內(nèi)分泌干擾物被定義為一類能夠干擾或抑制生物體內(nèi)分泌、神經(jīng)、免疫和生殖系統(tǒng)功能, 并產(chǎn)生可逆或不可逆性生物學(xué)效應(yīng)的外源性物質(zhì).在自然界中內(nèi)分泌干擾物以多種形式存在，據(jù)報(bào)道超過(guò)8 700種物質(zhì)具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng).內(nèi)分泌干擾物主要包括固醇類激素、表面活性劑、工業(yè)合成物等.例如，雌酮 (E1)、雌二醇 (E2)、雌三醇 (E3) 是人和動(dòng)物排泄物中主要的天然雌激素. 17α-乙炔基雌二醇 (EE2) 作為口服避孕藥的主要成分，則是合成類固醇激素的主要形式.由于污水處理工藝并不能將內(nèi)分泌干擾物完全去除，污水處理廠出水成為自然水體中內(nèi)分泌干擾物的主要來(lái)源之一.另外，由于內(nèi)分泌干擾物具有一定的親脂性，其很容易在水生生物和低泥中富集，給水生生物帶來(lái)一定的危害.一些研究表明水環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物可導(dǎo)致魚(yú)類體內(nèi)卵黃原蛋白上升、雄魚(yú)雌性化等.因此，檢測(cè)城市污水的雌激素水平和干擾效應(yīng)，并分析研究不同處理工藝的去除效果，對(duì)水環(huán)境的生態(tài)安全評(píng)價(jià)具有重要意義.

　　通常，人們采用化學(xué)分析法對(duì)水環(huán)境中雌激素物質(zhì)進(jìn)行定性或者定量分析，例如高效液相色譜、氣相色譜、高效液相色譜-質(zhì)譜法等.但這些化學(xué)分析法需要較高的成本和熟練的操作技能.此外，水環(huán)境的雌激素物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生拮抗、協(xié)同或者加和作用，而化學(xué)分析法無(wú)法反映化合物之間的相互作用，故其不能表明水環(huán)境雌激素物質(zhì)的潛在效應(yīng).生物檢測(cè)可反映水環(huán)境中化合物的綜合生物效應(yīng).因此，有必要利用生物毒性檢測(cè)法對(duì)水環(huán)境的雌激素效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià).重組酵母菌法是常用的檢測(cè)水環(huán)境雌激素活性的手段.其基本原理是雌激素物質(zhì)能夠和酵母菌攜帶的人體雌激素受體形成復(fù)合物，通過(guò)促進(jìn)報(bào)告基因LacZ的表達(dá)，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，測(cè)定β-半乳糖苷酶的活性即可反映樣品的雌激素活性，它具有靈敏度高、省時(shí)、成本低等優(yōu)點(diǎn).重組酵母菌法被廣泛用于水樣、污泥、底泥以及家庭灶爐等燃燒過(guò)程中排放的污染物的雌激素活性.酶聯(lián)免疫吸附法 (enzyme linked immunosorbent assay，ELSIA) 則是基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)的原理，通過(guò)酶作用于底物后的顯色來(lái)進(jìn)行定量.傳統(tǒng)上其主要用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞和血液中雌激素含量.酶聯(lián)免疫吸附法需要的樣品量少，不需要復(fù)雜的預(yù)處理，具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間和成本、可用于多種毒性指標(biāo)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn).目前，ELISA逐漸被用于水環(huán)境、土壤和低泥中雌激素物質(zhì)的檢測(cè).因此，本研究的主要目的是利用重組酵母菌法和酶聯(lián)免疫法分別對(duì)不同處理工藝的生活污水的雌激素活性和E2水平進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)，并將兩個(gè)檢測(cè)方法進(jìn)行比較，以期為進(jìn)一步保障受納水體的生態(tài)安全提供理論依據(jù).

　　1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

　　雌二醇 (E2) 以及鄰硝基酚β-D-半乳糖苷 (ONPG) 購(gòu)自Sigma公司. SD培養(yǎng)基 (Synthetic dropout medium) 所需的硫酸腺嘌呤購(gòu)于美國(guó)MP公司，葡萄糖購(gòu)于阿拉丁.無(wú)氨基酵母氮堿、DO、SD/-Leu/-His所用的各種氨基酸購(gòu)于Difco公司.二甲基亞砜 (DMSO)、HPLC級(jí)甲醇和乙酸乙酯購(gòu)于天津科密歐公司. ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于德國(guó)DRG (EIA-2693).

