城市污水從用水設(shè)施排出時(shí)，自身是不含或者僅含有極少量的硝化菌. 但是，城市排水管道內(nèi)表面、 管底沉積物和污水中存在了大量高活性的微生物. 城市污水從排放口，經(jīng)過(guò)排水管道、 明渠等下水管網(wǎng)長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)甚至十幾小時(shí)的輸送，到達(dá)污水處理廠時(shí)，往往會(huì)由于管渠壁上生物膜的脫落等原因可能會(huì)含有一定量的硝化菌. 這也是在城市污水處理廠的啟動(dòng)時(shí)，采用傳統(tǒng)的自然培養(yǎng)方法或利用初沉污泥以進(jìn)行快速自然培養(yǎng)可以達(dá)到良好的硝化效果的原因. Brion等運(yùn)用PCR和Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)加拿大魁北克省蒙特利爾市附近的3個(gè)污水廠的進(jìn)水及活性污泥中硝化菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)活性污泥中的硝化菌多樣性低于進(jìn)水中硝化菌多樣性，而且78%的AOB和86%的NOB一致. Saunders等對(duì)Denmark的3個(gè)污水廠的進(jìn)水與活性污泥進(jìn)行微生物群落多樣性測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，活性污泥中有35%OTUs(62% reads)存在于進(jìn)水中. 但是Lee等利用16S rRNA基因序列分析法對(duì)韓國(guó)首爾的4個(gè)污水廠的進(jìn)水與活性污泥中微生物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)二者僅有4.3%~9.3%的OTUs一致，從而認(rèn)為原水中微生物對(duì)活性污泥系統(tǒng)的影響較小. 常用的活性污泥模型ASM1、 ASM2和ASM3都假定進(jìn)水中的硝化菌(自養(yǎng)菌XA)含量也是設(shè)定為0 mg·L-1，并假定相對(duì)過(guò)程中生成的微生物量，進(jìn)水中微生物質(zhì)量濃度可以忽略. 而目前許多有關(guān)硝化菌的研究集中在生化系統(tǒng)內(nèi)，對(duì)于城市污水自身帶入系統(tǒng)的硝化菌很少涉及，而要了解這部分硝化菌對(duì)污水處理廠活性污泥系統(tǒng)的影響，就需要明確以下3個(gè)問(wèn)題: ①城市污水中是否含有活性污泥中硝化菌的優(yōu)勢(shì)菌屬? ②這部分硝化菌是否具有硝化活性?③如果城市污水與活性污泥中硝化菌一致，而且具有硝化活性，那么這部分硝化菌對(duì)活性污泥系統(tǒng)將有著連續(xù)自然接種的作用，而城市污水處理廠進(jìn)水帶入的這部分硝化菌對(duì)活性污泥系統(tǒng)的連續(xù)接種強(qiáng)度有多少?

　　本研究利用熒光原位雜交技術(shù)等方法對(duì)西安市兩個(gè)已運(yùn)行多年的大型污水處理廠(西安市第二、 第三污水處理廠)進(jìn)水中的硝化菌群落結(jié)構(gòu)與硝化性能進(jìn)行初步調(diào)查分析，并通過(guò)硝化活性估算進(jìn)水中硝化菌對(duì)活性污泥系統(tǒng)的連續(xù)接種強(qiáng)度，以期為活性污泥模型的優(yōu)化及城市污水處理系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與運(yùn)行提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

　　西安市第二污水處理廠(二污)、 西安市第三污水處理廠(三污)樣品取自曝氣沉砂池出水，取樣間隔為一至兩周，連續(xù)調(diào)查4個(gè)月.

　　西安市第二污水處理廠主要服務(wù)南二環(huán)路以南到南三環(huán)路之間和曲江池以西的區(qū)域，服務(wù)面積為53.5 km2，自運(yùn)行以來(lái)，污水廠一期自運(yùn)行以來(lái)的日處理能力為10×104～13×104 m3·d-1; 西安市第三污水處理廠主要服務(wù)紡織城地區(qū)，一期日污水處理能力約10×104m3·d-1，其中工業(yè)污水、 生活污水量大約各占一半，服務(wù)面積為25.09 km2. 兩個(gè)污水廠進(jìn)水為典型的城市污水.

