對SRT為5 d、10 d的系統(tǒng)，在開始的4~5 d內(nèi)，LBEPS呈遞增的趨勢，這可能是由于酵母系統(tǒng)對新環(huán)境的一種適應(yīng)過程，為了適應(yīng)較短的SRT，酵母細(xì)胞新陳代謝比較旺盛，所以將油脂廢水中脂肪酸轉(zhuǎn)化為多糖的量也增多，導(dǎo)致多糖積累，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，LBEPS也基本穩(wěn)定.對于SRT為40 d的系統(tǒng)，從30 d后有大幅度的降低，這是由于隨著運(yùn)行的持續(xù)，酵母產(chǎn)乳化劑能力相對于酵母增長能力減弱，表現(xiàn)為油脂降解能力下降[見圖 1(b)]，同時(shí)酵母細(xì)胞的菌絲化也影響了油脂的代謝，此時(shí)酵母細(xì)胞為維持自身生理代謝，可能對EPS中的多糖類物質(zhì)進(jìn)行降解.

　　利用Matlab數(shù)據(jù)分析軟件將SRT為5、10、20、40 d作為因素X1, 不同時(shí)間段測得的LBEPS為X2進(jìn)行差異性分析，得α=0.000(α < 0.01)，即不同SRT條件下LBEPS含量具有顯著性差異，說明SRT對酵母處理油脂廢水LBEPS的產(chǎn)生影響顯著.

圖 2 SRT對LBEPS的組成和含量影響

　　圖 3反映了各系統(tǒng)中TBEPS的變化.可以看出TBEPS仍然以多糖為主，結(jié)合圖 2，TBEPS的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于LBEPS，大約是后者10倍左右，這與一些研究的結(jié)果一致. TBEPS的組成及含量變化與LBEPS相同，含量隨著SRT的增大而減少.對于SRT為5、10、20 d的系統(tǒng)在最初5 d內(nèi)TBEPS有所增加，這是酵母對新環(huán)境的一種適應(yīng)，隨后逐漸穩(wěn)定.對于SRT為40 d的系統(tǒng)，隨著時(shí)間的延長，酵母細(xì)胞老齡化及代謝產(chǎn)物的積累，酵母細(xì)胞有絲化現(xiàn)象，絲化后酵母細(xì)胞對油脂類代謝能力減弱，進(jìn)而轉(zhuǎn)為利用和代謝TB多糖，導(dǎo)致在20 d后TBEPS逐漸減少.

圖 3 v

　　同樣以SRT為5、10、20、40 d作為因素X1，不同時(shí)間段測得的LBEPS為X2進(jìn)行差異性分析，得α=0.00(α < 0.05)，可以認(rèn)為不同SRT條件下測得的TBEPS具有顯著性差異，說明SRT對酵母處理油脂廢水TBEPS的產(chǎn)生也有顯著影響.

　　2.3 SRT對酵母污泥SVI的影響

　　對不同SRT下4個(gè)系統(tǒng)的SVI進(jìn)行了連續(xù)監(jiān)測，結(jié)果如圖 4所示.從中可以看出, 在前20 d運(yùn)行中SVI基本穩(wěn)定，SVI值隨SRT的延長而增大，說明增大SRT會(huì)引起SVI值升高，與陶麗佳等的研究結(jié)論相同.但從18 d后，直至30 d間污泥的SVI值隨SRT延長反而減小，可見其規(guī)律有別于普通活性污泥，這可能與酵母細(xì)胞菌絲化有關(guān).在這個(gè)階段，各SRT系統(tǒng)中酵母細(xì)胞均有不同程度絲化現(xiàn)象，由絲化導(dǎo)致了污泥質(zhì)量濃度 (MLSS) 減小，所以總體SVI較運(yùn)行前期要大;此時(shí)，各系統(tǒng)酵母污泥的SV30差異減小，而SRT越長對應(yīng)系統(tǒng)中的MLSS越大，因而出現(xiàn)了SVI值隨SRT的增長而降低的現(xiàn)象.運(yùn)行至30 d后，對SRT為40 d的系統(tǒng)，SVI值呈直線上升，一方面是由于較長的SRT條件下，EPS的濃度相對較低 (見圖 2和圖 3)，不利于酵母細(xì)胞絮凝;另一方面酵母細(xì)胞由酵母型向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致污泥呈蓬松狀態(tài)，難以沉降，周期性排泥導(dǎo)致更低的MLSS. SRT為20 d的系統(tǒng)中SVI的變化與前者相似，但變化幅度稍微緩慢，推測與細(xì)胞不同的絲化程度有關(guān).圖 5為不同SRT下各系統(tǒng)在運(yùn)行后期的顯微鏡圖片.比較可以看出，在SRT為5 d時(shí)系統(tǒng)中酵母絮體中菌絲很少;SRT為10、20、40 d時(shí)菌絲化程度遞增，在SRT為40 d時(shí)可以觀察到明顯的細(xì)胞絲化現(xiàn)象.通過Matlab對SRT和SVI因素進(jìn)行差異性分析，得α=0.45，可以認(rèn)為不同SRT條件下測得的SVI不具有顯著性差異，說明在當(dāng)前區(qū)間內(nèi)SRT對酵母處理油脂廢水SVI的影響不顯著.因此，不同SRT對酵母系統(tǒng)的影響，可能更多地體現(xiàn)在SRT對酵母細(xì)胞菌絲化程度的影響，低SRT更有利于細(xì)胞絲化的控制.