　　1.2 樣品采集和前處理

　　2015年8~10月分別對(duì)3個(gè)污水處理廠 (A、B、C) 各流程出水進(jìn)行采集.水樣的采集及標(biāo)號(hào)如下：A-1~A-6依次為以氧化溝工藝為主的A污水處理廠對(duì)應(yīng)處理單元的出水，A-S為氧化溝污泥樣品;B-1~B-6依次為以A2/O工藝為主的B污水處理廠對(duì)應(yīng)處理單元的出水，B-S為好氧污泥樣品;C-1~C-3依次為以A2/O+MBR為主的C污水處理廠主要處理單元的出水，C-S1和C-S2分別為好氧池污泥和MBR膜池污泥樣品.各污水廠處理流程及采樣點(diǎn)如圖 1所示.

圖 1 各污水處理廠主要工藝流程及采樣點(diǎn)

　　每個(gè)采樣點(diǎn)采集2 L水樣或1 L污泥混合液放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的棕色玻璃瓶中，并立即帶回實(shí)驗(yàn)室.水樣經(jīng)玻璃纖維膜 (0.7 μm, Millipore, GF/B) 過(guò)濾后用HLB柱子 (Oasis HLB 200 mg Cartridge, Waters) 富集.具體操作如下：依次用10 mL乙酸乙酯、10 mL甲醇和10 mL超純水活化HLB柱子.取調(diào)節(jié)pH為3的水樣2 000 mL以10 mL ·min-1的流速過(guò)柱，隨后用10 mL超純水-甲醇 (9:1) 洗柱，繼續(xù)真空干燥1 h.最后用10 mL乙酸乙酯以1 mL ·min-1流速洗脫到10 mL的試管中，40℃水浴下用微氮?dú)獯蹈?萃取物用1 mL DMSO進(jìn)行溶解，均分成兩份，一份用DMSO梯度稀釋用于雌激素活性檢測(cè)，另一份用超純水稀釋100倍用于ELISA (E2) 檢測(cè).

　　污泥混合液經(jīng)中速定性濾紙過(guò)濾后，收集濾紙上污泥，真空冷凍干燥2~3d.之后準(zhǔn)確稱取1.0 g污泥并研磨成粉狀.將研磨好的污泥放入10 mL磨口俱塞試管中，進(jìn)行超聲萃取4次，萃取劑分別為5 mL甲醇、5 mL甲醇、2×3 mL丙酮，每次萃取時(shí)間為15 min.每次萃取完，上清液經(jīng)0.45 μm針頭式樣品PTFE過(guò)濾器過(guò)濾后用氮?dú)獯抵?00 μL，加入超純水，并用超純水多次洗滌定容至500 mL.固相萃取步驟同水樣.

　　1.3 重組酵母菌檢測(cè)

　　雌激素活性采用中科院生態(tài)環(huán)境中心建立的酵母雙雜交雌激素活性評(píng)價(jià)方法.每個(gè)樣品按梯度稀釋8個(gè)濃度 (濃縮液稀釋倍數(shù)：1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128).將酵母菌置于SD培養(yǎng)基中，在30℃、130 r ·min-1條件下培養(yǎng)36 h.用SD培養(yǎng)液稀釋菌液至其在600 nm的吸光度值為0.75左右，吸取菌液995 μL于1.5 mL滅菌離心管中，加入5 μL稀釋的樣品并混勻，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行.將200 μL的混合菌液轉(zhuǎn)移到96孔板中，在30℃、800 r ·min-1條件下暴露4 h.測(cè)定菌懸液在600 nm的吸光度值，隨后每孔棄去150 μL，加入120 μL測(cè)試緩沖液和20 μL氯仿，于1 200 r ·min-1振蕩破壁15 min，加入40 μL ONPG，于30℃、800 r ·min-1下培養(yǎng)顯色60 min.顯色結(jié)束后，每孔加入100 μL碳酸鈉溶液，終止反應(yīng).吸取上清液200 μL至新96孔板中，測(cè)定420 nm處吸光度.同時(shí)，以DMSO做陰性對(duì)照，以E2為陽(yáng)性對(duì)照. β-半乳糖苷酶活性 (U) 按公式 (1) 計(jì)算.

