1 引言(Introduction)

　　水環(huán)境中的重金屬污染已經(jīng)成為一個日益突出的環(huán)境問題, 尤其是工業(yè)廢水和城市污水等造成的重金屬污染具有長期性和不可逆的特點.微生物對重金屬具有良好的吸附和轉(zhuǎn)化作用, 可以將其從廢水中去除, 達(dá)到治理污染、回收重金屬和處理后水體回用的目的.近30年來, 國內(nèi)外的科研工作者對重金屬廢水的微生物吸附處理技術(shù)開展了較廣泛的研究, 已發(fā)現(xiàn)的用于重金屬離子吸附的微生物數(shù)量眾多, 主要由細(xì)菌、真菌和藻類組成.研究表明, 吸附劑的性能主要由生物量的特性、目標(biāo)重金屬的物理化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)發(fā)生的小環(huán)境等因素決定.研究微生物吸附劑對重金屬的吸附特性, 對于凈化重金屬污染環(huán)境具有重要的理論和實際意義.

　　現(xiàn)有研究多集中于單一重金屬離子的生物吸附作用, 而對多組分重金屬離子的同時吸附過程研究不多.由于重金屬離子的復(fù)雜性, 多種金屬共存時的聯(lián)合作用會改變其被吸附性, 研究表明, 共存重金屬對于微生物吸附目標(biāo)離子存在促進(jìn)作用、抑制作用或蒸餾效應(yīng)等.鑒于此, 本研究采用課題組前期工作中分離得到的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)為實驗菌株, 考察其對水體中Cu2+和Pb2+的去除效果及其影響因素, 分析2種重金屬共存條件下菌體對目標(biāo)重金屬的吸附能力變化, 研究微生物對復(fù)合重金屬的吸附效應(yīng), 以期為重金屬場地的微生物修復(fù)提供理論依據(jù).

　　2 材料與方法(Materials and methods) 2.1 實驗試劑與材料 2.1.1 實驗試劑

　　牛肉膏、蛋白胨、NaCl、Cu(NO3)2、Pb(NO3)2等購自上�；瘜W(xué)試劑廠, 均為AR級.1000 mg·L-1Cu2+和Pb2+母液分別由Cu(NO3)2和Pb(NO3)2溶于高純水得到.

　　2.1.2 菌株與培養(yǎng)基

　　菌株：由本課題組從受污染嚴(yán)重的蘇州市原江蘇化工農(nóng)藥集團(tuán)地塊土壤中篩選得到, 經(jīng)16S rDNA序列比對, 鑒定為銅綠假單胞菌(P. aeruginosa).營養(yǎng)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g, 蛋白胨10 g, NaCl 5 g, 蒸餾水1000 mL, pH值為7.2~7.4;培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌30 min.

　　2.2 實驗方法 2.2.1 菌株培養(yǎng)

　　接種P. aeruginosa于培養(yǎng)液中, 于(30±1) ℃、150 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)24 h.取菌液按1%體積比接種于新鮮培養(yǎng)液中, 在上述條件下培養(yǎng)24 h, 6000 r·min-1離心10 min獲取菌體, 用0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH=7.3) 清洗菌體3次, 備用.

　　2.2.2 不同因素對P. aeruginosa吸附Cu2+和Pb2+的影響

　　吸附時間的影響：于pH=7.0的純水體系中加入一定量的P. aeruginosa菌懸液, 投菌量為1 g·L-1;再向體系中加入一定量的Cu(NO3)2和Pd(NO3)2溶液, 使體系中重金屬離子濃度分別為1 mg·L-1 Cu2+、1 mg·L-1Pb2+和1 mg·L-1Cu2++1 mg·L-1 Pb2+, (30±1) ℃下置于150 r·min-1恒溫?fù)u床中處理0、0.5、1、2、4、8、12 h后取樣;樣品轉(zhuǎn)入離心管, 于6000 r·min-1離心10 min, 取上清液測定重金屬濃度.

　　投菌量的影響：于pH=7.0的純水體系中加入一定量的P. aeruginosa菌懸液, 投菌量分別為0.1、0.25、0.5、1、2 g·L-1;再向體系中加入一定量的Cu(NO3)2和Pd(NO3)2溶液, 使體系中重金屬離子濃度分別為1 mg·L-1Cu2+、1 mg·L-1Pb2+和1 mg·L-1Cu2++1 mg·L-1Pb2+, (30±1) ℃下置于150 r·min-1恒溫?fù)u床中處理2 h后取樣, 測定2種重金屬的濃度.

　　pH的影響：分別于pH=3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的純水體系中加入一定量的P. aeruginosa菌懸液, 投菌量為1 g·L-1;再向體系中加入一定量的Cu(NO3)2和Pd(NO3)2溶液, 使體系中重金屬離子濃度分別為1 mg·L-1Cu2+、1 mg·L-1Pb2+和1 mg·L-1Cu2++1 mg·L-1Pb2+, (30±1) ℃下置于150 r·min-1恒溫?fù)u床中處理2 h后取樣, 測定2種重金屬的濃度.

