生物法一直是工業(yè)有機(jī)廢水處理重點(diǎn)研究的領(lǐng)域, 是處理有機(jī)廢水最常用、最經(jīng)濟(jì)的方法之一, 隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展, 高通量測(cè)序技術(shù)的成熟與普及, 近幾年, 探究有機(jī)污染物的降解效率與微生物間的聯(lián)系、微生物群落結(jié)構(gòu)及功能和廢水處理的相關(guān)性成為研究的熱點(diǎn).有研究表明, 微生物群落具有很高的敏感性以及對(duì)多變環(huán)境的適應(yīng)性, 群落結(jié)構(gòu)在不同的廢水處理系統(tǒng)以及在同一廢水處理系統(tǒng)的不同運(yùn)行時(shí)期、不同的運(yùn)行工藝中都表現(xiàn)著差異, 環(huán)境參數(shù)改變時(shí), 細(xì)菌群落的多樣性也會(huì)隨之變化.
焦化廢水中含有有毒/難降解物, 成分復(fù)雜, 可生化性較差, 被世界公認(rèn)為目前最難治理的工業(yè)廢水, 如何提高焦化廢水的可生化性, 提高焦化廢水處理系統(tǒng)微生物的穩(wěn)定性和降解效率, 一直是領(lǐng)域中的難點(diǎn).過去的十年間, 焦化廢水處理工藝大部分采用A/O、A/H/O或者A/O2等先經(jīng)過厭氧過程再到好氧過程的處理方法.相對(duì)于厭氧過程, 好氧過程有機(jī)物的分解比較徹底, 釋放的能量多, 有機(jī)物轉(zhuǎn)化速率快, 廢水能在較短的停留時(shí)間內(nèi)獲得高的COD去除率.近幾年, 焦化廢水處理也開始直接從好氧階段開始, 形成了新的好氧-水解-好氧的新工藝.
在實(shí)際工程運(yùn)行的啟動(dòng)階段, 生物系統(tǒng)的微生物需要通過其他廢水處理工程提供大量的污泥進(jìn)行培養(yǎng), 因?yàn)槭姓鬯幚韽S污泥的生成量大, 相對(duì)容易獲取, 大部分焦化廢水處理工程的啟動(dòng)階段都要部分或者全部接種市政污泥.李秀艷將市政污泥接種于焦化廢水中, 經(jīng)過32 d的馴化使活性污泥對(duì)焦化廢水中酚和COD的去除率分別為99.8%及60.0%,; 筆者的團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)設(shè)計(jì)了新建的4個(gè)焦化廢水處理工程, 全部采用市政污泥調(diào)試運(yùn)行成功.目前對(duì)于焦化污泥馴化的研究大多只關(guān)注馴化后污泥對(duì)廢水的降解能力, 沒有涉及到微生物菌落的結(jié)構(gòu)分析, 深入研究微生物群落的變化才能從本質(zhì)上揭示整過馴化過程活性污泥降解性能改變的原因, 指導(dǎo)工程的調(diào)試與運(yùn)行.本研究采集焦化廢水原水置于好氧反應(yīng)罐中, 接種市政污泥, 檢測(cè)好氧降解過程中廢水成分的變化, 采用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)從種群和群落水平分析微生物群落的進(jìn)化和演替過程, 討論環(huán)境因子和微生物菌群間競(jìng)爭(zhēng)分別的作用機(jī)制.本研究工作的結(jié)果可以指導(dǎo)實(shí)際工程進(jìn)水水質(zhì)條件、工藝設(shè)計(jì)參數(shù)確定以及優(yōu)化運(yùn)行的決策.
