焦化廢水是煤在高溫干餾過程中以及煤氣凈化、 化學(xué)產(chǎn)品精制過程中產(chǎn)生的高濃度、 難降解有機(jī)工業(yè)廢水，酚類是其主要有機(jī)組分，其他的有機(jī)物包括多環(huán)芳烴和一些含有氮、 氧和硫的雜環(huán)化合物，無機(jī)組分則包括氰化物、 硫氰化物(SCN-)和氨氮等[1, 2]. 酚類、 硫氰化物和氰化物是焦化廢水中COD 的3 大主要來源，SCN-在焦化廢水中的濃度為200~1000 mg·L-1，是僅次于酚類的第2 大COD來源; 由于SCN-的毒性相對較低，其在焦化廢水處理過程中受到的重視程度遠(yuǎn)不如揮發(fā)酚和氰化物等污染物[3, 4]. SCN-是苯酚和氨生物降解的抑制劑[5, 6]，對硝化過程有抑制作用[4]. 同時(shí)，SCN-的轉(zhuǎn)化需要大量的氧化劑或溶解氧，且可能生成CN-中間產(chǎn)物[7]，因此，SCN-不僅對焦化廢水的主要控制指標(biāo)COD、 色度及NH4+-N等有直接或間接作用，還會使廢水毒性增高. 因此，焦化廢水中的SCN-必須徹底有效去除，以消除廢水對生態(tài)環(huán)境帶來的潛在威脅和危害.

　　焦化廢水的處理過程主要包括脫酚、 蒸氨、 脫氰、 除油、 生化處理、 混凝沉淀和后續(xù)高級氧化等. 其中生化處理是焦化廢水處理的主體和核心，如缺氧-好氧、 厭氧-缺氧-好氧和序批式活性污泥法等[8]. 污泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在廢水的生物處理過程中起著至關(guān)重要的作用，決定廢水中污染物的去除效率[9, 10]. Zhu等[11]利用454高通量測序研究了焦化廢水厭氧/缺氧/沸石生物濾池-膜生物反應(yīng)器中微生物的群落結(jié)構(gòu)組成和動態(tài)變化，結(jié)果表明沸石材料可以改變微生物菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了一些新類群的出現(xiàn)，使氨氧化菌和亞硝化細(xì)菌逐漸成為優(yōu)勢菌. 曹軍偉等[12]通過 PCR 和 16S r DNA 序列分析技術(shù)，在焦化活性污泥中鑒定了20個(gè)屬的28種酚類化合物降解菌. 喬琳等[13]通過末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP) 分析手段，探討了固定化生物強(qiáng)化與對照反應(yīng)器中微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，表明在吡啶初始濃度為 782.4~2934 mg·L-1時(shí)，投加的菌株P(guān)aracoccus sp.KT-5可以作為優(yōu)勢菌始終存在于反應(yīng)器中. Huddy等[14]利用基因克隆文庫分析表明Thiobacillus 是ASTERTM生物處理系統(tǒng)中SCN-降解的優(yōu)勢菌. Ryu等[15]利用高通量解析了SCN-降解過程中的藻類和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)Thiobacillus 細(xì)菌和Micractinium 藻類為優(yōu)勢生物. 焦化廢水處理系統(tǒng)功能的穩(wěn)定性主要依靠優(yōu)勢微生物的活性和多樣化的群落結(jié)構(gòu)間的相互關(guān)系[16]，SCN-是焦化廢水中COD的主要來源之一，其好氧段生物去除效果影響廢水的達(dá)標(biāo)排放，而降解SCN-的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)依然處于“黑匣子狀態(tài)”. 對焦化廢水活性污泥中降解SCN-的微生物進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究，有助于探討焦化廢水處理的工藝改進(jìn)、 動態(tài)監(jiān)控和優(yōu)化控制.

　　本研究利用KSCN為唯一碳源和能源，采用逐步提高其濃度的方法富集焦化廢水活性污泥中的SCN-降解菌群，并利用454測序分析其細(xì)菌多樣性以及在不同SCN-濃度條件下群落結(jié)構(gòu)的演替變化，以期為焦化廢水處理工藝的穩(wěn)定運(yùn)行提供理論基礎(chǔ).