　　2.2.3 重金屬共存下P. aeruginosa吸附性能

　　Pb2+共存下活菌對Cu2+的吸附：向含1 mg·L-1 Cu2+、pH=7.0的純水體系中加入一定量的P. aeruginosa菌懸液, 投菌量為1 g·L-1;再向體系中加入一定量的Pb(NO3)2溶液, 使體系中Pb2+濃度分別為1、2、5、8、10 mg·L-1, 于(30±1) ℃置于150 r·min-1恒溫?fù)u床中處理2 h后取樣, 測定Cu2+的濃度.

　　Pb2+共存下戊二醛固定后菌體對Cu2+的吸附：取菌體配制成菌液, 用最終濃度為2.5%的戊二醛固定24 h后, 用雙蒸水清洗至pH中性.吸附實驗同同上.

　　Cu2+共存下菌體對Pb2+的吸附：體系中Pb2+濃度為1 mg·L-1, Cu2+濃度分別為1、2、5、8、10 mg·L-1, 吸附實驗同上, 測定Pb2+的濃度.

　　Cu2+共存下戊二醛固定后菌體對Pb2+的吸附：體系中Pb2+濃度為1 mg·L-1, Cu2+濃度分別為1、2、5、8、10 mg·L-1, 吸附實驗同上.

　　2.2.4 重金屬濃度測定

　　重金屬濃度利用火焰原子吸收分析儀進(jìn)行測定.

　　2.2.5 吸附率和吸附量的計算

　　吸附率R和吸附量q的計算公式如下：

　　式中, c0和ce分別為吸附前后溶液中重金屬的濃度(mg·L-1), m為吸附劑用量(g), V為溶液總體積(L).

　　2.2.6 掃描電鏡(SEM)實驗

　　分別將空白菌體和吸附1 mg·L-1Cu2++1 mg·L-1Pb2+菌體進(jìn)行脫水、冷凍干燥和噴金等前處理, 利用FEG 520型掃描電鏡觀察菌體形態(tài).

　　2.3 數(shù)據(jù)分析

　　用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析, 結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示.

　　3 結(jié)果與討論(Results and discussion) 3.1 處理時間對P. aeruginosa吸附Cu2+和Pb2+的影響

　　大多數(shù)有關(guān)重金屬生物吸附的研究表明, 生物材料對重金屬離子的吸附分為2個階段：第一個階段是一種快速的表面吸附, 通常在幾十分鐘內(nèi)即達(dá)到最終吸附量的70%左右;第二個階段為緩慢吸附階段, 是重金屬離子向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移, 受胞內(nèi)代謝、細(xì)胞擴散過程的控制(Soleymani et al., 2015), 這一階段常常需要數(shù)小時甚至更長的時間才能達(dá)到飽和吸附量.圖 1結(jié)果表明, P. aeruginosa對Cu2+和Pb2+均有較好的吸附效果, 吸附率隨處理時間的變化有相似趨勢.菌體與重金屬接觸的前2 h, 吸附率隨時間的增加而上升, 2 h時已完成大部分重金屬的吸附.在隨后的10 h(第2~12 h), P. aeruginosa對2種重金屬的吸附效果變化不大.從圖 1還可以看出, P. aeruginosa對1 mg·L-1Pb2+的吸附效果要優(yōu)于其對相同濃度Cu2+的吸附, 2 h時二者的吸附率相差約26%.同一菌株對不同重金屬的吸附有較大差異, 竇敏娜等(2007)對菌HQ-1吸附Cd與Ag進(jìn)行了比較研究, 結(jié)果表明, 該菌株對Ag的吸附能力要優(yōu)于Cd, 且對Cd的吸附行為符合Langmuir模型, 對Ag的吸附行為符合Freundlich模型.

　　圖 1 處理時間對P. aeruginosa吸附Cu2+、Pb2+的影響

　　從圖 1還可以看出, 共存重金屬條件下, P. aeruginosa對目標(biāo)重金屬吸附效果隨時間變化的趨勢與單一污染物的相似.分別對單一和復(fù)合吸附Cu2+、Pb2+進(jìn)行差異性分析, 結(jié)果表明, 共存重金屬對目標(biāo)重金屬的吸附效果影響不顯著(p>0.05).因此, 隨著吸附時間的變化, 菌株對Cu2+、Pb2+的吸附能力在1 mg·L-1重金屬共存時是基本不變的.