　　式中，t為加入ONPG到溶液顯色時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，60 min;V為菌液體積，0.2 mL;A600、A420分別為菌液在600 nm、420 nm處的光密度值;A′420為空白對(duì)照在420 nm處的光密度值;D為稀釋因子6.6.

　　由劑量效應(yīng)曲線得出β-半乳糖苷酶活性后，根據(jù)最小二乘法如公式 (2) 計(jì)算水樣的EC50.

　　式中，y為β-半乳糖苷酶活性;X為水樣濃縮倍數(shù);A為最大β-半乳糖苷酶活性;B為回歸曲線中點(diǎn)的斜率;C為半數(shù)最大β-半乳糖苷酶活性時(shí)水樣的濃縮倍數(shù) (EC50);D為本底β-半乳糖苷酶活性.

　　對(duì)于樣品的雌二醇當(dāng)量用EEQ表示，計(jì)算方法根據(jù)公式 (3).

　　1.4 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè) (ELSIA-E2)

　　取25 μL標(biāo)準(zhǔn)品 (試劑盒中自帶的E2的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為0、25、100、250、500、1 000、2 000 ng ·L-1)、質(zhì)控品 (實(shí)驗(yàn)室自配的E2濃度：200 ng ·L-1) 和濃縮的樣品加入相應(yīng)微孔中.在每一微孔中加入200 μL酶聯(lián)物，充分混勻10 s，室溫孵育120 min.快速棄去孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用400 μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干.每一微孔中加入100 μL底物液，室溫孵育15 min.加50 μL終止液到每個(gè)檢測(cè)孔中終止酶反應(yīng)，在10 min之內(nèi)測(cè)定450 nm的吸光度值.所有的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品設(shè)置3個(gè)平行.按照以上步驟對(duì)E2標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，并以每個(gè)濃度的吸光度的平均值作為此濃度的吸光度B.用公式 (4) 計(jì)算吸光率.以濃度對(duì)數(shù)lgc對(duì)吸光率對(duì)數(shù)lg (B/B0) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖.

　　式中，A450為450 nm處的吸光度;空白為0 ng ·L-1的E2.

　　2 結(jié)果與討論2.1 污水中雌激素活性的分析

　　以DMSO為溶劑配置一系列E2標(biāo)液，按上述方法測(cè)定β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)活性值，得出E2的劑量-活性效應(yīng)關(guān)系如圖 2所示.從中可以得出E2的EC50為6.73×10-11 mol ·L-1，與馬軍等[15]的研究結(jié)果 (5.95×10-11 mol ·L-1) 具有一致性，說(shuō)明了該方法的可行性.

圖 2 E2的雌激素活性劑量-效應(yīng)曲線

　　各污水處理廠主要單元出水的雌激素活性如圖 3所示. A、B和C污水處理廠進(jìn)水均表現(xiàn)出較強(qiáng)的雌激素活性，EEQ分別為7.58、7.29、4.35 ng ·L-1. C污水處理廠進(jìn)水的EEQ低于其它兩個(gè)污水處理廠.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是污水來(lái)源不同，C污水處理廠污水來(lái)源是校園污水，污水成分簡(jiǎn)單，而其余兩個(gè)污水處理廠污水來(lái)源則是城市污水，承接污水比較廣泛，雌激素活性較強(qiáng). Shore等也指出污水來(lái)源影響污水廠進(jìn)水的雌激素活性.經(jīng)氧化溝工藝、A2/O工藝和A2/O+MBR工藝處理之后，出水的EEQ降低為2.19、1.89、1.06 ng ·L-1.孫慶峰等采用ER-CALUX方法將雌激素活性作為飲用水水質(zhì)指標(biāo)時(shí)，得出最大無(wú)劑量效應(yīng)的EEQ為0.4 ng ·L-1.因此，本研究中的3個(gè)污水廠出水仍具有很高的風(fēng)險(xiǎn)性.

圖 3 雌激素當(dāng)量 (EEQ) 和去除率在各工藝中的變化

　　由圖 3(A)和3(B)可知，曝氣沉砂池單元對(duì)雌激素活性的去除能力非常有限，去除率≤11%.這可能是由于曝氣沉砂池主要用于去除污水的無(wú)機(jī)顆粒物、油脂類以及少量的有機(jī)污染物等;另一方面，雌激素物質(zhì)，如E1、E2、E3和EE2，具有較低的亨利常數(shù)，在常溫常壓下很難揮發(fā)，導(dǎo)致曝氣作用對(duì)雌激素活性的去除效果不佳.由圖 3(B)可以看出污水經(jīng)初沉池處理之后，雌激素活性基本沒(méi)有變化.初沉池主要是通過(guò)重力沉降作用去除大顆粒物質(zhì)，而污水的雌激素物質(zhì)主要存在于液相，單純的物理沉降作用無(wú)法顯著降低污水的雌激素活性.