　　1 材料與方法

　　1.1 主要試劑和材料

　　生工Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒，KSCN(分析純); 接種污泥采集自鞍山某焦化廠好氧池.

　　1.2 污泥的馴化培養(yǎng)

　　取適量經(jīng)沉淀濃縮的新鮮活性污泥于有機(jī)玻璃反應(yīng)器中，加入用自來水配置的濃度為100 mg·L-1的KSCN水溶液，使其污泥濃度為3~5 mg·L-1，在溫度為31℃條件下充分曝氣(DO 4.0~7.0 mg·L-1)，定時(shí)取樣檢測活性污泥降解SCN-的能力，同時(shí)設(shè)置未加污泥的污水做對照組. 活性污泥可以在24 h內(nèi)可完全降解100 mg·L-1的SCN-，靜置1 h后去除上清液，加入新鮮的100 mg·L-1的KSCN水溶液在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h(1號樣品)，去除上清液后加入濃度為300 mg·L-1的KSCN水溶液，培養(yǎng)2 d(一個(gè)周期)更換新的KSCN水溶液，8個(gè)周期后(2號樣品)加入濃度為600 mg·L-1 的KSCN水溶液繼續(xù)馴化培養(yǎng)，6個(gè)周期后結(jié)束培養(yǎng)(3號樣品).

　　1.3 活性污泥對SCN-濃度的生物降解

　　分別取適量經(jīng)沉淀濃縮的新鮮活性污泥和100~600 mg·L-1 KSCN馴化富集的活性污泥于有機(jī)玻璃反應(yīng)器中，加入用自來水配置的濃度分別為100、 300、 600 mg·L-1的KSCN水溶液，使其污泥濃度為3~5 mg·L-1，在溫度為31℃條件下充分曝氣定時(shí)取樣，檢測活性污泥對SCN-的降解能力. SCN-的測定方法參照文獻(xiàn)[17].

　　1.4 細(xì)菌多樣性分析

　　1.4.1 污泥樣品預(yù)處理

　　將不同周期培養(yǎng)后的活性污泥樣品置于1、 2和3離心管中離心棄上清，用已滅菌的生理鹽水洗滌 2~3次，用于后續(xù)污泥細(xì)菌總DNA的提取、 PCR和測序分析.

　　1.4.2 污泥細(xì)菌總DNA 提取、 PCR和16S rDNA測序

　　污泥細(xì)菌總DNA 提取、 PCR和16S rDNA測序由上海生工公司完成. 細(xì)菌總DNA 提取按照生工Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行. PCR擴(kuò)增引物： 341F CCTACGGGNGGCWGCAG 和805R GACTACHVGGGTATCTAATCC[18]，擴(kuò)增區(qū)域V3-V4. 反應(yīng)條件94℃ 30 s; 94℃ 20 s，45℃ 20 s，65℃ 60 s，5個(gè)循環(huán); 94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，20個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min，10℃. 50 μL反應(yīng)體系，50 μL PCR反應(yīng)體系及10×PCR buffer 5 μL，dNTP (10 mmol·L-1) 0.5 μL，Genomic DNA10 ng，引物F(50 μmol·L-1) 1 μL，引物R (50 μmol·L-1) 1 μL，Plantium Taq (5 U·μL-1) 0.5 μL，水42 μL. 各樣品PCR 擴(kuò)增后，利用Roche 454 GSFLX+測序儀上機(jī)測序.

　　1.4.3 序列數(shù)據(jù)處理

　　原始序列數(shù)據(jù)通過質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列之后序列長度大部分分布在400~600 bp之間，平均長度均在440 bp以上，各樣本序列數(shù)均在500 bp以上. 物種分類采用RDP classifier軟件. 按照相似度為97%的標(biāo)準(zhǔn)將操作分類單位(operational taxonomic units OTU)進(jìn)行分類[16],運(yùn)行軟件mothur(http：//www.mothur.org/)中的summary.single 命令，計(jì)算常用的生物多樣性指數(shù)，如豐富度指數(shù)(Chao/ACE指數(shù))、 覆蓋率指數(shù)(good's coverage)和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)).

