1 引言(Introduction)

　　含酚廢水主要來源于煉油、焦化、煤氣和以苯酚或酚醛為原料的化工、造紙、冶煉、紡織印染等行業(yè)的生產(chǎn)過程中.此類廢水來源廣、水量大、組分復(fù)雜、毒性大，是我國水污染控制中被列為重點(diǎn)解決的有毒有害廢水之一.在水體中，5 mg·L-1以上的苯酚即可對魚類的生存構(gòu)成威脅(.苯酚被美國環(huán)保署列入優(yōu)先控制污染物和65種有毒污染物名單，也是我國優(yōu)先控制污染物之一.我國污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)(GB8978-1996)規(guī)定，揮發(fā)酚的一級標(biāo)準(zhǔn)、二級標(biāo)準(zhǔn)和三級標(biāo)準(zhǔn)分別為0.5、0.5、2.0 mg·L-1.

　　隨著我國工業(yè)化程度的提高，各種含酚廢水也相應(yīng)增多，隨之而來的酚類污染已經(jīng)威脅著人類和動(dòng)物，因此，必須尋找有效的方法治理含酚廢水.國內(nèi)外關(guān)于含酚廢水處理的研究很多，其中，物理、化學(xué)法具有操作簡易、見效快的特點(diǎn)，但也存在能耗大、成本高且容易引起二次污染等不足;而生物強(qiáng)化法則利用微生物的新陳代謝作用將廢水中的酚類物質(zhì)代謝成二氧化碳、氨、二氧化硫等穩(wěn)定的小分子，利用微生物體內(nèi)的酶來分解酚以合成自身的有機(jī)質(zhì)，使污水得到凈化.這種方法不僅危害少，而且成本低廉，因此，在苯酚污染的治理中起到了越來越重要的作用(Chung et al.，2003).但目前生物處理技術(shù)只限于處理低濃度的含酚廢水，而高濃度含酚廢水具有污染物濃度高、可生化性差等特點(diǎn)，制約了這一技術(shù)在實(shí)際中的應(yīng)用.

　　近年來，許多學(xué)者從酚類污染嚴(yán)重的環(huán)境中分離到許多降解苯酚的微生物菌種，主要包括Pseudmonas sp、Bacillus sp、Candida tropicalis、Brucella sp,Bacillus cereus、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes sp.)、微球菌屬(Micrococcus sp.)(凌琪等，2007)、紅球菌(Rhodococcus sp.)、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)、根瘤菌(Rhizobium sp.)(Wei et al.，2008)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)等.這些菌種都能以苯酚為單一碳源進(jìn)行生長，但由于不同的微生物菌種和不同的實(shí)驗(yàn)條件導(dǎo)致生物降解能力差異較大.Lee等(2001)曾篩選到一株降解苯酚的酵母菌(Yarrowia LipoLytica Y103)，可以降解47 mg·L-1的苯酚;)研究發(fā)現(xiàn)，R.MetaLLidurans CH34菌株降解4 mmoL·L-1(相當(dāng)于378 mg·L-1)的苯酚需要48 h;熱帶假絲酵母8953菌株在48 h內(nèi)可完全降解約14.88 mmoL·L-1的苯酚;Neis-seria Gonorrhoea BF-1菌株能在24 h內(nèi)降解99.60%的5 mmoL·L-1的苯酚(劉亮等，2010).總之，雖然目前報(bào)道的去除苯酚的微生物種類較多，但這些菌株還存在耐酚濃度較低，降解酚需時(shí)較長，菌體生長及降解酚適應(yīng)條件窄等不足，因此，有必要進(jìn)一步開展苯酚降解微生物資源的發(fā)掘工作.

　　基于此，本研究從湖州污水處理廠的活性污泥中分離篩選到一株高效苯酚降解菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和分子鑒定等方法確定其種屬信息，鑒定為(Rhodococcus sp.)CM-HZX1;同時(shí)，研究pH、溫度、轉(zhuǎn)速、苯酚含量及鹽度等對菌株CM-HZX1降解苯酚的影響，以期為含酚廢水的處理提供一定的理論技術(shù)支持.

