我國(guó)是煙草種植、生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó), 種植面積和產(chǎn)量均居世界首位.煙草行業(yè)是我國(guó)納稅大戶, 在“十二五”期間煙草行業(yè)五年上繳財(cái)政總額4.13萬(wàn)億元, 年均增長(zhǎng)17.5%, 比同期全國(guó)財(cái)政收入年均增長(zhǎng)率高4.7%, 在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用.然而在煙草制品生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量廢水 , 國(guó)家統(tǒng)計(jì)局2013年報(bào)道我國(guó)煙草制品業(yè)廢水排放量為2362×104 t.煙草工業(yè)廢水排放量大且顏色深、成分復(fù)雜, 煙葉中的尼古丁、有機(jī)酸、氨基聯(lián)苯、萘胺等成分造成廢水毒性大, 污染嚴(yán)重, 被歐盟法規(guī)認(rèn)定為“有毒危險(xiǎn)性廢物”(Novotny et al., 1999), 若不妥善處理, 極易對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染和潛在的危害(Wang et al., 2012) .尼古丁是煙草廢水中一種關(guān)鍵的污染物, 溶于水和多種有機(jī)溶劑, 甚至可穿過(guò)復(fù)雜的生物膜, 包括血-腦屏障, 具有致癌、致畸、致突變性, 對(duì)人體造成危害(Tega et al., 2013) .因而有效處理該類廢水, 使處理后污水無(wú)毒排放或中水回用, 對(duì)煙草工業(yè)綠色健康發(fā)展具有重要的意義.

　　目前已有多種方法應(yīng)用于煙草廢水處理領(lǐng)域, 工程常采用物理-化學(xué)-生物方法聯(lián)合處理工藝, 其中生物法由于其經(jīng)濟(jì)高效的特性成為目前該類廢水處理的主流技術(shù), 并作為主體工藝技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中.然而由于尼古丁及多環(huán)芳烴等污染物的難降解性和生物毒性(Yuan et al., 2006; Qu et al., 2006), 導(dǎo)致活性污泥的處理體系出現(xiàn)出水水質(zhì)差、系統(tǒng)運(yùn)行不穩(wěn)定等問(wèn)題, 使傳統(tǒng)生物處理技術(shù)面臨巨大挑戰(zhàn)(郭靜波等, 2011) .而生物強(qiáng)化技術(shù)被認(rèn)為是最直接有效改善活性污泥性能, 提高系統(tǒng)運(yùn)行效率的技術(shù)(Limbergen et al., 1998) .目前生物強(qiáng)化局限于單一菌株對(duì)活性污泥的強(qiáng)化處理(Wang et al., 2013), 并主要關(guān)注對(duì)單一污染物尼古丁的降解效能和機(jī)理分析, 如篩選獲得以節(jié)細(xì)菌(Arthrobacter sp.)(Ruan et al., 2006; Hochstein et al., 1959), 假單胞菌(Pseudomonas sp.)(Chen et al., 2008; Ruan et al., 2005) 為主的尼古丁降解菌類群.然而作為生物強(qiáng)化的菌種只有能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定適應(yīng)處理環(huán)境才能發(fā)揮較好的作用(Fantroussi et al., 2005) .煙草廢水處理運(yùn)行過(guò)程受產(chǎn)能、生產(chǎn)周期和煙草質(zhì)量影響, 水質(zhì)波動(dòng)較大且成分復(fù)雜, 除了含有高濃度的尼古丁外, 還含有其他多種有毒有害污染物.單一菌株的處理往往不能達(dá)到預(yù)期效果.與之相比, 菌群的環(huán)境耐受能力強(qiáng), 處理效果穩(wěn)定, 在環(huán)境治理研究中取得較好的處理效果(Seib et al., 2015; Zhao et al., 2016) .

