1 引言

　　酒精是重要的工業(yè)原料，已被廣泛應(yīng)用于生物、化工、食品等各個(gè)領(lǐng)域.全球當(dāng)前又在積極發(fā)展燃料酒精，采用燃料酒精代替石油作為車(chē)用燃料.然而，酒精生產(chǎn)會(huì)伴隨產(chǎn)生大量的高濃度有機(jī)廢水，研究發(fā)現(xiàn)，每生產(chǎn)1 t酒精，要排放13~16 t廢水，廢水中污染物成分有殘?zhí)�、蛋白質(zhì)、纖維素和鹽分等，具有高化學(xué)需氧量(COD)、高生化需氧量(BOD)的特點(diǎn).厭氧消化是治理酒精生產(chǎn)廢水的主要技術(shù)，它既可以高效降解廢水中的有機(jī)物，降低廢水的COD和BOD，又可以生產(chǎn)可再生能源-甲烷.此外，該技術(shù)還具有占地面積小、運(yùn)行費(fèi)用低和污泥產(chǎn)率低等優(yōu)勢(shì).

　　厭氧消化是利用厭氧微生物在無(wú)氧條件下把有機(jī)物轉(zhuǎn)化為甲烷、二氧化碳和少量細(xì)胞等，根據(jù)運(yùn)行溫度，可分為高溫厭氧消化((55±2)℃)和中溫厭氧消化((35±2)℃)兩類(lèi).厭氧消化的高效、穩(wěn)定運(yùn)行依賴(lài)于厭氧活性污泥(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“污泥”)的微生物菌群，微生物菌群的種類(lèi)和分布又主要取決于處理廢水的類(lèi)別和性質(zhì).因此，治理不同廢水的污泥微生物菌群研究受到了學(xué)者們的關(guān)注，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，它對(duì)分析污泥微生物菌群的種類(lèi)和相對(duì)豐度，研究工藝參數(shù)對(duì)種類(lèi)和相對(duì)豐度的影響，考察污泥中微生物的功能，豐富微生物菌群的基礎(chǔ)理論等方面有著重要意義.高通量測(cè)序技術(shù)的種類(lèi)多樣，其中，Illumina MiSeq高通量測(cè)序具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于污泥、食品、土壤、礦山水、海洋水等樣本的微生物菌群分析.

　　我國(guó)是酒精生產(chǎn)大國(guó)，河南天冠集團(tuán)是我國(guó)酒精定點(diǎn)生產(chǎn)企業(yè)，年產(chǎn)酒精98萬(wàn)t，采用二級(jí)厭氧消化技術(shù)治理酒精廢水，日產(chǎn)沼氣50萬(wàn)m3.二級(jí)厭氧消化包括高溫厭氧消化((55±2)℃)和中溫厭氧消化((35±2)℃)兩個(gè)工序，在高溫厭氧消化工序中，反應(yīng)器總體積16萬(wàn)m3，水力停留時(shí)間8 d，廢水的COD由(35000±2000)mg·L-1降低至(4000±200)mg·L-1，BOD由(20000±1000)mg·L-1降低至(1400±140)mg·L-1.在中溫厭氧消化工序中，反應(yīng)器總體積4萬(wàn)m3，水力停留時(shí)間2.5 d，廢水的COD由(3500±200)mg·L-1降低至(2000±150)mg·L-1，BOD由(1200±120)mg·L-1降低至(650±50)mg·L-1.本實(shí)驗(yàn)依托天冠集團(tuán)的生產(chǎn)規(guī)模和技術(shù)平臺(tái)，首次采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序研究酒精廢水治理中污泥(高溫厭氧和中溫厭氧)的微生物菌群，在屬(genus)水平分析污泥中細(xì)菌和古菌的種類(lèi)和相對(duì)豐度，探討不同菌屬的功能，以期為闡釋厭氧消化技術(shù)治理酒精廢水的生物機(jī)制及該技術(shù)的升級(jí)改良提供參考.

　　2 材料與方法

　　2.1 樣品采集

　　厭氧活性污泥取樣于河南天冠集團(tuán).在厭氧反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行的條件下，高溫厭氧活性污泥分別取樣于16個(gè)高溫厭氧反應(yīng)器后混合，中溫厭氧活性污泥分別取樣于10個(gè)中溫厭氧反應(yīng)器后混合，樣品采集后保存于0 ℃冰盒中并快速移至-80 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存.

　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　2.2.1 DNA提取

　　厭氧活性污泥中微生物的DNA按照OMEGA試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法和步驟進(jìn)行提取.