　　3.2 投菌量對P. aeruginosa吸附Cu2+和Pb2+的影響

　　投菌量是影響重金屬生物吸附的重要因素之一.圖 2顯示, P. aeruginosa對2種重金屬的吸附率隨著投菌量的增加呈現(xiàn)先迅速增加, 然后趨于平穩(wěn)的趨勢, 即吸附量不再隨著投菌量的增大有顯著增大.這一現(xiàn)象可能與兩方面的原因有關(guān)：① 投菌量過高時, 菌體向細(xì)胞外分泌的物質(zhì)會改變吸附體系的pH值, 從而改變菌體表面的物化性質(zhì)或影響金屬離子在水中的存在形態(tài), 并進(jìn)一步削弱菌體對金屬離子的吸附效果;菌體向細(xì)胞外分泌的陽離子也可能會與目標(biāo)吸附質(zhì)發(fā)生吸附競爭;② 微生物對過量的重金屬具有生物解毒的能力, 當(dāng)部分重金屬被積累到體內(nèi)后, 菌體會產(chǎn)生多種適應(yīng)機制, 如把積累進(jìn)體內(nèi)的重金屬運輸出體外;或者改變細(xì)胞膜的物質(zhì)運輸通道, 使細(xì)胞外的重金屬更難運輸進(jìn)體內(nèi);而且這些機制需要在合適的吸附質(zhì)與吸附劑比例下才能成功激活和運行(Zhou et al., 2014;Ye et al., 2010).然而, 2種重金屬吸附效果達(dá)到穩(wěn)定時的投菌量不同, 對于1 mg·L-1Cu2+, 投菌量為1 g·L-1時吸附效果較為理想, 而吸附1 mg·L-1Pb2+達(dá)到平穩(wěn)時的投菌量為0.5 g·L-1.不少研究有類似結(jié)果, 陳永華等(2015)從鉛鋅礦渣盆栽根際土樣中分離篩選出3株耐鉛鋅菌株, 利用其對Pb2+和Zn2+進(jìn)行吸附實驗, 結(jié)果表明, 蠟樣芽孢桿菌對于50 mg·L-1Pb2+吸附的最佳投菌量為0.02 g(以干重計), 而對于同樣濃度Zn2+吸附的最佳投菌量為0.06 g, 解硫胺素芽孢桿菌和藤黃微球菌對于2種重金屬吸附的最佳投菌量同樣有較大差異.

　　圖 2 投菌量對P. aeruginosa吸附Cu2+(a)和Pb2+(b)的影響

　　圖 2結(jié)果表明, 當(dāng)體系中只含有單一重金屬時, 單位質(zhì)量菌體對Cu2+、Pb2+的吸附量隨投菌量的增加呈下降趨勢.其主要原因是隨著投菌量的增加, 吸附質(zhì)與吸附劑的比例減小, 從而導(dǎo)致單位質(zhì)量菌體可以吸附的重金屬量減少.從圖 2還可以看出, 共存重金屬對菌體吸附目標(biāo)離子有影響.對于吸附率, 其變化趨勢與單一重金屬體系隨投菌量的變化趨勢相似, 僅吸附效果略有降低;對于單位吸附量, 投菌量較低時(≤0.25 g·L-1), Pb2+對菌體吸附Cu2+的影響要大于Cu2+對菌體吸附Pb2+的影響.當(dāng)投菌量為0.1 g·L-1時, Pb2+共存下, 單位質(zhì)量菌體吸附1 mg·L-1 Cu2+的量下降約61.9%, 而Cu2+共存下, Pb2+單位吸附量下降26.2%.這一結(jié)果表明, P. aeruginosa對Pb的吸附能力強于Cu, 當(dāng)吸附劑的數(shù)量不足時, 菌株優(yōu)先以Pb為吸附目標(biāo).方差分析結(jié)果表明, 投菌量對2種重金屬的吸附影響極顯著(p < 0.01).共存重金屬離子對菌株吸附率無顯著性影響(p>0.05), 但對單位質(zhì)量菌體的吸附量有較顯著的影響(p < 0.05).