1 材料與方法 1.1 焦化廢水與市政污泥的采集
實(shí)驗(yàn)所用的焦化廢水(原水)采自寶鋼集團(tuán)廣東韶關(guān)鋼鐵焦化廠酚氰廢水處理站隔油池進(jìn)水口, 焦化廢水主要污染指標(biāo)為COD 3857.26 mg·L-1、氨氮43.23 mg·L-1、硫氰化物480.25 mg·L-1、氰化物17.28 mg·L-1、揮發(fā)酚691.45 mg·L-1、pH=9.87.實(shí)驗(yàn)所用的市政污泥采自廣州市瀝滘城市污水處理廠二沉池, 采集到的市政污泥先用尼龍紗網(wǎng)去除泥水混合物內(nèi)的砂石等物質(zhì).
1.2 反應(yīng)體系的構(gòu)建及運(yùn)行參數(shù)
實(shí)驗(yàn)裝置如圖 1所示.
圖 1 攪拌反應(yīng)釜示意
用1 mg·L-1鹽酸溶液將焦化廢水的pH調(diào)節(jié)至7.往反應(yīng)器中加入適量處理后的焦化廢水, 將市政污泥接種于反應(yīng)器中, 使泥水混合物的總體積為4 L(反應(yīng)器總體積為5 L), 污泥的接種量為反應(yīng)體系體積的20%, 實(shí)際測(cè)得接種污泥SV=21.0%、SVI=37.3 mL·g、MLSS=5 634.0 mg·L-1、MLVSS=3 562.0 mg·L-1、MLSS/MLVSS=0.63.投加0.25 g·L-1 K2HPO4作為磷源.反應(yīng)器運(yùn)行的溫度為30℃、pH控制在7~7.5、DO控制在2~5 mg·L-1.反應(yīng)過程中不添加任何輔助碳源, 共運(yùn)行144 h.
1.3 主要指標(biāo)的檢測(cè)方法
1.3.1 運(yùn)行參數(shù)及污染物濃度的檢測(cè)
馴化過程中每間隔8 h對(duì)反應(yīng)體系中的COD、苯酚、氨氮和硫氰化物的濃度進(jìn)行測(cè)定, 以此來初步觀察污泥中微生物對(duì)廢水的適應(yīng)狀態(tài).其中, COD采用重鉻酸鉀微波消解法測(cè)定、苯酚采用液相色譜法測(cè)定、氨氮采用納氏試劑比色法法測(cè)定、硫氰化物采用鐵離子顯色分光光度法測(cè)定.用電極法測(cè)定運(yùn)行過程中的pH和DO.用重量法測(cè)定MLSS.
1.3.2 微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)使用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取污泥樣品DNA.稱取200 mg污泥樣品, 通過Buffer SCL裂解污泥樣品, 釋放出基因組DNA, 然后通過Buffer SP和氯仿去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì), Buffer SB去除樣品中腐殖酸, 避免對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾.最后將所得DNA溶液置于-20℃保存, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).
將上一步提取的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增后的DNA樣品用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè), 以確定污泥樣品的DNA是否被提取出來.實(shí)驗(yàn)所使用的通用引物為341f-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCG GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和534r(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′). PCR體系的組成為：25 μL的Taq PCR Master Mix、2 μL的DNA模板、2 μL的Primer 357f-GC、2 μL的Primer 518r、19 μL的Nuclease-free ddH2O, 共50 μL的體系. PCR擴(kuò)增的條件為94℃預(yù)變性4 min, 94℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 32個(gè)循環(huán), 72℃最終延伸10 min, 最后溫度降至4℃保存.
將經(jīng)過檢測(cè)的樣品DNA送至廣州美格生物科技有限公司, 用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行微生物群落組成和多樣性檢測(cè), 將馴化過程微生物群落的演變與污染物濃度變化建立對(duì)應(yīng)分析.
2 結(jié)果與討論 2.1 污泥對(duì)焦化廢水的降解
投加市政污泥后, 反應(yīng)器中焦化廢水的COD、苯酚、硫氰化物和氨氮濃度隨時(shí)間的變化分別如圖 2及圖 3所示.