　　目前鮮有利用菌群進(jìn)行煙草廢水處理或生物強(qiáng)化的應(yīng)用研究, 本研究旨在通過(guò)篩選馴化的方式獲得高效活性降解菌群, 并分析處理前后煙草廢水理化參數(shù)和有機(jī)成分的變化, 利用克隆文庫(kù)技術(shù)分析菌群構(gòu)成及多樣性指數(shù), 解析菌群處理過(guò)程中煙草廢水污染成分的變化及降解過(guò)程.本研究獲得的菌群由于其構(gòu)成的穩(wěn)定性和代謝途徑的多樣性, 能夠適應(yīng)不同濃度的廢水環(huán)境, 去除尼古丁的同時(shí)有效降解其他多種雜環(huán)化合物、芳香烴及酯類等污染物, 拓展了降解范圍, 為菌群在煙草制品廢水處理中的應(yīng)用提供了理論指導(dǎo).

　　2 材料和方法(Materials and methods) 2.1 水質(zhì)分析

　　廢水來(lái)自于某煙草公司, 該公司產(chǎn)生的廢水黃褐色, 渾濁并伴有典型煙草氣味.廢水基本理化參數(shù)檢測(cè)按照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》規(guī)定進(jìn)行(國(guó)家環(huán)保局, 1997) .其中COD、色度、懸浮物(SS)采用便攜式水質(zhì)分析儀(DR1900, 美國(guó)Hach公司)進(jìn)行測(cè)定;生化需氧量(BOD5)采用BOD測(cè)試儀(美國(guó)Hach公司)進(jìn)行測(cè)定;pH值采用pH電極法測(cè)定, pH計(jì)(FE20, Mettler Toledo);鹽度采用折光率法進(jìn)行測(cè)定, 鹽度計(jì)(手持式鹽度儀, 南京山特公司);氨氮含量采用納式試劑分光光度法(GB 7497-87) 測(cè)定;可溶性磷酸鹽采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-89) 測(cè)定.

　　2.2 有機(jī)污染物分析

　　利用固相萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas Chromatography-Mass Spectra, GC-MS)分析有機(jī)污染物.

　　水樣預(yù)處理：取3份水樣各500 mL, 分別用H2SO4和NaOH調(diào)節(jié)至pH小于2、自然pH和pH大于11, 用0.45 μm濾膜過(guò)濾后分別用固相萃取柱(Agela Cleanert C-18) 萃取(Yang et al., 2013) .固相萃取柱活化后, 水樣以5.0 mL·min-1的流速滲透過(guò)固相萃取柱, 使污染物吸附于萃取柱中.預(yù)富集后抽真空10 min使小柱干燥, 依次加入乙酸乙酯、正己烷和甲醇, 每種有機(jī)溶劑自然流下后收集洗脫的樣品, 將同一個(gè)樣品的淋洗液合并, 加入無(wú)水硫酸鈉脫水, 最后氮吹儀吹干濃縮過(guò)濾后用于定性定量分析微生物降解前后水樣中的污染物類別和含量.實(shí)驗(yàn)中用到的所有有機(jī)溶劑均為色譜純.

　　GC-MS/MS聯(lián)用儀(Agilent 7890A GC/7200 Q-TOF MS)分析污染物種類和含量.方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行并略有調(diào)整(Yang et al., 2013), 儀器設(shè)置參數(shù)如下：①進(jìn)樣口溫度：250 ℃;分流比：100:1(V/V);色譜柱：30 m×250 μm×0.25 μm (J&W HP-5, 320 ℃);載氣：氦氣;流速：1.2 mL·min-1;升溫程序：平衡時(shí)間0.5 min, 50 ℃ 維持1 min, 之后10 ℃·min-1升溫至130 ℃, 30 ℃·min-1 升溫至280 ℃ 維持6 min, 整個(gè)分析流程20 min.② Q-TOF質(zhì)譜條件：接口溫度：280 ℃;離子源：EI, 70 eV;離子源溫度：200 ℃;四極桿溫度：150 ℃.分析流程開(kāi)始階段, 設(shè)置溶劑延遲3 min.