　　2.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

　　擴(kuò)增16S rDNA的V3~V4區(qū)域，細(xì)菌的PCR引物是Miseq測(cè)序平臺(tái)的通用引物是341F: 5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，805R: 5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACT ACHVGGGTATCTAATCC-3′.古菌的PCR引物是349F: 5′-CCCTACACGACGC TCTTCCGATCTN(barcode)GYGCASCAGKCG MGAA W-3′，806R:5′-GACTGGAGTTCCTTGGCA CCCGAG AATTCCAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3′.為了確定測(cè)序的樣品來(lái)源，PCR引物中標(biāo)簽序列的插入位置標(biāo)記為barcode.引物中barcode前面的序列是接頭序列，用于識(shí)別測(cè)序位置，barcode后面的序列是引物序列.通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增并完成接頭序列的連接，PCR產(chǎn)物在Illumina Miseq高通量測(cè)序儀(美國(guó)，Illumina公司)上進(jìn)行測(cè)序.第一輪PCR擴(kuò)增，50 μL反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 5 μL，0.1 mmol·L-1 dNTPs，10 ng DNA，0.5 μmol·L-1 PCR primer F，0.5 μmol·L-1 Primer R，0.05 U Plantium Taq.PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán);94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min.第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系中DNA為20 ng，其他與第一輪擴(kuò)增一致，PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min.第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行回收.利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，依托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序.

　　2.3 數(shù)據(jù)分析

　　測(cè)序獲取原始序列，將雙末端序列融合為一個(gè)方向的序列并進(jìn)行質(zhì)量控制，步驟如下：(1) 序列融合，采用Flash軟件(版本1.2.3)融合雙末端序列，通過(guò)各樣品的barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對(duì)各樣品序列做質(zhì)量控制(QC).(2) QC分為4個(gè)步驟：①采用Prinseq(版本V0.20.4)軟件對(duì)序列閱讀框的3′端進(jìn)行質(zhì)控，截掉Q值低于20的數(shù)據(jù)，提高后續(xù)序列融合比率;②通過(guò)Flash軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列;③采用Prinseq軟件去除各樣品的引物序列、低于200 bp的序列、低復(fù)雜度序列和低質(zhì)量序列;④去除非靶區(qū)域序列及嵌合體.首先采用軟件Mothur(版本1.30.1)的Pre.cluster模塊校正測(cè)序錯(cuò)誤，校正過(guò)程當(dāng)中允許的最大錯(cuò)配為1/150.其次，采用軟件Mothur(版本1.30.1)內(nèi)的Uchime功能模塊，以Silva數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列作為模板，去除嵌合體及非靶區(qū)域序列.

　　3 結(jié)果與討論

　　測(cè)定序列經(jīng)質(zhì)量控制后，根據(jù)差異水平在0.03(即相似度97%)的水平上聚類(lèi)得到操作分類(lèi)單元(OTU).實(shí)驗(yàn)獲得高溫厭氧活性污泥中細(xì)菌和古菌的有效序列數(shù)量分別為20523和33190，聚類(lèi)得到OTU數(shù)目分別為1729和122，中溫厭氧活性污泥中細(xì)菌和古菌的序列數(shù)量分別為11766和13803，聚類(lèi)得到OTU數(shù)目分別為1701和156.在序列聚類(lèi)分析的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)在屬(genus)水平上對(duì)厭氧活性污泥的細(xì)菌和古菌進(jìn)行分類(lèi)，統(tǒng)計(jì)它們的相對(duì)豐度.由于污泥中細(xì)菌和古菌的種類(lèi)繁多，根據(jù)相對(duì)豐度將污泥中細(xì)菌分為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(相對(duì)豐度≥1.0%)和稀有細(xì)菌(相對(duì)豐度<1.0%)，古菌分為優(yōu)勢(shì)古菌(相對(duì)豐度≥1.0%)和稀有古菌(相對(duì)豐度<1.0%)，且將稀有細(xì)菌和稀有古菌分別歸類(lèi)于其他.

　　3.1 高溫厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌

　　高溫厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有10個(gè)，包括有Coprothermobacter、Longilinea、Thermodesulfovibrio和Levilinea等，它們的相對(duì)豐度如圖 1所示.參考已有研究報(bào)道分析它們的功能，結(jié)果如表 1所示.由表 1可以歸納出高溫厭氧活性污泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的主要功能包括4個(gè)方面，分別是分解蛋白質(zhì)、代謝多種碳水化合物生成有機(jī)酸、乙酸氧化、硫酸鹽還原.此外，在細(xì)菌的測(cè)序分析中發(fā)現(xiàn)了古菌Methanosaeta，它是生態(tài)環(huán)境中甲烷的主要生產(chǎn)者.細(xì)菌和古菌雖然不是同一個(gè)域，但它們的16S rDNA基因序列有較高的同源性(劉馳等，2015)，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的過(guò)程中，通用引物可能結(jié)合到古菌Methanosaeta的16S rDNA基因并將其擴(kuò)增.古菌域中只有Methanosaeta出現(xiàn)在細(xì)菌的測(cè)序分析中，表明高溫厭氧活性污泥中Methanosaeta的相對(duì)豐度高，這與下文關(guān)于高溫厭氧活性污泥中優(yōu)勢(shì)古菌的分析結(jié)果一致.