圖 2 COD和苯酚隨時(shí)間的變化趨勢(shì)
圖 3 氨氮和硫氰化物隨時(shí)間的變化趨勢(shì)
該反應(yīng)器中焦化廢水主要污染物質(zhì)的起始濃度為COD 3 432.20 mg·L-1、苯酚469.04 mg·L-1、硫氰化物450.00 mg·L-1、氨氮41.10 mg·L-1, 經(jīng)過144 h的反應(yīng)后各物質(zhì)的濃度變?yōu)镃OD 376.06 mg·L-1、苯酚0.36 mg·L-1、氨氮203.66 mg·L-1, 硫氰化物在反應(yīng)96 h時(shí)其濃度已低于檢測(cè)下限(0.1 mg·L-1).這次反應(yīng)中, COD的去除率為89.04%, 其中苯酚、硫氰化物的去除率更是高達(dá)99.92%、100%.由此可見, 市政污泥能在較短的時(shí)間內(nèi)適應(yīng)焦化廢水的劇毒環(huán)境, 并迅速降解廢水中苯酚、硫氰化物等污染物質(zhì).
從圖 2可以看出, 污泥對(duì)焦化廢水有一定的適應(yīng)時(shí)間, 16 h前, COD、苯酚、硫氰化物和氨氮的濃度變化都不大, 16 h后, COD開始出現(xiàn)大幅度的降解, 24 h前降解了20.99%, 苯酚則在24 h仍然沒有變化, 24~40 h之間有一個(gè)很明顯的快速降解, 40 h苯酚已經(jīng)降解了97.14%, 這個(gè)時(shí)候的COD降解和苯酚的降解趨勢(shì)相近, COD降解了58.95%.從圖 3可知, 硫氰化物和氨氮在72 h前的變化很小, 在72 h后硫氰化物開始迅速降解, 96 h時(shí)硫氰化物的濃度已經(jīng)低于檢測(cè)限, 氨氮濃度則在72 h和96 h之間有較大上升, 隨后趨于穩(wěn)定.
反應(yīng)前16 h廢水的COD濃度并沒有出現(xiàn)較大的變化, 而且剛投加的市政污泥中微生物大多為異養(yǎng)型, 由此可推斷, 在這段時(shí)間內(nèi)微生物群落還沒完全適應(yīng)焦化廢水的環(huán)境, 無(wú)法利用廢水中的大部分碳源.經(jīng)過16 h的適應(yīng)期, 市政污泥內(nèi)的微生物群落對(duì)COD的利用率逐漸增加, 但此時(shí)苯酚濃度仍然沒有變化, 說明此時(shí)的COD降低是微生物降解苯酚以外的污染物引起, 在24 h時(shí)苯酚的濃度也開始下降, 可初步推測(cè)在此實(shí)驗(yàn)中污泥對(duì)苯酚的適應(yīng)期是24 h, 反應(yīng)器運(yùn)行了72 h, 硫氰化物濃度才開始出現(xiàn)明顯的下降, 由于硫氰化物對(duì)污泥中部分微生物具有毒性抑制, 適應(yīng)時(shí)間比較長(zhǎng), 此時(shí)COD和苯酚的濃度分別為1 144.06 mg·L-1和1.96 mg·L-1, 表明硫氰化物的降解是以苯酚基本被利用完作為條件.潘霞霞等研究了反應(yīng)體系中苯酚濃度對(duì)硫氰化物降解的影響, 發(fā)現(xiàn)隨著苯酚濃度的增大, 硫氰化物被完全降解的時(shí)間增長(zhǎng), 證明了上述觀點(diǎn).另外, 氨氮濃度隨著硫氰化物的降解開始顯著地升高, 理解為廢水中的氰化物、硫氰化物和有機(jī)氮等物質(zhì)被氧化后釋放出氨氮, 表現(xiàn)出明顯的氨化過程特征.