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 活性污泥對SCN-的生物降解

　　硫氰化物是焦化原水中含量最高的無機(jī)污染物之一[4]，而在曝氣池中SCN-的濃度約100mg·L-1. SCN-的組成元素 S、 C和N 是生物生長所需的營養(yǎng)元素，在好氧條件下微生物可以SCN-作為其碳源、 氮源或硫源進(jìn)行生長,并形成SO42-、 CO2和NH4+代謝產(chǎn)物[15]. 結(jié)果表明(如圖 1)，原始污泥和馴化污泥對SCN-的降解速率隨著SCN-初始濃度的升高而增大，馴化污泥的降解能力大于原始污泥，初始SCN-濃度為600 mg·L-1時(shí)，原始污泥的降解速率為14.255 mg·(g·h)-1，而馴化污泥的降解速率為15.978 mg·(g·h)-1，表明污泥馴化有利于SCN-降解菌群的富集和降解能力的提高. 解析不同SCN-濃度下馴化污泥的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)有助于揭示污泥的降解機(jī)制和降解效率.

　　圖 1 活性污泥中SCN-的的降解速率

　　2.2 活性污泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

　　為了分析降解SCN-的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富度，在97%相似水平上計(jì)算了常見的多樣性指數(shù). 污泥細(xì)菌多樣性指數(shù)如表 1所示，覆蓋率指數(shù)是樣品的測序深度也表明樣品的覆蓋率，3個(gè)樣品的覆蓋率分別是0.97、 0.98和0.98，表明絕大部分的細(xì)菌種群都被檢測出來. 隨SCN-馴化濃度的升高，活性污泥中的細(xì)菌多樣指數(shù)隨之減少，如100 mg·L-1 SCN-的活性污泥經(jīng)過300 mg·L-1和600 mg·L-1的SCN-培養(yǎng)馴化后，生物分類單元(OTUs)從949分別降為749和702，香農(nóng)指數(shù)也從4.42分別減為3.49和3.28，這表明細(xì)菌多樣性及結(jié)構(gòu)在不同濃度SCN-的培養(yǎng)下發(fā)生了改變，高濃度的SCN-對群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生脅迫壓力，使其生物多樣性減少. 圖 2同樣顯示不同SCN-濃度對生物群落結(jié)構(gòu)的影響，圖 2(a)生物群落豐富度稀疏曲線顯示600 mg·L-1 SCN-的OTUs最少，100 mg·L-1 SCN-的OTUs最多，說明SCN-濃度越大，細(xì)菌多樣性越少. 相似的結(jié)果也通過聚類分析圖 2(b)得以闡明，聚類熱圖采用樣本間unifrac 距離矩陣?yán)L制，顏色塊代表距離值，顏色越紅表示樣本間距離越近，相似度越高，越藍(lán)則距離越遠(yuǎn); 100 mg·L-1和300mg·L-1 SCN-培養(yǎng)過的生物群落聚類在一起，且距離較近，說明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)經(jīng)演替變化可以適應(yīng)不同的SCN-濃度環(huán)境，SCN-濃度越高對生物群落的脅迫壓力越大，細(xì)菌種群差異越大.

　　表 1 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

　　圖 2 細(xì)菌群落豐富度稀疏曲線和聚類分析

　　不同濃度的SCN-對活性污泥生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響不同，污泥生物群落維恩圖(圖 3)表明3個(gè)污泥樣品共享部分OTUs占整個(gè)OTUs的13%，這部分微生物群落結(jié)構(gòu)受SCN-濃度的波動干擾小，推測其對硫氰化的耐受性高，其中部分細(xì)菌菌群可能是SCN-降解菌群，可以SCN-為唯一碳源、 硫源和能源; 另一部分菌群可能與污泥的穩(wěn)定性有關(guān). 此外，圖 3表明300mg·L-1和600 mg·L-1 SCN-培養(yǎng)的污泥共享的OTUs為106，300 mg·L-1 SCN-和原始污泥共享的OTUs為104，而600 mg·L-1SCN-和原始污泥共享的OTUs為51，同樣說明高濃度SCN-馴化污泥與原始污泥的細(xì)菌群落多樣性相差較大.