圖 4 不同SRT下各SBR中污泥SVI的變化

圖 5 各SRT運(yùn)行后期酵母污泥鏡檢圖片

　　2.4 系統(tǒng)中酵母群落結(jié)構(gòu)解析

　　選取SRT為5 d和SRT為40 d系統(tǒng)，運(yùn)行后期對其生物樣品進(jìn)行PCR-DGGE分析，結(jié)果如圖 6.對比兩個(gè)系統(tǒng)的DGGE圖譜可以看出，初始添加的3株酵母O2、G1、W1在各系統(tǒng)中一直存在，前期研究也表明這3株酵母菌可以穩(wěn)定存在于酵母菌處理含油廢水系統(tǒng)中.隨著系統(tǒng)的運(yùn)行，大約在22 d后，3株菌株的條帶有所減弱，說明對應(yīng)酵母細(xì)胞的濃度有所降低.但與此同時(shí)，在系統(tǒng)運(yùn)行的第10 d，長和短SRT下均出現(xiàn)了另外3個(gè)條帶 (分別命名為1、2、3)，特別對于SRT為40 d的系統(tǒng)，3個(gè)條帶亮度在運(yùn)行后期有所加強(qiáng)，說明對應(yīng)微生物的豐度增強(qiáng).通過對這些新增條帶的切膠、克隆和測序并與GenBank中序列比對，初步判定新增的酵母分別是：1. Candida cylindracea(相似度100%);2. Candida intermedia(相似度99%);3. Yarrowia lipolytica(相似度99%)，結(jié)果見表 1.通過查閱已有研究發(fā)現(xiàn)，這3株酵母均可以利用或者水解橄欖油等油脂，均可以產(chǎn)生脂肪酶，因此3株菌株的出現(xiàn)是系統(tǒng)運(yùn)行過程中自然選擇的一個(gè)結(jié)果，菌株可能來源于廢水.對于SRT為40 d的系統(tǒng)出現(xiàn)的明顯的真菌絲，目前尚不能判定是系統(tǒng)中原有的酵母還是外源性酵母發(fā)生菌絲化而形成，但可以肯定的是，無論是哪種酵母細(xì)胞發(fā)生菌絲化，短SRT比長SRT更能抑制細(xì)胞的絲化程度，從而更有利于系統(tǒng)運(yùn)行的穩(wěn)定.相關(guān)研究結(jié)果表明，白假絲酵母 (Candida albicans) 的細(xì)胞在一定的物質(zhì)條件刺激下可能發(fā)生細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化.對于長SRT的系統(tǒng)，污泥濃度高，老齡細(xì)胞比例大，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物容易在系統(tǒng)中積累，這可能是誘導(dǎo)某些酵母細(xì)胞絲化的原因，具體情況還需要進(jìn)一步的研究.具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

圖 6 不同SRT下系統(tǒng)中酵母群落的DGGE圖譜

　　表 1 系統(tǒng)中外源性酵母16S rRNA基因序列比對結(jié)果

　　3 結(jié)論

　　(1) SRT為5~10 d時(shí)系統(tǒng)對油脂廢水COD和油的去除率較高;長SRT會(huì)使COD處理效果下降，但短期對油的去除率影響不大.

　　(2) 酵母污泥的EPS中以TBEPS為主，EPS的主要成分為多糖，蛋白質(zhì)的含量較少;長SRT會(huì)導(dǎo)致EPS含量降低及酵母污泥的SVI升高.

　　(3) SRT在5~40 d區(qū)間內(nèi)，SRT對酵母污泥的SVI影響差異不顯著;但長SRT有導(dǎo)致系統(tǒng)發(fā)生絲狀菌性膨脹的風(fēng)險(xiǎn).

　　(4) 長期連續(xù)運(yùn)行后系統(tǒng)中均出現(xiàn)了可以利用或降解油脂的外源性酵母菌株.