2.2 污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化
市政污泥在焦化廢水的環(huán)境中馴化, 其微生物菌落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化從而適應(yīng)新的廢水環(huán)境.通過Illumina高通量測(cè)序?qū)ξ勰嘀形⑸锞溥M(jìn)行初步分析.其中A、B、C、D、E、F分別表示培養(yǎng)時(shí)間為0、16、40、72、96、144 h的活性污泥樣品.
從表 1中樣品的序列組成及OTU組成可知, 市政污泥投入焦化廢水中后, 運(yùn)行16 h的污泥樣品序列和OTU組成從31 985、8 070下降至28 304、7 225, 說明焦化廢水對(duì)市政污泥的微生物群落表現(xiàn)出一定的毒性, 培養(yǎng)起始階段部分微生物死亡, DNA溶解.從表 2的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可知, 0 h和16 h的數(shù)值相差很小, 說明微生物群落多樣性幾乎沒有變化. 40 h的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)有所下降, 即此時(shí)微生物多樣性比0 h和16 h略低. 72 h的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)又有所提升, 表明污泥在適應(yīng)焦化廢水后, 微生物利用焦化廢水的污染物為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng), 造成序列數(shù)、OTU數(shù)比40 h時(shí)提高了, 同時(shí)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也同樣升高, 多樣性回復(fù)到0 h及16 h的水平.隨后的96 h, 污泥雖然適應(yīng)了焦化廢水的環(huán)境, 焦化廢水中的大部分碳源已被利用, 微生物處在缺營(yíng)養(yǎng)狀態(tài), 氨氮的濃度快速上升, C/N比嚴(yán)重失衡, 高的氨氮濃度也會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng), 部分微生物因不適應(yīng)此環(huán)境而死亡, 故此時(shí)的序列數(shù)、OTU數(shù)開始下降, 微生物多樣性指數(shù)有較明顯的降低.如圖 4所示, 樣品的PCoA分析圖中兩個(gè)物種在坐標(biāo)軸之間的距離越近, 表示兩個(gè)樣品的物種組成越相似, 從中可知：A和B組成相似, C和D組成相似, E和F組成相似, 這3組間的組成差異大, 與該3個(gè)時(shí)間段相對(duì)應(yīng)的廢水污染物的組成成分也存在較大的差異, 表明微生物群落的結(jié)構(gòu)變化是隨著廢水成分的改變及污染物成分的降解而相應(yīng)改變.
表 1 各樣品所含OTU數(shù)及序列分析
表 2 各階段泥樣α多樣性參數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
圖 4 樣品的PCoA(weighted unifrac)分析
面對(duì)新環(huán)境帶來的沖擊, 活性污泥中的微生物通過群落的演變與更替來逐步適應(yīng).從圖 5中可知, 活性污泥在整個(gè)反應(yīng)過程中其微生物群落90%以上是由6種phylum水平的菌群構(gòu)成, 分別是Firmicutes、Verrucomicrobia、Actinobacteria、Planctomycetes、Chloroflexi、Acidobacteria、Bacteroidetes、Proteobacteria, 其中Proteobacteria及Bacteroidetes占主導(dǎo)地位, 豐度分別為53.52%及38.57%(表 3), 與文獻(xiàn)的研究結(jié)果相似.整個(gè)反應(yīng)過程中菌群在門水平上沒有很大的變化, 但是活性污泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬隨著廢水環(huán)境的改變而更替.從圖 6的污泥微生物群落的genus水平可以觀察到, 起始時(shí)污泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Dechloromonas、Thermomonas, 相對(duì)豐度分別為6.04%、4.73%(表 4); 在144 h的反應(yīng)過程中, 其優(yōu)勢(shì)菌屬在不斷地變化, 先是演變?yōu)锳cinetobacter、Pseudomonas, 相對(duì)豐度分別為7.67%、5.37%;然后演變?yōu)锽revundimonas、Sphingobacterium, 相對(duì)豐度分別為4.16%、7.19%;最后演變?yōu)镕luviicola、Stenotrophomonas、Thiobacillus, 相對(duì)豐度分別為9.88%、4.46%、8.11%.可見, 在不斷變化的廢水環(huán)境中, 微生物群落會(huì)受到不同程度的沖擊, 群落中的優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化, 活性污泥適應(yīng)新的廢水環(huán)境并有效利用廢水中的殘余物質(zhì), 存在某種作用使降解與菌群之間建立了響應(yīng)關(guān)系.