　　2 材料與方法(Material and methods) 2.1 菌株來源與試驗(yàn)儀器

　　本實(shí)驗(yàn)分離得到的菌株CM-HZX1來自湖州污水處理廠的活性污泥中.實(shí)驗(yàn)儀器相關(guān)信息見表 1.

　　表 1 實(shí)驗(yàn)儀器

　　2.3 培養(yǎng)基 2.3.1 LB培養(yǎng)基

　　胰蛋白胨 10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，以無酚蒸餾水配制，調(diào)節(jié)pH值為7.0，121 ℃高溫蒸汽滅菌20 min.LB瓊脂平板培養(yǎng)基中需加入10~20 g·L-1的瓊脂.

　　2.3.2 無機(jī)鹽培養(yǎng)基

　　(NH4)2SO4 1 g·L-1，CaCl2 0.1 g·L-1，K2HPO4 0.5 g·L-1，KH2PO4 0.5 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，NaCl 1.0 g·L-1，無酚水定容，調(diào)節(jié)pH為7.0~7.2，121 ℃高溫蒸汽滅菌20 min.平板培養(yǎng)基中需加入10~20 g·L-1的瓊脂.

　　2.3.3 苯酚無機(jī)鹽培養(yǎng)基

　　一定量的苯酚加入上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，pH調(diào)節(jié)至7.0~7.2，121℃高溫蒸汽滅菌20 min.平板培養(yǎng)基中需加入10~20 g·L-1的瓊脂.

　　2.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

　　細(xì)菌生長量的測定：以600 nm處的光吸收值(OD值)代表該菌體的生長狀況.苯酚值的測定：根據(jù)《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》的4-氨基安替比林直接光度法測定揮發(fā)酚(以苯酚計(jì)).苯酚降解率：η=(1-Ct/C0)×100%，其中，η為苯酚降解率，Ct為反應(yīng)后的苯酚濃度，C0為初始的苯酚濃度.

　　2.5 方法 2.5.1 分離與篩選

　　取適量從湖州污水處理廠取回的活性污泥樣品(約5 g)加到苯酚濃度為100 mg·L-1的LB培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r·min-1的搖床上振蕩培養(yǎng);待溶液由澄清變渾濁后，取上清液10 mL轉(zhuǎn)接到苯酚濃度為200 mg·L-1的LB培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r·min-1的搖床上振蕩培養(yǎng);如此轉(zhuǎn)接直至苯酚濃度提高至500 mg·L-1.然后取10 mL菌液到100 mL苯酚濃度為500 mg·L-1的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)液由澄清變渾濁后，收集保存.

　　取上述馴化培養(yǎng)的菌液1mL，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度的稀釋液，然后取100~200 μL稀釋液平板涂布在苯酚無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，30 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)1周，觀察平板上菌落的生長情況.挑選其中清晰可見的單菌落多次分離純化，得到4株純菌株.

　　挑取4株單菌接種至50 mL一定濃度苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)7~10 d，檢測培養(yǎng)基中苯酚的含量，從而判斷菌株降解苯酚的能力，篩選出一株以苯酚為唯一碳源生長且具有高效降解能力的菌株，命名為CM-HZX1.

　　2.5.2 菌株的鑒定

　　形態(tài)學(xué)觀察：主要針對菌落形態(tài)，包括菌株長在平板上的形態(tài)、光澤、大小等;細(xì)胞形態(tài)觀察主要是對菌株進(jìn)行電鏡掃描.生理生化特征實(shí)驗(yàn)：按照北京陸橋公司購入的試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

　　分子鑒定：包括16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，用英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成的酶提取CM-HZX1菌株的DNA，擴(kuò)增該菌株的16S rDNA，將獲得的PCR產(chǎn)物純化后委托上海立菲生物技術(shù)有限公司測序.引物為27F：5′to 3′：-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-，1492R：5′to 3′：-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-(英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成).測序結(jié)果提交NCBI GenBank(National Center of Biotechnology Information)，用BLAST進(jìn)行相似性檢索和同源性比較.利用MEGA5.0軟件對這些細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行同源性分析.