　　表 1 高溫厭氧活性污泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的功能

　　圖 1高溫厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌名稱(chēng)及相對(duì)豐度

　　3.2 中溫厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌

　　中溫厭氧活性污泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有21個(gè)，包括有Acinetobacter、Succinibibrio、Meniscus和Longilinea等， 它們的相對(duì)豐度如圖 2所示.比較圖 1和圖 2可以看出，中溫厭氧活性污泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的種類(lèi)多而相對(duì)豐度小.中溫厭氧活性污泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的功能如表 2所示，由表 2可以歸納出它們的主要功能包括3個(gè)方面，分別是代謝多種碳水化合物生成有機(jī)酸、脂肪酸和有機(jī)酸氧化、分解結(jié)構(gòu)頑固化合物，如纖維素、酚類(lèi)化合物、腐胺等.

　　圖 2中溫厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌名稱(chēng)及相對(duì)豐度

　　3.3 厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)古菌

　　高溫厭氧活性污泥和中溫厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)古菌及其相對(duì)豐度如圖 3所示.可以看出，污泥的古菌種類(lèi)較少，主要是產(chǎn)甲烷古菌，它們是一類(lèi)能夠以乙酸、H2/CO2、甲基化合物等為原料生成甲烷的原核微生物.高溫厭氧活性污泥中主要產(chǎn)甲烷古菌是Methanosaeta、Methanobacterium和Methanothermbacter，它們的相對(duì)豐度分別為57.72%、28.35%和9.90%.中溫厭氧活性污泥中主要產(chǎn)甲烷古菌是Methanobacterium、Methanosarcina、Methanosaeta和Methanosphaera，它們的相對(duì)豐度分別為33.21%、23.70%、16.63%和11.77%.實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步歸納比較厭氧活性污泥中優(yōu)勢(shì)古菌的分布、分類(lèi)單元(目)和主要代謝底物，結(jié)果如表 3所示.可以看出，中溫厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)古菌種類(lèi)多于高溫厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)古菌種類(lèi)，且高溫厭氧活性污泥和中溫厭氧活性污泥有相同的產(chǎn)甲烷古菌，它們分別是Methanosaeta、Methanosarcina、Methanobacterium和Methanosphaera.產(chǎn)甲烷古菌可分為5個(gè)目，分別為甲烷桿菌目、甲烷球菌目、甲烷八疊球菌目、甲烷火菌目和甲烷微菌目，而污泥中產(chǎn)甲烷古菌主要分布于2個(gè)目，分別是甲烷八疊球菌目和甲烷桿菌目.

　　圖 3高溫(a)和中溫(b)厭氧活性污泥的優(yōu)勢(shì)古菌名稱(chēng)及相對(duì)豐度

　　3.4 厭氧消化技術(shù)治理酒精生產(chǎn)廢水

　　酒精生產(chǎn)廢水的污染物成分有殘?zhí)恰⒌鞍踪|(zhì)、纖維素和鹽分等，厭氧消化技術(shù)可以高效降解廢水中的有機(jī)物，降低廢水的COD和BOD，還可以生產(chǎn)甲烷，具有環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益.厭氧消化涉及到眾多微生物，各微生物通過(guò)直接或間接的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系，組成了復(fù)雜的互營(yíng)共生的微生物菌群，消化過(guò)程通常分為4個(gè)階段：①水解階段，細(xì)菌將復(fù)雜的有機(jī)物分解為簡(jiǎn)單的可溶性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)被分解為短肽、氨基酸等;②產(chǎn)酸發(fā)酵階段，細(xì)菌將可溶性物質(zhì)等轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸、脂肪酸和醇類(lèi)等，產(chǎn)物主要有甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、H2和CO2等;③產(chǎn)乙酸階段，是指將產(chǎn)酸發(fā)酵階段中二碳以上機(jī)酸、脂肪酸和醇類(lèi)轉(zhuǎn)化為乙酸、H2和CO2的過(guò)程;④產(chǎn)甲烷階段，產(chǎn)甲烷菌以乙酸、H2和CO2為底物生產(chǎn)甲烷，其它甲基化合物如甲酸、甲醇等也可以被轉(zhuǎn)化為甲烷.