1.2 熒光原位雜交

　　樣品用1×PBS緩沖溶液洗滌3次，然后用4%的多聚甲醛固定2 h，再用1×PBS緩沖溶液洗滌3次. 實(shí)驗(yàn)中采用的探針序列及雜交條件見(jiàn)表 1，其中氨氧化細(xì)菌采用CY3標(biāo)記，亞硝酸鹽氧化細(xì)菌采用CY5標(biāo)記，Comp Ntspa662、 Comp NIT3無(wú)熒光標(biāo)記，EUB采用FITC標(biāo)記. 按照雜交緩沖液中甲酰胺濃度由低到高的順序進(jìn)行雜交.

　　樣品雜交后用封片劑封片，并在共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8 X,Leica Microsystems,Mannheim,Germany)下觀察. 每個(gè)樣品隨機(jī)取10~20個(gè)視野，最終結(jié)果采用Leica Microsystems LAS AF-TCS SP8軟件分析.

　　實(shí)驗(yàn)中以NSO1225探針雜交的細(xì)菌數(shù)量表示氨氧化細(xì)菌(AOB)總數(shù)量，亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB)的總數(shù)是以Ntspa662、 NIT3、 Ntcoc206和Ntspn693所雜交的細(xì)菌數(shù)量的總和表示，總細(xì)菌數(shù)量是以EUBmix所雜交的細(xì)菌數(shù)量表示，AOB和NOB數(shù)量各占真細(xì)菌比例計(jì)算參照張巖等的方法.

1.3 硝化速率測(cè)定

　　5~10 L水樣離心(12 000 r·min-1，Z36HK離心機(jī)，Beckman Coulter Inc.,USA)濃縮，離心后的污泥再稀釋至1 000 mL，將溫度控制在20℃，pH控制在7.5. 曝氣3~4 h，以去除污泥中少量未淘洗干凈的有機(jī)物. 測(cè)定氨氧化速率時(shí)，加入疊氮化鈉(濃度為24 μmol·L-1)以抑制NOB呼吸，測(cè)定亞硝酸鹽氧化速率時(shí)，加入聚丙烯基硫脲(濃度為86 μmol·L-1)，前一至兩小時(shí)測(cè)定內(nèi)源呼吸速率(溶解氧儀，Seven2Go S9,Mettler Toledo)，內(nèi)源呼吸速率(以N計(jì))穩(wěn)定后分別加入30mg·L-1的NH4Cl和NaNO2，測(cè)定氨氧化速率和亞硝酸鹽氧化速率.

2 結(jié)果與討論

2.1 城市污水中硝化菌群落結(jié)構(gòu)

　　圖 1為城市污水樣品的熒光原位雜交照片(綠色為CY3 標(biāo)記的AOBmix，紅色為Cy5標(biāo)記的NOBmix，藍(lán)色為FITC標(biāo)記的EUBmix). 采用Leica Microsystems LAS AF-TCS SP8軟件對(duì)雜交照片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，二污與三污進(jìn)水中硝化菌占總細(xì)菌數(shù)的平均個(gè)數(shù)百分比[(AOB+NOB)/EUBmix]分別為(5.35±2.1)%和(6.0±2.8)%，與硝化正常的二污與三污活性污泥中硝化菌百分含量接近[平均分別為(6.6±1.5)%和(8.4±3.1)%][16]. 這個(gè)結(jié)果證實(shí)了進(jìn)入生物反應(yīng)池的城市污水中存在大量的硝化菌.

