苯酚是造紙、煉焦、紡織和石油化工等工業(yè)廢水中的主要污染物，即使在低濃度下對生物體也有毒害作用，如果不加以處理，會對人類健康和農(nóng)作物的生長造成不良影響〔1〕，中國等許多國家已將其列為重點(diǎn)污染物。在環(huán)境中，利用微生物的活動降解苯酚具有處理成本低、二次污染小等優(yōu)點(diǎn)〔2〕。國內(nèi)外學(xué)者已分離得到一些降解苯酚的菌株，主要有假單胞菌（Pseudonomonas sp.）、酵母菌（Yeast trichosporon）、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌（Alcaligenes eutrophus）等〔3, 4〕。這些菌種的生長都能以苯酚為單一碳源，但不同的微生物菌種和實(shí)驗(yàn)條件會導(dǎo)致微生物降解能力差異較大。
本實(shí)驗(yàn)從焦化廢水處理系統(tǒng)中分離出一株沙雷氏菌株，該菌種能以苯酚為唯一碳源和能源，并且能夠適應(yīng)焦化廢水復(fù)雜的水質(zhì)環(huán)境。對該菌株的生長特性和動力學(xué)特性進(jìn)行了研究，以進(jìn)一步了解焦化廢水中微生物的特性，從而為焦化廢水的生物處理提供一定的理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 菌株
實(shí)驗(yàn)所用菌株分離自首都鋼鐵集團(tuán)焦化廠曝氣池中的活性污泥。
1.1.2 培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL。
唯一碳源培養(yǎng)基：KH2PO4 2.0 g，NH4Cl 1.0 g， CaCl2·2H2O 60.0 mg，MgCl2·6H2O 50.0 mg，F(xiàn)eCl3· 6H2O 2.5 mg，NaNO3 10.0 mg，Na2SO4 10.0 mg，蒸餾水1 000 mL，苯酚（根據(jù)需要加入）。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 菌種的馴化和分離
首先取5 mL 活性污泥，在富集培養(yǎng)基中對其進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 后轉(zhuǎn)移到唯一碳源培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。為使苯酚降解菌成為活性污泥體系中的優(yōu)勢菌種，在唯一碳源培養(yǎng)基中利用苯酚為唯一碳源進(jìn)行梯度馴化，同時(shí)對水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測并觀察微生物生長情況。因?yàn)槭卒摻够瘡U水在進(jìn)入生物處理系統(tǒng)前經(jīng)過預(yù)處理，苯酚質(zhì)量濃度在400 mg/L 左右，因此實(shí)驗(yàn)確定唯一碳源培養(yǎng)基中苯酚的質(zhì)量濃度最終達(dá)到400 mg/L，共馴化288 h。
取經(jīng)過馴化后的菌種培養(yǎng)液倍比稀釋，涂布于富集培養(yǎng)基平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，然后根據(jù)菌落形態(tài)，如菌落大小、邊緣性狀、菌落顏色、隆起程度和表面形狀等的差別，對各菌落反復(fù)劃線分離，得到純菌株。之后將各菌落接種在富集培養(yǎng)基斜面上，于4 ℃冰箱中保藏，備用。
1.2.2 苯酚降解菌的篩選
用接種環(huán)取各接種斜面菌苔上的菌落，分別接種于裝有50 mL 400 mg/L 苯酚及富集培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，調(diào)pH 為7.5，溫度為30 ℃，在轉(zhuǎn)速為120 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)，同時(shí)做不接種對照。分別測定不同培養(yǎng)時(shí)間下各培養(yǎng)瓶內(nèi)苯酚濃度，計(jì)算苯酚降解率。選取苯酚降解率較高的菌株作為優(yōu)勢菌株。
1.2.3 菌種最佳降解條件研究和動力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法