圖 5 phylum水平各樣品相對(duì)豐度分布
表 3 微生物菌落結(jié)構(gòu)門水平上的組成
圖 6 genus水平各樣品相對(duì)豐度分布
表 4 微生物菌落結(jié)構(gòu)屬水平上的組成
2.3 污染物降解與微生物群落演變的聯(lián)系
結(jié)合4種環(huán)境因子的降解情況發(fā)現(xiàn), 反應(yīng)器運(yùn)行在16~40 h之間, COD的濃度從3 135.59 mg·L-1降至1 408.90 mg·L-1, 苯酚濃度從469.04 mg·L-1降至13.42 mg·L-1, 與此同時(shí), 污泥樣品則是從樣品B演變到了樣品C; 再結(jié)合genus水平物種相對(duì)豐度熱圖的分析, 又可發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過了40 h的反應(yīng), Acinetobacter、Pseudomonas兩種菌屬的豐度明顯增大; 從表 4中可知, Acinetobacter和Pseudomonas的相對(duì)豐度分別從開始的時(shí)的0.64%、0.27%增加到7.67%、5.37%, Acinetobacter和Pseudomonas是兩種較為常見的酚類降解菌, 能降解焦化廢水中苯酚和間甲酚等結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的酚類物質(zhì).上述現(xiàn)象均表明了演變的存在.
反應(yīng)器運(yùn)行在72~96 h之間, 硫氰化物的濃度從450.00 mg·L-1降至0.1 mg·L-1以下, 氨氮濃度從41.10 mg·L-1升至178.01 mg·L-1, 此階段是SCN-的降解階段及氨氮的積累階段.從圖 7可以看出, 從72~96 h, T78、WCHB1-05、Sphingobacterium、Longilinea、Brevundimonas、Lysobacter、Phenylobacterium、Chryseobacterium、Luteimonas等菌屬的豐度明顯增大.從表 4可以看出, 其中的Sphingobacterium、Brevundimonas、Lysobacter、Chryseobacterium增長(zhǎng)最多, 所占的豐度最大, 分別從72 h的0.31%、0.86%、0.90%、0.24%增加到96 h時(shí)的7.19%、4.16%、3.22%、2.16%, 說明這幾種菌屬參與了硫氰化物的利用. Sphingobacterium、Brevundimonas菌屬也可以利用復(fù)雜的烴類物質(zhì)作為碳源, 如喹啉、菲等焦化廢水常見的難降解有機(jī)物.黃會(huì)靜的研究表明Chryseobacterium為焦化廢水中可高效降解硫氰化物的菌屬, 即菌種豐度的變化受污染物或營(yíng)養(yǎng)成分的誘導(dǎo).