　　2.3 功能菌群的篩選馴化和多樣性分析

　　根據(jù)廢水的性質(zhì)和污染類型, 選取污水處理廠污泥樣品, 以逐步提高污染物負(fù)荷的方式篩選馴化具有高效降解功能的菌群(Gong et al., 2009), 在操作過(guò)程中通過(guò)調(diào)整廢水的稀釋倍數(shù)實(shí)現(xiàn)污染物濃度梯度逐步提高、增加馴化壓力的目的.10 g污泥樣品加入到稀釋4倍的100 mL廢水中, 180 r·min-1、30 ℃培養(yǎng)4 d后轉(zhuǎn)接到稀釋倍數(shù)為2的廢水中, 逐步提高濃度至不稀釋廢水培養(yǎng)基中, 不斷馴化菌群活性和環(huán)境耐受能力, 測(cè)定處理污水過(guò)程中COD濃度變化, 篩選降解效率最高的功能菌群.

　　采用細(xì)菌總DNA提取試劑盒(MO BIO PowerSoil®)提取菌群樣品DNA, 利用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因(Li et al., 2011), 并構(gòu)建克隆文庫(kù)分析群落構(gòu)成(劉開(kāi)朗等, 2009) .克隆菌株送至諾和致源公司進(jìn)行測(cè)序分析, 測(cè)序結(jié)果采用Blast方法在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行相似性搜索比對(duì), 根據(jù)基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果分析群落多樣性和微生物群落結(jié)構(gòu)組成.

　　3 結(jié)果與討論 (Results and discussion) 3.1 廢水樣品的基本理化參數(shù)檢測(cè)

　　廢水基本理化參數(shù)列于表 1.在煙草制品生產(chǎn)過(guò)程中一般會(huì)有較多煙草成分溶解于水中, 從表中結(jié)果可以看出, 菌群處理前廢水的懸浮物和化學(xué)需氧量都很高, 分別達(dá)到735 mg·L-1和2169 mg·L-1.結(jié)果顯示處理前的廢水色度為1250, BOD5也高達(dá)971 mg·L-1.廢水的B/C為0.45.B/C即BOD5/COD, 是衡量污水可生化性的重要指標(biāo), 即污染物中可生化降解組分占總污染物的比例, 當(dāng)比值大于0.45, 生物降解性高;在0.45~0.30之間, 生物降解性一般;在0.30~0.20之間, 較難生物降解;比值小于0.20, 極難生物降解(陳壁波, 2006) .測(cè)定結(jié)果表明廢水水質(zhì)可生化性較好, 適用于生物處理, 這同文獻(xiàn)報(bào)道中的煙草制品廢水屬性一致(侯軼等, 2008) .

　　表 1(Table 1)

　　表 1 廢水樣品的基本理化參數(shù)

　　3.2 菌群篩選與降解活性分析

　　以COD為指標(biāo), 篩選獲得3個(gè)具有降解效果的菌群, 分別命名為菌群A、B和C, 對(duì)煙草廢水COD的降解效果如表 2所示.3組功能菌群經(jīng)過(guò)梯度馴化后對(duì)廢水COD的降解率均有提高, 且對(duì)COD為848、1692、2169 mg·L-1的廢水均有較好的處理效果, 適用濃度范圍大.其中菌群C在不同的COD下均展現(xiàn)出最優(yōu)的處理水平, 第4代處理廢水36 h后, COD由初始2169 mg·L-1降至366 mg·L-1, 去除率為83.1 %, 在3個(gè)菌群中降解效果最好.基于此, 后續(xù)以菌群C作為重點(diǎn)菌群, 深入研究處理煙草廢水降解效果、污染物組成變化及其微生物群落結(jié)構(gòu).

　　表 2(Table 2)

　　表 2 馴化菌群對(duì)煙草廢水的處理效果

　　圖 1(Fig. 1)

　　圖 1 菌群C對(duì)廢水樣品主要污染指標(biāo)的降解曲線

　　3.3 菌群處理前后污染物分析比較

　　準(zhǔn)確分析廢水中有機(jī)物組成及變化, 了解污染物代謝過(guò)程并為后續(xù)處理的方向和工藝調(diào)整提供指導(dǎo).污染物分析檢測(cè)的總離子流圖如圖 2所示, 其中每個(gè)離子流峰代表一種污染物, 每個(gè)峰積分面積代表污染物相對(duì)含量, 從下圖比較可以看出, 經(jīng)過(guò)菌群C作用后, 有機(jī)物種類大幅減少, 含量明顯降低.