　　根據(jù)研究結(jié)果(表 1~3)，Illumina MiSeq高通量測(cè)序分析得到厭氧活性污泥中細(xì)菌的主要功能是分解蛋白質(zhì)，代謝碳水化合物生成有機(jī)酸，降解結(jié)構(gòu)頑固化合物，氧化有機(jī)酸和脂肪酸生成H2和CO2等.厭氧活性污泥中古菌主要是產(chǎn)甲烷古菌，它們能夠利用乙酸、H2和CO2等底物生成甲烷.污泥中細(xì)菌和古菌的代謝功能與酒精生產(chǎn)廢水的污染物成分有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明Illumina MiSeq高通量測(cè)序有效，充分地展示了酒精廢水治理中厭氧活性污泥的微生物菌群.此外，在厭氧活性污泥的菌群分析中，發(fā)現(xiàn)了硫酸鹽還原菌Thermogymnomonas(相對(duì)豐度5.67%)、Thermodesulfovibrio(相對(duì)豐度4.87%)和Thermodesulfobium(相對(duì)豐度1.17%).這是由于酒精生產(chǎn)的淀粉質(zhì)原料(木薯、玉米等)經(jīng)過(guò)蒸煮糖化得到糖化醪，醪液需利用濃硫酸調(diào)節(jié)至pH 4.0~5.0范圍后用于發(fā)酵生產(chǎn)酒精，導(dǎo)致酒精生產(chǎn)廢水含有一定量的硫酸鹽.厭氧活性污泥在治理酒精廢水過(guò)程中長(zhǎng)期馴化，使得硫酸鹽還原菌成為優(yōu)勢(shì)菌.酒精企業(yè)多采用二級(jí)厭氧消化技術(shù)治理生產(chǎn)廢水，有高溫厭氧消化和中溫厭氧消化兩個(gè)工序.兩個(gè)工序的作用都是降解有機(jī)物生產(chǎn)甲烷，但特點(diǎn)不同.高溫厭氧消化的有機(jī)負(fù)荷高，微生物代謝速率快，但一些結(jié)構(gòu)頑固的化合物未被有效降解，高溫厭氧消化的出水COD較高.在高溫厭氧消化后繼續(xù)進(jìn)行中溫厭氧消化，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化分解有機(jī)物，降低出水COD.實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，高溫厭氧活性污泥和中溫厭氧活性污泥中多種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(Longilinea、Bellilinea和Levilinea)和優(yōu)勢(shì)古菌(Methanosaeta、Methanosarcina、Methanobacterium和Methanosphaera)是相同的，但污泥的細(xì)菌差異程度高于古菌差異程度，中溫厭氧活性污泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的種類(lèi)多，相對(duì)豐度小，且有多種能夠代謝結(jié)構(gòu)頑固化合物(Clostridium III、Serratia和Anaerovorax)的細(xì)菌.可以看出，在厭氧消化技術(shù)治理酒精廢水的過(guò)程中，高溫厭氧消化和中溫厭氧消化的相同作用使得污泥中有部分相同的細(xì)菌和古菌，它們的不同特點(diǎn)主要取決于污泥中細(xì)菌的種類(lèi)和相對(duì)豐度.

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　　表 3 厭氧活性污泥中優(yōu)勢(shì)古菌的分布、分類(lèi)單位和主要代謝底物

　　4 結(jié)論

　　實(shí)驗(yàn)基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序研究酒精廢水治理中厭氧活性污泥的微生物菌群.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫厭氧活性污泥(TAS)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有Coprothermobacter、Longilinea、Levilinea等，它們的主要功能是分解蛋白質(zhì)、代謝碳水化合物生成有機(jī)酸、乙酸氧化、硫酸鹽還原.中溫厭氧活性污泥(MAS)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有Acinetobacter、Succinibibrio、Meniscus等，它們的主要功能是代謝碳水化合物生成有機(jī)酸、脂肪酸和有機(jī)酸氧化、代謝結(jié)構(gòu)頑固化合物.TAS和MAS的古菌主要是產(chǎn)甲烷古菌，分布于甲烷八疊球菌目和甲烷桿菌目.TAS中產(chǎn)甲烷古菌主要有Methanosaeta(相對(duì)豐度57.72%)、Methanobacterium(相對(duì)豐度28.35%)和Methanothermbacter(相對(duì)豐度9.90%).MAS中產(chǎn)甲烷古菌主要有Methanobacterium(相對(duì)豐度33.21%)、Methanosarcina(相對(duì)豐度23.70%)、Methanosaeta(豐度16.63%)和Methanosphaera(相對(duì)豐度11.77%).高通量測(cè)序充分展示了酒精廢水治理中厭氧活性污泥的微生物菌群，可為闡釋厭氧消化技術(shù)的生物機(jī)制和升級(jí)改良該技術(shù)提供參考.