圖 7 genus水平的前30個(gè)物種相對(duì)豐度熱圖
隨著苯酚、硫氰化物等主要能量物質(zhì)的用盡, 廢水中的微生物結(jié)構(gòu)也隨之變化, 到144 h的測(cè)試發(fā)現(xiàn), 優(yōu)勢(shì)菌屬變?yōu)镕luviicola、Stenotrophomonas及Thiobacillus, 豐度從96 h的0.55%、2.88%、0.42%增長(zhǎng)為9.88%、4.46%、8.11%. Thiobacillus是硫化細(xì)菌, 氧化還原態(tài)硫化物或單質(zhì)硫?yàn)榱蛩? 表現(xiàn)為專性化能自養(yǎng).硫氰化物在降解的過程中會(huì)生成NH3、NO2-和S2-等代謝產(chǎn)物, Thiobacillus利用這些代謝產(chǎn)物繁殖并成為主要菌屬. Stenotrophomonas、Fluviicola分別屬于變形菌門的γ-Proteobacteria綱、擬桿菌門的Flavobacteria綱, γ-Proteobacteria和Flavobacteria普遍存在于含硝態(tài)氮的廢水中且γ-Proteobacteria綱和Flavobacteria綱的菌屬對(duì)硝態(tài)氮具有較好的利用能力.
從測(cè)序結(jié)果可知, 整個(gè)反應(yīng)過程硝化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌沒有占到優(yōu)勢(shì), 在各種相對(duì)豐度熱圖(圖 7)中沒有被統(tǒng)計(jì)出來, 圖 3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也反映了體系中的氨氮濃度沒有下降.在反應(yīng)的起始階段, 焦化廢水對(duì)市政污泥中的微生物具有較強(qiáng)的毒性抑制, 如氰化物對(duì)硝化細(xì)菌的強(qiáng)的抑制作用存在, 同時(shí)起始時(shí)的氨氮濃度較低, 使得硝化細(xì)菌在培養(yǎng)起始階段無(wú)法快速繁殖.到了反應(yīng)的中后期, 雖然氨氮濃度較高, 但此時(shí)廢水中的碳/氮比較小, 在后期, Thiobacillus成為優(yōu)勢(shì)菌, 氧化硫?yàn)榱蛩? 反應(yīng)液的pH值下降, 而硝化菌適合在弱堿性的環(huán)境中生長(zhǎng), 解析了本實(shí)驗(yàn)的中后期, 在沒有調(diào)節(jié)碳/氮比和pH的情況下, 硝化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌不能快速繁殖的現(xiàn)象.
從上述的結(jié)果及分析可知, 污染物成分和濃度的變化直接改變污泥中微生物所處的生存環(huán)境, 從而使得污泥中各個(gè)菌群的競(jìng)爭(zhēng)力發(fā)生改變, 高濃度污染物質(zhì)會(huì)促進(jìn)適應(yīng)該環(huán)境的降解菌生長(zhǎng)繁殖, 這些菌群逐漸成為污泥微生物群落中的優(yōu)勢(shì)菌群.廢水濃度變化帶來的環(huán)境改變可以促進(jìn)活性污泥不同優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)建, 即發(fā)生了微生物群落的演變.
具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。3 結(jié)論
(1) 接種的市政污泥在克服焦化廢水毒性抑制并適應(yīng)環(huán)境之后, 能夠有效降解廢水中的污染物質(zhì), 其中40 h時(shí)降解97.14%的苯酚, 96 h時(shí)的硫氰化物濃度已低于檢測(cè)限.
(2) 從苯酚降解到硫氰化物降解的不同階段中, 優(yōu)勢(shì)菌群從Acinetobacter、Pseudomonas逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镾phingobacterium、Brevundimonas, Lysobacter及Chryseobacterium, 表明存在微生物群落演替受廢水組成的誘導(dǎo)作用, 其響應(yīng)還涉及廢水的環(huán)境條件如pH值等.
(3) 在焦化廢水處理工程的調(diào)試及微生物馴化過程中, 客觀存在基于廢水環(huán)境的改變促使微生物菌群間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系加以適應(yīng), 從而導(dǎo)致污泥中優(yōu)勢(shì)菌群的演變, 通過認(rèn)識(shí)環(huán)境因子和微生物菌群間競(jìng)爭(zhēng)對(duì)群落結(jié)構(gòu)演變影響的規(guī)律, 可以成為工程啟動(dòng)運(yùn)行和穩(wěn)態(tài)管理的科學(xué)工具.