　　圖 3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)維恩圖

　　2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和豐度

　　為了解析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和豐度，對質(zhì)控后的序列采用RDP classifier軟件進(jìn)行物種分類，圖 4、 表 2和圖 5分別為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門、 目和屬水平上的組成和豐度. 污泥的優(yōu)勢門(圖 4)主要有Proteobacteria、 Bacteroidetes、 Chlorobi、 Planctomycetes、 Acidobacteria、 Nitrospira、 Firmicutes、 未分類的和微小菌群，與Ma等[16]的研究結(jié)果基本一致. Proteobacteria在焦化廢水中占主導(dǎo)地位[11]，其在3個(gè)污泥樣品中的豐度也最高，分別為47.47%、 50.28%和38.65%. Bacteroidetes為第二優(yōu)勢門，豐度分別為36.78%、 31.57%和46.11%，Acidobacteria在3個(gè)污泥樣品中的豐度分別為2.62%、 7.33%和7.99%. Bacteroidetes 和 Actinobacteria為好氧污泥中的優(yōu)勢門，Mclellan等[19]發(fā)現(xiàn)二者也為污水處理廠進(jìn)水中的優(yōu)勢細(xì)菌. Chlorobi的豐度分別為0.21%、 1.65%和3.19%. Firmicutes在3個(gè)污泥樣品中的豐度分別為4.04%、 0.35%和0.25%，而在厭氧污泥中的豐度高達(dá)92.3%[20]. Nitrospira為亞硝化細(xì)菌，在3個(gè)活性污泥中的豐度低于1%. 各種分子指紋圖譜的方法已被開發(fā)用于評估微生物群落結(jié)構(gòu)，而高通量測序可以檢測更多未知和低豐度的序列[21]. 雖然90%以上的細(xì)菌門類在3個(gè)污泥樣品中被鑒定，然而無法分類或者未知的門類在3個(gè)污泥樣品中的豐度分別為6.54%、 7.69%和2.79%.

　　圖 4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門水平上的組成

　　表 2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)目水平上的組成

　　圖 5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)屬水平上的分布

　　目水平上分類表 2(每種目的豐度至少在一個(gè)樣品中不小于1%)表明： 3個(gè)污泥樣品的優(yōu)勢目均為Burkholderiales、 Sphingobacteriales 和Xanthomonadales. Sphingobacteriales 在3個(gè)污泥樣品中的豐度分別為32.85%、 29.5%和45.08%，Xanthomonadales的豐度分別為3.8%、 18.5%和14.48%，而Burkholderiales的豐度分別為13.3%、 8.95%和11.92%. Burkholderiales可以降解烴類物質(zhì)，是芳烴污染的地表水中的優(yōu)勢目[22]，可降解焦化廢水中的苯酚和PAHs(芘)[23, 24]. Rhodospirillales、 Sphingomonadales、 Clostridiales、 Parvularculales、 Rhodobacterales和Myxococcales等是3個(gè)污泥樣品所共享的目，雖然各自的豐度不同，但表明其對不同SCN-濃度脅迫下有一定的適應(yīng)性，也說明群落結(jié)構(gòu)可通過自身的調(diào)整以適應(yīng)不同的SCN-濃度環(huán)境.