　　3.3 pH對P. aeruginosa吸附Cu2+和Pb2+的影響

　　初始pH對P. aeruginosa吸附重金屬的影響見圖 3.pH為3時, 菌體對Cu2+和Pb2+的吸附效果較差, 吸附率僅分別為7.4%和10.3%, 而當(dāng)pH為5~8時, 2種重金屬的吸附效果較理想且變化較平穩(wěn).這是由于在含有重金屬的吸附液中, 首先與重金屬接觸的是細(xì)菌細(xì)胞壁, 在細(xì)胞壁上有許多帶負(fù)電荷的官能團(tuán), 其中, 羧基和氨基是活性位點, 當(dāng)pH過低時, 菌體表面的質(zhì)子化會抑制重金屬離子的吸附, 即H3O+會占據(jù)大量的吸附活性位點, 阻止陽離子與吸附活性位點的接觸, 因此, 質(zhì)子化程度越高, 吸附劑對重金屬離子的斥力越大, 從而導(dǎo)致吸附量下降;而且, 過酸的環(huán)境對菌體正常生理功能會產(chǎn)生影響, 削弱菌體對銅的生物積累能力.隨著pH值升高, 細(xì)胞表面官能團(tuán)開始脫質(zhì)子化, 官能團(tuán)的負(fù)電荷逐漸暴露出來, 因此, 鎘與活性位點結(jié)合量增加(Vale et al., 2016);當(dāng)pH值過高, 達(dá)到重金屬離子的Ksp值后, 很多金屬離子會生成氫氧化物沉淀, 無法體現(xiàn)生物吸附作用對金屬的去除效果(賈成光等, 2014).方差分析結(jié)果表明, pH對菌體吸附2種重金屬均有有較為顯著的影響(p < 0.05).但隨著pH值的變化, P. aeruginosa對Cu2+和Pb2+的吸附能力在兩者共存時的變化不顯著(p>0.05).

　　圖 3 pH對P. aeruginosa吸附Cu2+、Pb2+的影響

　　3.4 不同濃度重金屬共存下P. aeruginosa吸附性能

　　通過改變共存重金屬的濃度考察P. aeruginosa對目標(biāo)重金屬的吸附效果變化規(guī)律, 結(jié)果如圖 4所示.從圖 4a可以看出, Pb2+的加入對菌體吸附Cu2+有抑制作用, 且抑制效果隨著Pb2+濃度的增加而增大, 主要原因是Pb2+的加入占據(jù)了菌體吸附位點, 從而影響其對目標(biāo)離子的吸附.圖 4b表明, Cu2+的加入對菌體吸附Pb2+的影響無明顯規(guī)律, 僅當(dāng)Cu2+濃度為5和10 mg·L-1時其吸附率有較顯著的變化(p < 0.05).造成上述結(jié)果的可能原因是P. aeruginosa對于2種重金屬的吸附機理不同.菌體對Pb2+的吸附不但與其表面性質(zhì)有關(guān), 可能還與菌體理化性質(zhì)等有關(guān), Cu2+的加入雖然占據(jù)了吸附位點, 但同樣會改變菌體分泌物與細(xì)胞結(jié)構(gòu), 從而影響其對目標(biāo)離子的吸附.周維芝等(2009)研究了深海適冷菌胞外多糖(EPS)對Pb2+和Cu2+的吸附性能, 結(jié)果表明, EPS對Pb2+和Cu2+的吸附量隨EPS投加量的增加而減小.為了驗證這一猜測, 考察了Pb2+和Cu2+對P. aeruginosa EPS產(chǎn)量的影響, EPS的提取與檢測方法參照文獻(xiàn)(Wang et al., 2012).實驗結(jié)果(具體數(shù)據(jù)未列出)表明, 較高濃度(10 mg·L-1)的Pb2+和Cu2+均會抑制菌體EPS的分泌(Cu和Pb對EPS的抑制率分別為43.7%、11.4%).

　　圖 4 共存重金屬對P. aeruginosa吸附Cu2+(a)和Pb2+(b)的影響 (*表示與對照相比p < 0.05, **表示與對照相比p < 0.01)

　　為進(jìn)一步說明上述結(jié)論, 研究了不同濃度重金屬共存下失活菌體的吸附性能.本實驗利用戊二醛作為失活劑固定菌體, 可以將細(xì)胞活性狀態(tài)時的結(jié)構(gòu)和菌體表面的功能基團(tuán)完整地保留, 并終止菌體正常的生理生化功能, 從而考察菌體表面吸附與內(nèi)部擴散作用對重金屬生物吸附貢獻(xiàn)大小.從圖 4a可以看出, 當(dāng)體系中無Pb2+存在時, 失活菌對Cu2+吸附率較活菌有較顯著的提高(p < 0.05), 這一結(jié)果與白潔瓊等(2013)的研究結(jié)果一致, 說明P. aeruginosa對Cu2+的吸附作用不僅包括菌體表面吸附, 還包括跨膜的主動運輸、菌體表面脫附和菌體對金屬的主動釋放等作用.失活后的菌體對Cu2+的吸附僅為表面吸附, 不存在主動釋放與運輸Cu2+的過程, 因此, 吸附率較活菌有提高.圖 4b表明, 當(dāng)體系中無Cu2+存在時, 失活菌對Pb2+吸附率較活菌有顯著的降低(p < 0.01).原因是Pb2+的生物吸附存在表面吸附和胞內(nèi)積累行為, 失活后, 菌體不具備對Pb2+進(jìn)行胞內(nèi)積累的能力, 從而導(dǎo)致了吸附率的下降.Zhu等(2016)研究了失活前后Mucoromycotesp. XLC對Cd2+和Ni2+吸附能力的差異, 結(jié)果表明, 造成活菌與失活菌吸附差異的主要原因是其胞內(nèi)金屬離子的含量變化.