　　2.5.3 苯酚降解菌生長曲線的研究

　　在500 mL錐形瓶中配制300 mL約500 mg·L-1的苯酚培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接量約為15%，離心取菌泥加至苯酚培養(yǎng)基，pH=7.0，溫度設(shè)定為30 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r·min-1，隔一定時(shí)間段取樣檢測揮發(fā)酚值，以不加菌株的培養(yǎng)基作為對照.以時(shí)間為橫坐標(biāo)，苯酚降解率為縱坐標(biāo)，繪制圖形.

　　2.5.4 苯酚降解菌最適條件的研究

　　初始pH對降解苯酚的影響：在500 mL錐形瓶中配制300 mL約500 mg·L-1的苯酚培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接量約為15%，離心取菌泥加至苯酚培養(yǎng)基，pH控制為3、4、5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11，在30 ℃、150 r·min-1條件下，隔一定時(shí)間段取樣檢測揮發(fā)酚值，以不加菌株的培養(yǎng)基作為對照.以時(shí)間為橫坐標(biāo)，苯酚降解率為縱坐標(biāo)，繪制圖形.

　　菌株最適生長溫度測定：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同pH影響實(shí)驗(yàn)，初始pH控制在7.0，溫度依次設(shè)定為20、25、30、35、40 ℃.

　　轉(zhuǎn)速對降解苯酚的影響：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同pH影響實(shí)驗(yàn)，初始pH 控制在7.0，溫度設(shè)定為30 ℃，轉(zhuǎn)速依次設(shè)定為100、150、200、250 r·min-1.

　　初始濃度對降解苯酚的影響：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同pH影響實(shí)驗(yàn)，初始pH控制在7.0，溫度設(shè)定為30 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r·min-1，初始苯酚溶液濃度依次設(shè)定為10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000 mg·L-1.

　　2.5.5 降解菌耐鹽性研究

　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同2.5.4 節(jié)中的pH影響實(shí)驗(yàn)，初始pH控制在7.0，溫度設(shè)定為30 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r·min-1，利用NaCl調(diào)節(jié)鹽度，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次設(shè)定為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%、6.0%.

　　3 結(jié)果與分析(Results and analysis) 3.1 菌株鑒定 3.1.1 形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性

　　CM-HZX1在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d后，菌落形態(tài)呈現(xiàn)圓形、濕潤、橘紅色、不透明、易于挑起、邊緣整齊，直徑為0.8~1.12 nm，革蘭氏染色反應(yīng)呈陽性.由掃描電鏡照片可知(圖 1)，菌體呈球狀，無鞭毛，不產(chǎn)生芽孢.菌株CM-HZX1的部分生理生化特征研究結(jié)果顯示：接觸酶、硫化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原、尿素酶呈陽性，葡萄糖發(fā)酵、吲哚、V.P、甲基紅、明膠、甘油產(chǎn)酸、山梨醇、甘露醇、檸檬酸、水楊素、七葉苷、苯丙氨酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性.該菌株的生理生化特性同《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》中Rhodococcus sp.的結(jié)果一致.

　　圖 1 菌株CM-HZX1 的掃描電鏡圖片

　　3.1.2 CM-HZX1菌株的分子生物學(xué)鑒定

　　用英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成的酶提取CM-HZX1菌株的DNA，擴(kuò)增該菌株的16S rDNA，將獲得的PCR產(chǎn)物純化后委托上海立菲生物技術(shù)有限公司測序.獲得長度為1381 bp的16S rDNA片段，在GenBank中的注冊登記號為KM014567.通過Blast比對發(fā)現(xiàn)，CM-HZX1菌株與已報(bào)道紅球菌種屬(Rhodococcus sp.)一些細(xì)菌的16S rDNA序列相似性達(dá)96%~99%.用MEGA5.0軟件對這些細(xì)菌構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行同源性分析.