通過研究pH、溫度、菌種量和初始苯酚濃度對菌株生長及降解苯酚的影響，確定菌株最適生長條件。苯酚降解動力學(xué)實(shí)驗(yàn)在菌株最適生長條件下進(jìn)行，唯一碳源培養(yǎng)基中初始苯酚質(zhì)量濃度在0~400 mg/L，通過考察不同培養(yǎng)時(shí)間下菌體生長和苯酚降解情況，對菌株的生長特性和動力學(xué)特性進(jìn)行研究。
1.2.4 分析方法
菌種濃度的測定采用比濁法〔5〕，使用分光光度計(jì)于波長600 nm 處測定其OD 值。苯酚含量采用 4-氨基安替吡啉直接吸光光度法進(jìn)行測定〔6〕。
2 結(jié)果與討論
2.1 菌種的分離及生理生化特性
經(jīng)過分離純化，共得到3 株具有較強(qiáng)降酚能力的菌株。經(jīng)過進(jìn)一步篩選，確定其中一株具有較高的苯酚降解效率。該菌株在富集培養(yǎng)基上生長，菌落表面光滑，呈圓形凸起，質(zhì)地濕潤，邊緣整齊，呈紅色。其生理生化特性如表 1 所示。初步確定該菌種為沙雷氏菌屬〔7〕。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以該菌株為研究對象。
2.2 菌種降解條件研究
2.2.1 pH 對菌株降酚性能的影響
分別選取不同初始pH 的唯一碳源培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件：溫度為30 ℃，菌種量為 5%，初始苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L，培養(yǎng)時(shí)間為 24 h。pH 對菌株降酚性能的影響如圖 1 所示。
圖 1 pH 對菌株降酚性能的影響
由圖 1 可以看出，當(dāng)pH＜8.0 時(shí)，苯酚降解率隨 pH 的升高而增大；當(dāng)pH＞8.0 時(shí)，苯酚降解率隨pH 的升高而降低。這可能是由于pH 過高，抑制了菌種的生長和降酚酶的活性。相對而言，在pH=8.0 的條件下，菌株降解苯酚的效果最好。
2.2.2 溫度對菌株降酚性能的影響
分別在溫度為15、20、25、30、35 ℃的條件下培養(yǎng)菌株，其他培養(yǎng)條件：pH 為8.0，菌種量為5%，初始苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。溫度對菌株降酚性能的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在30~35 ℃ 范圍內(nèi)，菌株降酚性能較好，這說明在此溫度內(nèi)菌株細(xì)胞內(nèi)的酶促反應(yīng)速率較大，降解苯酚的速率較快。在溫度為15 ℃和40 ℃時(shí)，降酚性能較低，這是因?yàn)樵诘蜏叵旅傅幕钚越档�，而高溫下，酶發(fā)生變性，喪失了生物活性。在溫度為30 ℃下，菌株的生長情況和降酚性能最好。
2.2.3 菌種量對菌株降酚性能的影響
本實(shí)驗(yàn)選用菌種量分別為2%、5%、10%，其數(shù)值為菌種菌懸液與培養(yǎng)基的體積比。其他培養(yǎng)條件： pH 為8.0，溫度為30 ℃，初始苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L。菌種量對菌株降酚性能的影響見圖 2。
圖 2 菌種量對菌種濃度和降酚性能的影響
由圖 2 可以看出，隨著菌種量的增加，苯酚降解率也在增加，這也說明了菌種量的增加，可縮短菌株的遲滯期。雖然適當(dāng)增加投菌量，有利于快速去除水體中的苯酚，但過多的增加投菌量并不能有效提高降解速率，反而增加了處理成本。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用的菌種量為5%。
2.2.4 初始苯酚濃度對菌株降酚性能的影響
調(diào)節(jié)初始苯酚質(zhì)量濃度為100、200、300、400、 500 mg/L，其他培養(yǎng)條件：pH 為8.0，溫度為30 ℃，菌種量為5%，培養(yǎng)時(shí)間為12 h。初始苯酚濃度對菌株降酚性能的影響如圖 3 所示。
圖 3 初始苯酚濃度對菌株降酚性能的影響
由圖 3可以看出，隨著苯酚初始濃度的增加，菌株的生長繁殖速率和苯酚的降解速率隨之下降。由此可以看出，苯酚對該菌株有一定的毒性，可抑制菌體的生長和繁殖，影響其對苯酚的降解。
2.3 菌種生長曲線及降解特性
將增值培養(yǎng)所得的菌種菌懸液接種于苯酚質(zhì)量濃度為400 mg/L 的唯一碳源培養(yǎng)基中，在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。測定不同培養(yǎng)時(shí)間下的菌種濃度和苯酚濃度，結(jié)果如圖 4 所示。