　　由于城市污水的來(lái)源包括工業(yè)廢水和生活污水，自身一般都不會(huì)含有硝化菌，所以這部分硝化菌很有可能是在城市污水管網(wǎng)輸送過(guò)程中產(chǎn)生，雖然一般認(rèn)為城市污水處于缺氧或者厭氧狀態(tài)，但是由于城市污水管網(wǎng)非滿流設(shè)計(jì)、 城市污水輸送過(guò)程中存在跌水甚至明渠等原因，空氣中的氧會(huì)不斷傳遞至城市污水中，從而為硝化菌的繁殖創(chuàng)造一定的條件，但是城市污水中硝化菌的確切來(lái)源有待進(jìn)一步調(diào)查分析. Brion等發(fā)現(xiàn)城市污水中硝化菌的含量與排水管網(wǎng)的服務(wù)面積正相關(guān)，服務(wù)面積越大，硝化菌濃度越高.

　　圖 2和圖 3分別為兩個(gè)污水廠進(jìn)水中AOB和NOB的硝化菌群落結(jié)構(gòu)分布. 從中可以看出，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage為城市污水中氨氧化菌的優(yōu)勢(shì)菌，同時(shí)也檢測(cè)到Nitrosospira的存在，與二污和三污活性污泥中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)接近. 以往研究中對(duì)城市污水中的硝化菌優(yōu)勢(shì)菌屬的檢測(cè)尚未見(jiàn)到，一般都集中在污水處理系統(tǒng)內(nèi)的活性污泥中，而對(duì)活性污泥的檢測(cè)中，Limpiyakorn等發(fā)現(xiàn)在城市污水傳統(tǒng)活性污泥法處理系統(tǒng)中，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage為氨氧化菌的優(yōu)勢(shì)菌; Siripong等對(duì)7個(gè)污水處理廠分別在冬季和夏季進(jìn)行硝化菌群落結(jié)構(gòu)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)盡管污水廠在冬季和夏季的溫度、 污泥齡不同，但是其中氨氧化菌的優(yōu)勢(shì)菌均為Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage，冬季Nitrosospira份額略有增加. Wang等和曾薇等對(duì)多個(gè)污水處理系統(tǒng)中的氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)氨氧化菌優(yōu)勢(shì)菌均為Nitrosomonas. 在硝化運(yùn)行正常的北石橋和第三污水處理廠的進(jìn)水中氨氧化優(yōu)勢(shì)菌與以上諸多研究中的活性污泥的氨氧化優(yōu)勢(shì)菌一致，均為Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage. 這個(gè)結(jié)果也可根據(jù)K/r繁殖策略解釋?zhuān)琋itrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage屬于r-strategists，Nitrosospira屬于K-strategists，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage (r-strategists)在高氨氮濃度條件下更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì). 而調(diào)查期間二污與三污城市污水中氨氮平均濃度分別為 38.5mg·L-1和39.9 mg·L-1，因此在城市污水中Nitrosomonas europea(r-strategists)與Nitrosospira(K-strategists)相比，更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì).

　　由圖 3可以看出，進(jìn)水中NOB的優(yōu)勢(shì)菌均為Nitrospira，次優(yōu)勢(shì)菌為Nitrobacter，且與Nitrococcus、 Nitrospina并存，與二污和三污活性污泥中亞硝酸鹽氧化菌群落結(jié)構(gòu)接近. Jauffur等運(yùn)用PCR和Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)加拿大魁北克省蒙特利爾市附近的3個(gè)污水廠的進(jìn)水與活性污泥中的Nitrospira細(xì)菌進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)城市污水中平均有99個(gè)細(xì)菌分類(lèi)操作單位(OTUs)，而活性污泥中僅有83個(gè)細(xì)菌分類(lèi)操作單位(OTUs). 這些結(jié)果證實(shí)城市污水中存在大量的Nitrospira，而且其多樣性高于活性污泥. 而污水廠活性污泥中Nitrospira與Nitrobacter并存，而且Nitrospira是活性污泥系統(tǒng)中NOB的優(yōu)勢(shì)菌屬. 這說(shuō)明常規(guī)活性污泥中亞硝酸鹽氧化菌的優(yōu)勢(shì)菌屬也大量存在于城市污水中. 這些結(jié)果同樣可以利用K/r繁殖策略解釋?zhuān)琋itrobacter屬于r-strategists，Nitrospira屬于K-strategists，而一般城市污水中亞硝鹽濃度低于常規(guī)檢測(cè)方法的檢測(cè)下限，活性污泥系統(tǒng)中亞硝酸鹽濃度一般也低于1mg·L-1，因此在活性污泥系統(tǒng)中Nitrospira與Nitrobacter相比，更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，而城市污水中由于亞硝酸鹽濃度更低，Nitrospira的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)更為明顯.