　　圖 2(Fig. 2)

　　圖 2 菌群處理前后污染物GC-MS總離子流圖比較

　　去除空白樣品中有機(jī)物后, 將處理前后廢水有機(jī)物組成和含量列于表 3中.整體上分析處理后廢水中污染物含量是處理前10%~15%, 顯著下降, 降解率接近90 %, 這與COD的降解率基本相符, 說(shuō)明污染物種類含量和COD指標(biāo)正相關(guān).污染物種類也從降解前的49種變?yōu)榻到夂蟮?7種.從結(jié)果可以看出, 處理后有機(jī)酸的種類由10種降至6種且相對(duì)含量由1235×104降至67×104, 有機(jī)酸被有效降解, 與處理后pH有所上升對(duì)應(yīng), 并且有機(jī)酸是煙葉組成中重要的香氣化合物(王利杰等, 2007), 這也是經(jīng)菌群處理后廢水的氣味減弱的原因之一.此外, 處理后廢水中的含氧雜環(huán)和磺基類物質(zhì)被完全降解;在處理后的廢水中酯類和芳香烴的種類和相對(duì)含量均有所下降, 酯類化合物的種類由4種減少到1種, 相對(duì)含量由43.8×104降低為2.2×104;芳香烴的種類由6種減少到4種, 相對(duì)含量由58.1×104降至12.1×104.處理后酮醛類物質(zhì)含量豐富, 并出現(xiàn)醚、烯烴和苯酚.

　　表 3(Table 3)

　　表 3 廢水處理前后物質(zhì)組成分析

　　總體看來(lái), 經(jīng)過(guò)菌群C處理后, 廢水中對(duì)COD貢獻(xiàn)率較高的如尼古丁、吲哚、喹啉、酯及芳香烴等物質(zhì)含量顯著降低, 轉(zhuǎn)變?yōu)镃OD貢獻(xiàn)率較低小分子物質(zhì), 不僅極大減輕了出水指標(biāo)的壓力, 且去除了尼古丁為代表的毒性物質(zhì).未來(lái)研究可針對(duì)性的強(qiáng)化對(duì)噻唑、酮類及烴類物質(zhì)的降解能力, 進(jìn)一步降低廢水COD, 使其能夠穩(wěn)定達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn).

　　3.4 高效活性菌群構(gòu)成的測(cè)定

　　將高效菌群C文庫(kù)中的78個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序, 分析后共得到47個(gè)OTU.樣品微生物多樣性分析結(jié)果顯示：其香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener Index)、辛普森多樣性指數(shù)(Simpson Index)和菌群豐富度指數(shù)(ACE)分別為3.645、0.978、106.其中香農(nóng)-威納指數(shù)高, 說(shuō)明群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜;辛普森多樣性指數(shù)達(dá)到了0.978, 說(shuō)明群落中細(xì)菌種類多, 且個(gè)體分布均勻;污泥樣品中的菌群豐度指數(shù)(ACE)表明樣品具有較高的微生物種群豐度.總之, 微生物多樣性分析結(jié)果表明, 菌群中的微生物的群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 物種豐富度高, 且分布均勻, 適合使用于實(shí)際廢水處理中.

　　菌群的克隆文庫(kù)中的克隆主要屬于細(xì)菌域的7個(gè)主要類群, 如圖 3所示, 變形菌門(Proteobacteria)占有最大比例為48.75%, 其次為放線菌門 (Actinobacteria)占到總數(shù)的11.51%.另外還包含硝化螺旋菌門 (Nitrospira), 擬桿菌門 (Bacteriodetes), 綠彎菌門 (Chlorobacteria)等. 具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 3(Fig. 3)

　　圖 3 高效菌群C結(jié)構(gòu)組成

　　在克隆文庫(kù)中比例最高的變形菌門是細(xì)菌中最大的一門, 比例為48.75%, 而這與一般處理污水的活性污泥的構(gòu)成類似(Zak et al., 1994), 即活性污泥的優(yōu)勢(shì)類群也是變形菌門.變形菌門細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)極為多樣, 參與了大多數(shù)化合物的降解代謝, 具有多種代謝方式.變形菌門檢測(cè)到Brevundimonas aveniformis、Thiobacillus sp.、Desulfomicrobium sp.、Xanthobacter sp.及Burkholderiales sp.等微生物, 比例分別為1.3%、11.5%、1.3%、1.3%和1.3%, 具有降解多環(huán)芳烴(Xiao et al., 2010) 、脫氮除硫(范立民等., 2013) 、脫硫解毒重金屬離子(徐衛(wèi)華等, 2009) 、降解含氧雜環(huán)化合物(金小君等, 2012) 及降解酚類(Elsayed et al., 2003)等功能.