　　如圖 2所示，CM-HZX1菌株與紅球菌(Rhodococcus sp.)的遺傳距離最近，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征，可初步確定CM-HZX1菌株為紅球菌(Rhodococcus sp.)，命名為紅球菌(Rhodococcus sp.)CM-HZX1，并將該菌株送至位于武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)進(jìn)行保藏，保藏編號為CCTCC NO：M 2014329，保藏日期為2014年7月9日.

　　圖 2 基于16Sr DNA 序列建立的CM-HZX1 菌株和相關(guān)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

　　3.2 苯酚降解菌生長的曲線

　　微生物的生長曲線測定為菌株的培養(yǎng)及生長特性研究提供了參考.苯酚降解菌生長曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 3，結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長，CM-HZX1對于苯酚的降解率也逐步增高，54 h的降解率達(dá)到92.5%.在6~12 h有一個(gè)延緩的增長期，而在這個(gè)時(shí)間段，該菌的生長曲線也處于延遲期;在24~54 h苯酚的降解率開始穩(wěn)定增長，在12~24 h之間，該菌正處于對數(shù)生長期，此時(shí)的降解率增長至93.6%，說明CM-HZX1在這段時(shí)間內(nèi)的降解效率最高.當(dāng)CM-HZX1進(jìn)入衰退期時(shí)，由于培養(yǎng)基中活菌數(shù)量減少，降解率雖然在增長，但增長幅度減小.

　　圖 3 CM?HZX1 生長曲線和苯酚降解曲線的關(guān)系

　　3.3 苯酚降解最適條件 3.3.1 初始pH對苯酚降解的影響

　　pH值在含酚廢水的處理上是一個(gè)很關(guān)鍵的因素，因?yàn)樗鼤?huì)直接影響到廢水的物質(zhì)組成及微生物的活力.本實(shí)驗(yàn)通過改變初始培養(yǎng)基中pH值，考察初始pH對CM-HZX1菌株降解苯酚的影響，結(jié)果見圖 4.從圖 4可以看出，該菌在初始pH為4.0以下的苯酚培養(yǎng)基中幾乎沒有降解能力，當(dāng)pH由4.0增加至5.0時(shí)對苯酚的降解率有所增加;pH再增至6.0時(shí)，對苯酚的降解率迅速增大至82.6%;當(dāng)pH升高至7.0時(shí)，苯酚降解率仍然增加，降解率為93.6%，再增大pH對苯酚的去除沒有顯著影響;當(dāng)pH增加至10.0時(shí)，苯酚的降解率顯著下降至32.5%.由此可知，苯酚微生物降解菌CM-HZX1在pH值為6.0~9.0時(shí)對苯酚的降解率達(dá)到80%以上，說明該苯酚降解菌在弱酸性至弱堿性范圍內(nèi)對苯酚有較好的降解效果，該微生物耐受環(huán)境范圍廣，初始pH在7.0時(shí)，苯酚降解率最高為93.6%.

　　圖 4 初始pH 對苯酚降解的影響

　　3.3.2 溫度對苯酚降解的影響

　　溫度是影響微生物活力的重要因素之一，本實(shí)驗(yàn)通過改變培養(yǎng)溫度，考察溫度對CM-HZX1菌株降解苯酚能力的影響，結(jié)果見圖 5.可以看出，CM-HZX1菌株在溫度為30~35 ℃時(shí)對苯酚的降解率均超過90%;培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí)，苯酚降解率急劇下降，這可能是高溫抑制了細(xì)胞的生長，從而導(dǎo)致降解率下降.

　　圖 5 溫度對苯酚降解的影響

　　3.3.3 轉(zhuǎn)速對苯酚降解的影響

　　隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，供氧量逐漸增加，本文通過設(shè)定不同搖床轉(zhuǎn)速，得到溶解氧作用于微生物對苯酚降解率的影響，結(jié)果見圖 6.可以看出，隨著轉(zhuǎn)速的增大，苯酚降解率也在變大，在150 r·min-1時(shí)降解率為93.6%;隨后轉(zhuǎn)速增大，降解率趨于平穩(wěn).