2.2 城市污水中硝化菌活性

　　為考察城市污水處理廠進(jìn)水中硝化菌的活性，實(shí)驗(yàn)采用呼吸法對(duì)檢測(cè)兩個(gè)污水處理廠進(jìn)水中硝化菌的氨氧化速率和亞硝酸鹽氧化速率進(jìn)行測(cè)定.

　　圖 4和圖 5分別為進(jìn)水中硝化菌在加入氨氮和曝氣后，氨氧化速率、 亞硝酸鹽氧化速率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，從中可以看出，與常規(guī)活性污泥硝化性能測(cè)定不同的是，原污水中硝化菌在曝氣初期活性較低，氨氧化菌活性在曝氣2~12 h后，亞硝酸氧化菌活性在曝氣6~16 h后，活性基本恢復(fù)至最大值. 亞硝酸鹽氧化菌活性恢復(fù)所需要的時(shí)間比氨氧化菌活性恢復(fù)所需要的時(shí)間長(zhǎng). 調(diào)查期間二污進(jìn)水中平均最大氨氧化速率為(0.32±0.12) mg·(L·h)-1，平均最大亞硝酸鹽氧化速率為(0.71±0.18) mg·(L·h)-1; 三污進(jìn)水中平均最大氨氧化速率為(0.43±0.17) mg·(L·h)-1，平均最大亞硝酸鹽氧化速率為(0.58±0.27) mg·(L·h)-1. 因此，可以判斷出，城市污水中的氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌具有硝化活性，在建立活性污泥模型及污水廠設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮城市污水中硝化菌對(duì)活性污泥系統(tǒng)的影響，但也應(yīng)當(dāng)充分考慮進(jìn)水中硝化菌所需要的適應(yīng)時(shí)間.

2.3 城市污水中硝化菌對(duì)活性污泥系統(tǒng)的影響

　　調(diào)查結(jié)果表明，城市污水中含有活性硝化菌，這部分硝化菌將對(duì)活性污泥系統(tǒng)進(jìn)行自然連續(xù)接種(natural continuous seeding). 為了衡量城市污水中硝化菌對(duì)活性污泥系統(tǒng)的影響，定義每天由城市污水帶入的硝化菌數(shù)量與活性系統(tǒng)中原有硝化菌數(shù)量的比值為原污水中硝化菌對(duì)活性污泥的連續(xù)接種強(qiáng)度，可以根據(jù)公式(1)計(jì)算:

　　式中，qseed為硝化菌連續(xù)接種強(qiáng)度，g·(g·d)-1; Qin為城市污水處理廠的日進(jìn)水量，L·d-1; Xin,nitrifiers為城市污水中硝化菌濃度，mg·L-1; V為城市污水處理廠生物反應(yīng)池的容積，L; Xnitrifiers為活性污泥中硝化菌濃度，mg·L-1.

　　表 2為調(diào)查期間二污與三污進(jìn)水與活性污泥的硝化活性平均值，以及根據(jù)公式(1)所計(jì)算的添加強(qiáng)度.