　　在克隆文庫(kù)中比例排第二位的為放線菌門(Actinobacteria), 比例為11.51%, 這也是污水處理系統(tǒng)中常見(jiàn)的微生物類群(Wagner et al., 2002) .在克隆文庫(kù)中檢測(cè)到了Nocardioides sp.、Microbacterium sp.等微生物種類, 兩者比例均為1.3%, 這些微生物在降解雜環(huán)芳香化合物(Rhee et al., 2011)和芳香烴(李麗等, 2001)等多種復(fù)雜有機(jī)物中均有報(bào)道.另外擬桿菌門的Flavobacterium sp. 比例為2.6%具有降解石油烴的功能(李麗等, 2001) .

　　正是微生物群落的結(jié)構(gòu)多樣性和代謝活性復(fù)雜性, 使其在降解過(guò)程中的形成“共代謝機(jī)制”, 高效降解了廢水中的有毒有害有機(jī)物, 并保障了降解的穩(wěn)定性和徹底性.目前尼古丁的細(xì)菌降解途徑有兩種, 一種是放線菌門節(jié)桿菌屬為代表的吡啶途徑(Brandsch, 2006), 另一種是變形菌門假單胞菌為代表的吡咯途徑(Wang et al., 2005) .在克隆文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)Nocardioides sp., 該菌也被報(bào)道有降解尼古丁的能力(Ganas et al., 2008), 并遵循吡啶途徑, 然而在菌群處理廢水過(guò)程中, 并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該途徑常出現(xiàn)的藍(lán)色物質(zhì), 是否由于菌群自身的復(fù)雜性, 使其并未按照單菌的代謝途徑降解廢水中的污染物, 有待進(jìn)一步深入研究.

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　1) 從環(huán)境樣品中獲得一組高效降解菌群C, 該菌群能夠適應(yīng)實(shí)際廢水的環(huán)境, 對(duì)廢水的COD和色度具有較好的去除效果, 降解率分別為83.1%和36.8%, 且處理后的廢水其他指標(biāo)包括氨氮和磷酸鹽等均有所下降.

　　2) 經(jīng)過(guò)GC-MS分析可知, 菌群對(duì)總有機(jī)物的去除率近90%, 且能夠完全去除廢水中的尼古丁, 并對(duì)其他含氮雜環(huán)物質(zhì)有很好的降解效果, 能夠?qū)�廢水中的有毒大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為COD貢獻(xiàn)率較低的小分子物質(zhì).

　　3) 菌群的多樣性分析表明, 微生物的群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 物種豐富度高, 且分布均勻.分析菌群構(gòu)成可知, 變形菌門在菌群構(gòu)成中所占比例最高為48.75%, 其次為放線菌門, 比例為11.51%.在菌群組成中發(fā)現(xiàn)能夠降解尼古丁的菌株Nocardioides sp., 然而該菌降解尼古丁的吡啶途徑并沒(méi)有在菌群C處理廢水過(guò)程中完整的體現(xiàn), 因而由多種物種構(gòu)成的微生物菌群對(duì)尼古丁的代謝機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

　　4) 菌群C群落組成豐富, 分布均勻, 包含多種不同功能的微生物菌株, 不僅能夠針對(duì)性的去除尼古丁等有毒有害化合物, 并且有效降低其他各項(xiàng)污染物含量.由于其穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)能夠適應(yīng)不同濃度的廢水, 未來(lái)可以用于強(qiáng)化活性污泥功能、減少剩余污泥、改善出水水質(zhì), 具有巨大的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用潛力.