　　圖 6 轉(zhuǎn)速對苯酚降解的影響

　　3.3.4 初始苯酚濃度對苯酚降解的影響

　　圖 7結(jié)果表明，在24 h時(shí)，苯酚初始濃度為10~500 mg·L-1時(shí)，降解率在80%以上;初始濃度為500~1000 mg·L-1時(shí)，降解率在70%左右;初始濃度為500 mg·L-1時(shí)，降解率最高為93.6%.說明在這個(gè)濃度下菌株能夠更好地將苯酚降解轉(zhuǎn)化為自己能利用的營養(yǎng)物質(zhì).在48 h時(shí)，苯酚初始濃度在低于1500 mg·L-1時(shí)，降解率都在90%以上，高于1500 mg·L-1時(shí)降解率很低，可能是高濃度苯酚對細(xì)胞有一定的毒害作用從而抑制其生長，影響降解效果.苯酚的消耗并不是完全用來生成新的細(xì)胞，而是被用來克服強(qiáng)烈的底物抑制作用.另外，細(xì)胞各種代謝產(chǎn)物的積累也影響了細(xì)胞生物量的增加(Monteiroáet al.，2000).苯酚濃度越高，底物抑制作用越強(qiáng)，相對的細(xì)胞得率就越小，同時(shí)也導(dǎo)致細(xì)胞生長的延滯期越長(Hao et al.，2002).

　　圖 7 初始苯酚濃度對苯酚降解的影響

　　近年來，人們在苯酚降解研究中分離出大量的苯酚降解菌.例如，唐赟等(2006)分離出的嗜熱菌BF80降解6 mmol·L-1(約為564 mg·L-1)的苯酚需要120 h;劉廣金等(2007)分離出的一株假單胞菌(Pseudomonas sp.)降解500 mg·L-1的苯酚需要60 h;錢奕忠等(2001)發(fā)現(xiàn)的一株假單胞菌，在pH=6.79、溫度為30~37 ℃之間時(shí)，降解472 mg·L-1的苯酚需要78 h;章杰等(2006)分離出的苯酚降解菌JF-2降解600 mg·L-1的苯酚需要13 d;Lee等(1996)分離出的醋酸鈣不動(dòng)桿菌PHEA-2降解苯酚的最佳質(zhì)量濃度為300 mg·L-1.本研究分離出的菌株CM-HZX1降解苯酚的能力明顯高于上述諸多已分離出的苯酚降解菌株.

　　3.4 苯酚降解菌耐鹽的研究

　　工業(yè)廢水水質(zhì)復(fù)雜，特別是石化廢水中含鹽量較高，微生物難以發(fā)揮活性甚至于死亡.因此，需要考察鹽度對苯酚降解菌的影響.從圖 8可以看出，苯酚降解菌CM-HZX1在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%~4.0%時(shí)，苯酚降解率都在85%以上，隨著鹽度的增大，苯酚降解率下降，說明CM-HZX1屬于中度耐鹽菌.

　　圖 8 鹽濃度對降解苯酚的影響

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　1) 從活性污泥中分離到一株能以苯酚為唯一碳源生長的菌株CM-HZX1，初步鑒定該菌株屬于紅球菌(Rhodococcus sp.).

　　2) 通過對菌株在不同pH、溫度、轉(zhuǎn)速及不同苯酚濃度下的降解率大小比較，初步認(rèn)為該菌株能適應(yīng)較廣泛的環(huán)境條件，降解最適條件為pH=7.0、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1，能耐受4%鹽度的廢水環(huán)境.具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3) 在最適條件下，對0.5 g·L-1的苯酚在24 h時(shí)降解率可達(dá)93.6%，對1.5 g·L-1的苯酚在48 h時(shí)降解率在90%以上，降解效果遠(yuǎn)高于已報(bào)道的大部分苯酚降解菌株，可將其運(yùn)用于工業(yè)含酚廢水的生物處理，具有廣闊的應(yīng)用前景.