　　由表 2可以看出，城市污水每天給活性污泥系統(tǒng)帶入了大量的具有硝化活性的硝化菌，氨氧化菌連續(xù)接種強(qiáng)度在0.08~0.09 g·(g·d)-1，亞硝酸鹽氧化菌連續(xù)接種強(qiáng)度在0.11~0.24 g·(g·d)-1. 低于Jauffur等所計(jì)算加拿大LaPraire污水處理廠0.3g·(g·d)-1的接種強(qiáng)度，該廠的進(jìn)水流量為65 000 t·d-1，HRT為15 h，SRT為7 d，二級(jí)處理工藝采用傳統(tǒng)活性污泥法. LaPraire污水處理廠的溫度與污泥齡低于本研究所調(diào)查的污水處理廠，而接種強(qiáng)度會(huì)受進(jìn)水中硝化菌濃度與活性污泥硝化菌濃度的影響，溫度越低，污泥齡越短，活性污泥中硝化菌的含量就會(huì)大幅降低，而進(jìn)水中硝化菌的接種效應(yīng)就會(huì)越明顯.

　　但這些結(jié)論與Lee等調(diào)查發(fā)現(xiàn)的進(jìn)水與活性污泥中的微生物僅有4.3%~9.3%的OTUs一致，并得出進(jìn)水中微生物對(duì)活性污泥系統(tǒng)的影響較小這一觀點(diǎn)相矛盾. 引起這一矛盾的原因可能是因?yàn)? 硝化菌生長(zhǎng)緩慢，活性污泥系統(tǒng)中硝化菌自身增殖的數(shù)量少，由城市污水帶入的硝化菌對(duì)活性污泥系統(tǒng)的影響較大，因此二者硝化菌種群結(jié)構(gòu)接近. 而異養(yǎng)菌則相反，它在活性污泥系統(tǒng)中增殖的數(shù)量遠(yuǎn)大于城市污水帶入的異養(yǎng)菌數(shù)量，因此異養(yǎng)菌的種群結(jié)構(gòu)更容易受活性污泥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與運(yùn)行條件的影響. 由于活性污泥中硝化菌的份額較小，Lee等的調(diào)查結(jié)果主要是針對(duì)異養(yǎng)菌.

　　Larsen等在2008年的研究結(jié)果中表明硝化菌尤其是亞硝酸鹽氧化菌比活性污泥中一般的細(xì)菌更容易形成密實(shí)和牢固的小菌落，從圖 1城市污水樣品的熒光原位雜交照片中也可以觀察到這個(gè)現(xiàn)象. 根據(jù)這一特性，如果污水處理工藝中包含初沉池時(shí)，進(jìn)水中的大部分硝化菌將進(jìn)入初沉污泥. 因此，在活性污泥模型及污水處理廠的設(shè)計(jì)尤其是初沉池的設(shè)計(jì)中有必要考慮由城市污水自身帶入的硝化菌對(duì)污水處理廠運(yùn)行的影響.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

3 結(jié)論

　　(1) 西安市第二、 第三污水處理廠進(jìn)水中硝化菌占總細(xì)菌數(shù)的平均個(gè)數(shù)百分比[(AOB+NOB)/EUBmix]分別為(5.35±2.1)%和(6.0±2.8)%，進(jìn)水中氨氧化菌(AOB)優(yōu)勢(shì)菌為Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage; 亞硝酸鹽氧化菌(NOB)的優(yōu)勢(shì)菌均為Nitrospira，次優(yōu)勢(shì)菌為Nitrobacter，且與Nitrococcus、 Nitrospina并存.

　　(2) 城市污水中硝化菌具有硝化活性，在曝氣2~16 h后，活性基本恢復(fù)，最大氨氧化速率分別為(0.32±0.12) mg·(L·h)-1和(0.43±0.17)mg·(L·h)-1，亞硝酸鹽氧化速率為(0.71±0.18)mg·(L·h)-1和(0.58±0.27) mg·(L·h)-1.

　　(3) 城市污水中含有活性硝化菌，對(duì)活性污泥系統(tǒng)有連續(xù)自然接種的作用，根據(jù)進(jìn)水及活性污泥中硝化活性估算出城市污水中AOB和NOB對(duì)活性污泥的連續(xù)接種強(qiáng)度分別為0.08~0.09 g·(g·d)-1和0.11~0.24 g·(g·d)-1. 因此，在活性污泥模型建立及污水處理廠設(shè)計(jì)中有必要考慮由城市污水自身帶入的硝化菌對(duì)污水處理廠運(yùn)行的影響.