圖 4 菌種生長曲線及苯酚降解曲線
由圖 4 可知，菌株經(jīng)過32 h 停滯期后進(jìn)入對數(shù)增長期，60 h 以后處于穩(wěn)定期。在52 h 內(nèi)，該菌株能將400 mg/L 的苯酚完全降解。由苯酚降解曲線還可以看出，苯酚的降解主要發(fā)生在菌種的對數(shù)增長期，這主要是因?yàn)榫暝趯?shù)增長期時(shí)增值能力較強(qiáng)，對碳源的需求量大。培養(yǎng)120 h 后，碳源相對減少，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少，菌體開始部分死亡，此階段為菌株生長的衰亡期。菌種濃度下降的原因有3 個(gè)： 一是部分菌體因?yàn)檎辰Y(jié)形成菌膠團(tuán)而沉積在培養(yǎng)瓶底部； 二是菌種受到大量代謝廢物的毒害而發(fā)生自溶現(xiàn)象，造成培養(yǎng)液中的菌體密度下降；三是培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)減少，導(dǎo)致菌種的生長速率逐漸下降甚至為0，死亡數(shù)漸增，菌種進(jìn)入衰亡期。
2.4 菌種降解動力學(xué)研究
2.4.1 低濃度苯酚菌株生長動力學(xué)
對單底物生物降解，一般采用Monod 動力學(xué)模型描述菌種細(xì)胞的比增長速率。Monod 方程描述的是微生物生長和限制生長的基質(zhì)濃度之間的關(guān)系，適用于第一基質(zhì)不進(jìn)行自我抑制情況。方程表示為：
實(shí)驗(yàn)所測定的菌株生長Monod 方程擬合曲線如圖 5 所示。
圖 5 低濃度下菌株生長動力學(xué)曲線
由圖 5 可知，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測吻合良好。當(dāng)苯酚初始質(zhì)量濃度＜50 mg/L 時(shí)，菌種的比增長速率隨著苯酚濃度的增加而增大，當(dāng)苯酚初始質(zhì)量濃度＞50 mg/L 時(shí)，菌種的比增長速率有所下降，此時(shí)，苯酚對菌種的生長產(chǎn)生了抑制作用。
擬合所得Monod 方程動力學(xué)參數(shù)：μmax=0.438 h-1， KS=27.206 mg/L。所得Monod 方程為μ= 0.438 S/(27.206+S) 。
2.4.2 高濃度苯酚菌株生長動力學(xué)
對于存在有毒底物的污水，毒物濃度達(dá)到一定值后微生物的活動將會受到抑制。目前，相關(guān)學(xué)者已經(jīng)提出了幾個(gè)數(shù)學(xué)模型用來定量描述有毒底物的抑制效果，其中大多數(shù)是由酶反應(yīng)動力學(xué)演變而來， Haldane 方程是其中最常用的底物抑制細(xì)胞生長動力學(xué)模型之一。方程表示為：
實(shí)驗(yàn)所測定的菌株生長Haldane 方程擬合曲線如圖 6 所示。
圖 6 高濃度下菌株生長動力學(xué)曲線
從圖 6 可以看出，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測吻合良好。當(dāng)苯酚初始質(zhì)量濃度＞50 mg/L 時(shí)，隨著苯酚濃度的增加，菌種的比增長速率逐漸下降，這是因?yàn)楫?dāng)苯酚濃度較高時(shí)，底物抑制作用成為主導(dǎo)作用，菌株的生長速率受到抑制。
擬合所得Haldane 方程動力學(xué)參數(shù)： μmax = 0.398 h-1，KS=9.70 mg/L，Ki=263.96 mg/L。所得Haldane 方程為μ= 0.398S/(9.7+S+ S2/263.96)。具體參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3 結(jié)論
（1）從焦化廢水處理系統(tǒng)中分離出一株高效苯酚降解菌，經(jīng)過生理生化鑒定初步確定為沙雷氏菌屬，該菌株可利用苯酚為唯一碳源和能源。
（2）該菌株的最佳降解條件：pH 為8.0，溫度為 30 ℃，菌種量為5%；菌種的降解性能受初始苯酚濃度的影響，并隨著苯酚濃度的升高而降低。
（3）研究發(fā)現(xiàn)，高濃度苯酚會對菌種的生長產(chǎn)生抑制作用。低濃度苯酚條件下菌種生長動力學(xué)方程符合Monod 方程； 高濃度苯酚條件下菌種生長動力學(xué)方程符合Haldane 方程。