　　對(duì)比3個(gè)污水處理廠的主要工藝發(fā)現(xiàn)，雌激素活性的降低主要依賴污水處理的氧化溝工藝、A2/O工藝和A2/O+MBR工藝.經(jīng)過(guò)這些工藝處理之后，EEQ分別降低71.10%、74.07%和75.54%.另外，3個(gè)污水處理廠出水的氨氮濃度均低于5 mg ·L-1，達(dá)到一級(jí)A排放標(biāo)準(zhǔn)，總磷的濃度低于1 mg ·L-1，達(dá)到一級(jí)B排放標(biāo)準(zhǔn).這說(shuō)明3個(gè)污水廠的生物處理單元具有良好的脫氮除磷效果和較好的菌落結(jié)構(gòu).而固醇類雌激素如E1、E2、E3和EE2主要是通過(guò)氨氧細(xì)菌共代謝作用和異養(yǎng)菌作用得到降解，當(dāng)污水處理過(guò)程中具有良好的硝化作用時(shí)，這些物質(zhì)可得到很好地去除.例如，Khunjar等指出氨氧化菌將EE2降解為某中間產(chǎn)物如羥基EE2，而異養(yǎng)菌可將EE2的中間產(chǎn)物繼續(xù)降解為更簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)甚至碳化.同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到3個(gè)污水處理廠活性污泥的雌激素活性，如圖 4所示.氧化溝污泥、A2/O工藝好氧池污泥、A2/O+MBR工藝的好氧池污泥和MBR膜池污泥的EEQ分別為1.84、1.85、2.16、2.43 ng ·g-1.物質(zhì)的lgkow值決定了其與污泥的吸附能力，當(dāng)化合物的lgkow介于2.5~4.0時(shí)表現(xiàn)出中度的吸附能力;大于4.0時(shí)，表現(xiàn)出高的吸附能力.而水環(huán)境中主要的雌激素物質(zhì)如E1、E2、E3和EE2的lgkow分別為3.43、3.94、2.81和4.15.因此，活性污泥可通過(guò)吸附作用去除部分的雌激素活性.

圖 4 各污水處理廠污泥樣品的雌激素當(dāng)量

　　由圖 3(A)和3(B)可知加氯消毒之后，污水出水的雌激素活性基本沒(méi)有變化.這可能由于消毒過(guò)程產(chǎn)生的消毒副產(chǎn)物具有一定的雌激素活性，導(dǎo)致出水的EEQ比較恒定.一些研究指出E1、E2和EE2的消毒副產(chǎn)物，如2, 4二氯雌酮、2, 4二氯雌二醇以及4-氯乙炔雌二醇，具有和母體相當(dāng)?shù)拇萍に鼗钚?由圖 3(c)看出，經(jīng)MBR處理之后，污水的EEQ降低了22.62%.膜生物反應(yīng)是結(jié)合膜分離和生物處理方法的處理技術(shù)，能夠強(qiáng)化有機(jī)物的去除.

　　2.2 酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) 檢測(cè)E2的濃度

　　以E2濃度對(duì)數(shù)lgc和吸光率對(duì)數(shù)lg (B/B0) 作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：

　　該方程的相關(guān)系數(shù)為0.989.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各污水處理廠主要工藝出水的E2濃度，如圖 5所示.從中可知，A、B和C污水廠進(jìn)水中E2濃度分別為64.83、83.43和36.95 ng ·L-1.以校園污水為來(lái)源的C污水處理廠進(jìn)水的E2濃度低于其余兩個(gè)污水廠，該結(jié)果和雌激素活性具有一致性. B污水處理廠經(jīng)曝氣沉砂池和初沉池處理之后，E2的濃度并沒(méi)有明顯的降低. 3個(gè)污水廠進(jìn)水分別經(jīng)氧化溝工藝、A2/O工藝和A2/O+MBR工藝處理之后，污水廠出水E2的濃度分別為6.47、16.82、4.48 ng ·L-1.