　　綜合圖 4可知, 對于活菌, 外源重金屬的濃度對P. aeruginosa吸附Pb2+和Cu2+的影響有較大差異;而對于失活菌, P. aeruginosa吸附Pb2+和Cu2+的效果均隨外源重金屬濃度的增大而降低, 且Cu2+對Pb2+的影響要比Pb2+對Cu2+的影響更為顯著.這一現(xiàn)象同樣說明P. aeruginosa對于2種重金屬的吸附機理不同, 菌體對Pb2+的吸附作用與菌體活性密切相關(guān).研究表明, 生物吸附機理可分為代謝依賴型和非代謝依賴型(Wang et al., 2009), P. aeruginosa對于Pb2+的吸附屬于前者, 而對于Cu2+的吸附屬于后者.

　　3.5 P. aeruginosa吸附重金屬前后形態(tài)變化

　　圖 5為P. aeruginosa吸附重金屬離子前后的SEM圖.總體上看, 吸附前后大部分菌體均能保持正常形態(tài), 未出現(xiàn)細(xì)胞干癟或破裂的情況.通過比較可以發(fā)現(xiàn), 吸附后的菌體聚集性更好, 而吸附前的細(xì)胞較為分散.原因可能是重金屬離子的存在使細(xì)胞分泌物增加, 從而增強了細(xì)胞之間的凝聚性和粘附性.相關(guān)研究指出(Yin et al., 2008), 重金屬能與菌體分泌到細(xì)胞外的生物大分子發(fā)生螯合后形成復(fù)合物.由于這些生物大分子的主要成分是多糖和蛋白質(zhì), 具有很好的粘性, 可以促進(jìn)重金屬吸附于菌體細(xì)胞表面, 是金屬離子與微生物吸附劑間的橋梁.此外, 這些分泌物與重金屬發(fā)生螯合后, 可以有效降低重金屬的毒性, 從而使吸附后的菌體仍保持飽滿的細(xì)胞結(jié)構(gòu).

　　圖 5 菌體掃描電鏡圖 (a.吸附前, b.吸附Cu2+和Pb2+后)

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　1)P. aeruginosa對Cu2+和Pb2+的吸附效果隨處理時間呈先上升后平穩(wěn)的變化趨勢, 2 h后吸附效果達(dá)到穩(wěn)定.吸附率隨投菌量的增加先迅速增加, 后趨于平穩(wěn).對于Cu2+, 投菌量為1 g·L-1時吸附效果達(dá)到穩(wěn)定, 而Pb2+吸附率達(dá)到平穩(wěn)時的投菌量為0.5 g·L-1.單位質(zhì)量菌體對Cu2+、Pb2+的吸附量隨投菌量的增加呈下降趨勢.pH為3時, 菌體對Cu2+和Pb2+的吸附效果較差, 而當(dāng)pH為5~8時, 2種重金屬的吸附效果較理想.隨著處理時間、投菌量、pH值的變化, 共存重金屬離子對菌株吸附率均無顯著性影響, 僅對單位質(zhì)量菌體的吸附量有較顯著的影響.具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　2) 對于活菌, Pb2+的加入對菌體吸附Cu2+有抑制作用, 且抑制效果隨著Pb2+濃度的增加而增大;而Cu2+的加入對菌體吸附Pb2+的影響無明顯規(guī)律.對于失活菌, P. aeruginosa吸附Pb2+和Cu2+的效果均隨外源重金屬濃度的增大而降低, Cu2+對Pb2+的影響要比Pb2+對Cu2+的影響更為顯著.

　　3) SEM實驗觀察發(fā)現(xiàn), 菌體吸附前后均能保持正常形態(tài), 未出現(xiàn)細(xì)胞干癟或破裂的情況, 吸附后的菌體較吸附前聚集性更好.