　　細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的組成和豐度(每種屬的豐度至少在一個(gè)樣品中不小于1%)表明(圖 5)： 3個(gè)污泥主要的屬為20個(gè)，不同屬在不同污泥樣品中的豐度不同，有些菌的豐度會隨SCN-濃度的升高而提高，有些菌株的豐度會隨SCN-濃度的升高而降低，結(jié)果類似于門和目分類得到的結(jié)論，進(jìn)一步說明細(xì)菌種群對不同SCN-濃度脅迫下有一定的適應(yīng)性，群落結(jié)構(gòu)可以通過自身的組成變化適應(yīng)不同的SCN-濃度環(huán)境. Flavisolibacter、 Ferruginibacter、 Caldimonas、 Steroidobacter、 Thiobacillus和Gp4，為100 mg·L-1 SCN-培養(yǎng)的污泥樣品中主要的屬，F(xiàn)lavisolibacter、 Thermomonas、 Thiobacillus、 Gp4、 Steroidobacter和Comamonas，為300 mg·L-1 SCN-培養(yǎng)的污泥樣品中主要的屬，而600 mg·L-1 SCN-培養(yǎng)的污泥樣品中主要的屬為Flavisolibacter、 Thermomonas、 Gp4、 Thiomonas、 Sphingopyxis和Ignavibacterium. Flavisolibacter可能參與聚羥基脂肪酸酯的合成[25]，而Thermomonas在50℃生長的能力有助于細(xì)菌細(xì)胞壁組分的修飾，如蛋白質(zhì)和(糖)脂質(zhì)的化學(xué)修飾[26]，自養(yǎng)微生物Thiobacillus 和Thiomonas可利用H2S作為能源生長[27]. 焦化廢水中分離出Thiobacillus 和Acremonium菌株能以SCN-為唯一碳源和能源生長[28, 29]，本研究未發(fā)現(xiàn)Acremonium的存在. Thiobacillus普遍存在于含SCN-的廢水處理系統(tǒng)中，可有效降解SCN- [11]，Thiobacillus為100 mg·L-1和300 mg·L-1 SCN-培養(yǎng)的污泥樣品中的優(yōu)勢菌，豐度分別為3.07%和8.63%，而在600 mg·L-1 SCN-培養(yǎng)的污泥樣品中的豐度僅為0.27%，表明在SCN-濃度<300 mg·L-1時(shí)Thiobacillus可能是SCN-主要的降解菌，然而SCN-濃度>300 mg·L-1時(shí)，可能有其他菌群參與SCN-的降解，如Arthrobacter、 Bacillus、 Escherichia、 Klebsiella、 Methylobacterium、 Ralstonia和Pseudomonas為SCN-降解菌[30]，除Escherichia和Methylobacterium外，這些SCN-降解菌在本實(shí)驗(yàn)中均已經(jīng)檢測出來，然而其豐度很低，推測這些低豐度的SCN-降解菌可能在高濃度SCN-下發(fā)揮協(xié)同降解作用. 另外，不同的細(xì)菌具有不同的污染物降解功能，同一種細(xì)菌也可具有降解多種不同污染物的功能，如Comamonas菌可降解酚類、 PAHs和雜環(huán)類物質(zhì)(如吲哚、 喹啉)等[16]; Thiobacillus不僅能降解SCN-，還具有很強(qiáng)的反硝化能力[31]; Pseudomonas可降解SCN-、 酚類化合物、 苯、 甲苯和PAHs等，同時(shí)具有硝化和反硝化的能力[32~35]. 污泥是一個(gè)復(fù)雜的微生物群體，焦化廢水中SCN-的降解可能是多種菌群共同作用的結(jié)果，菌群間復(fù)雜的相互作用關(guān)系還有待進(jìn)一步研究.具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3 結(jié)論

　　(1) 活性污泥經(jīng)300~600 mg·L-1 SCN-的馴化后，其SCN-的降解能力提高，細(xì)菌多樣性隨SCN-濃度升高降低.

　　(2) 活性污泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成中的優(yōu)勢門為Proteobacteria和Bacteroidetes，優(yōu)勢目為Burkholderiales、 Sphingobacteriales 和Xanthomonadales，F(xiàn)lavisolibacter是系統(tǒng)中含量最高的屬，Thiobacillus是<300 mg·L-1 SCN-焦化廢水中主要的SCN-降解菌，在600 mg·L-1SCN-高濃度時(shí)低豐度的SCN-降解菌群可能發(fā)揮協(xié)同降解作用.