圖 5 各工藝流程出水中E2的濃度

　　生物處理階段對(duì)E2的去除起著主導(dǎo)作用.氧化溝工藝、A2/O工藝和A2/O+MBR對(duì)E2的去除率分別為75.88%、77.84和80.72%. B污水處理廠對(duì)E2的去除效果稍高于A污水廠，這可能是由于E2在厭氧、缺氧和好氧條件下均可以被微生物降解，而A2/O工藝具有延長(zhǎng)生物處理作用的特點(diǎn).另外，良好的硝化過(guò)程有利于雌激素的去除，A2/O工藝的脫氮除磷效果高于氧化溝工藝. C污水廠二級(jí)出水經(jīng)MBR工藝處理后，E2的濃度降低37.16%，這可能是MBR單元具有良好的泥水分離效果，使污泥濃度增大，微生物活性增強(qiáng)，強(qiáng)化了有機(jī)物的去除.由圖 5可知，加氯消毒對(duì)E2的去除效果并不明顯.加氯消毒的效果與消毒劑量有關(guān)，而市政污水存在較多消毒副產(chǎn)物的前驅(qū)物如腐殖質(zhì)、富里酸和腐殖酸等影響加氯消毒對(duì)E2的去除.此外，A、B和C污水處理廠活性污泥中E2含量分別為11.70、12.84、9.8和8.45 ng ·g-1，如圖 6所示.如前所述，E2具有一定的親脂性，容易被污泥吸附.雌激素物質(zhì)被污泥吸附之后，通過(guò)污泥回流進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)脫附和降解，但最終通過(guò)剩余污泥帶走的雌激素總量不超過(guò)進(jìn)水的5%.因此，污泥對(duì)E2的去除效果是微弱的.

圖 6 各污水處理廠污泥樣品中E2的含量

　　2.3 重組酵母菌法和酶聯(lián)免疫法的比較

　　將用ELISA檢測(cè)的E2值與用酵母菌法檢測(cè)的EEQ相比，ELISA檢測(cè)的E2值偏低. Välitalo等研究也發(fā)現(xiàn)ELISA檢測(cè)的水體目標(biāo)物濃度水平 (E2) 比ERα-CALUX®檢測(cè)的EEQ要高.環(huán)境水樣中存在和E2結(jié)構(gòu)非常相似的其他雌激素，如E1、E3和EE2.這些物質(zhì)可以與微孔板上包被的E2抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，從而使ELISA檢測(cè)結(jié)果偏高.另一方面，由于污水成分復(fù)雜，一些抗雌激素物質(zhì)的存在以及物質(zhì)之間存在拮抗作用，可導(dǎo)致檢測(cè)的雌激素活性相應(yīng)較低.因此，兩種檢測(cè)結(jié)果具有一定的差異性.通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)ELISA檢測(cè)的E2值和酵母菌檢測(cè)的EEQ進(jìn)行分析，得出兩者具有很好的一致性，如圖 7，相關(guān)系數(shù)為0.837.這表明兩指標(biāo)在結(jié)果評(píng)價(jià)上整體趨勢(shì)的一致，ELISA檢測(cè)技術(shù)為水環(huán)境雌激素的快速篩選和診斷提供了一個(gè)新方法.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

圖 7 樣品的EEQ與E2的濃度水平的相關(guān)關(guān)系

　　3 結(jié)論

　　(1) 原污水的雌激素活性雌二醇當(dāng)量為4.35~7.58 ng ·L-1，出水中雌二醇當(dāng)量降至1.06~2.19 ng ·L-1，去除率為71.10%~75.54%.雌激素活性的去除主要發(fā)生在生物處理階段，如氧化溝和A2/O處理單元.

　　(2) 原污水的E2濃度為36.95~83.43 ng ·L-1，氧化溝、A2/O和A2/O+MBR處理單元對(duì)E2具有很好的去除效果，去除效能分別為75.88%、77.84和80.72%，MBR工藝能夠強(qiáng)化E2的去除.

　　(3) 污泥中雌二醇當(dāng)量和E2的含量分別為1.84~2.43 ng ·g-1和8.45~12.84 ng ·g-1，污泥可通過(guò)吸附作用去除一定的雌激素活性和E2.

　　(4) 酶聯(lián)免疫法與酵母菌法具有很好的一致性，并為水環(huán)境雌激素的快速篩選和診斷提供了一個(gè)新的方法.