潛流濕地是一種人工構(gòu)建的高效污水凈化濕地，它利用物理、 化學(xué)、 生物三重協(xié)同作用處理污水，具有顯著的環(huán)境、 生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益[1, 2]. 目前，已廣泛應(yīng)用于生活污水、 垃圾滲濾液、 養(yǎng)殖廢水等處理[3, 4]. 濕地中的植物根系可以深入到表層以下0.6-0.7 m的基質(zhì)層中，并與基質(zhì)形成透水的交織網(wǎng)絡(luò)，攔截和吸附分解污水中的COD和氮磷等物質(zhì)[5]. 有研究表明，在潛流濕地處理污水系統(tǒng)中，污水中70%的氮通過微生物作用去除[6]，其中厭氧氨氧化菌在濕地氮循環(huán)中有重要的作用，潛流濕地系統(tǒng)中ANAMMOX菌群對(duì)污水中氮的去除率占到總?cè)コ实?4%[7]. 相關(guān)研究認(rèn)為，ANAMMOX廣泛存在于海洋、 河口、 海灣、 河流、 湖泊、 陸地和淡水濕地等生態(tài)系統(tǒng)之中[8]，ANAMMOX對(duì)區(qū)域海洋沉積物微生物氮循環(huán)的貢獻(xiàn)率為1.0%-67.0%[9, 10]，對(duì)河口和海灣沉積物微生物氮循環(huán)的貢獻(xiàn)率為1.0%-42.0%[11]，對(duì)河流和湖泊微生物氮循環(huán)的貢獻(xiàn)率最高可達(dá)40.0%-50.0%[12]. 另外，Long等[13]實(shí)驗(yàn)表明ANAMMOX在土壤氮循環(huán)中的貢獻(xiàn)率達(dá)32.1%-77.9%. Zhu等[14]研究發(fā)現(xiàn)白洋淀濕地中ANAMMOX對(duì)微生物氮循環(huán)的貢獻(xiàn)率為2.4%-35.0%. 以上研究充分說明ANAMMOX在自然生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，但由于自然狀態(tài)下ANAMMOX菌生長緩慢，難以檢測，關(guān)于ANAMMOX菌的研究進(jìn)展緩慢. 近年來，隨著16S rRNA分析和熒光原位雜交等技術(shù)的不斷發(fā)展，以16S rRNA、 hzo、 nirS、 hzs和細(xì)胞色素C等基因克隆文庫研究ANAMMOX菌的方法已經(jīng)成熟[15]，ANAMMOX研究進(jìn)入新階段. 水產(chǎn)養(yǎng)殖污水含有較高的氮磷等富營養(yǎng)化物質(zhì)，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的污染較大，采用人工濕地凈化養(yǎng)殖污水是近年新興起的技術(shù)，但由于相關(guān)研究較少，目前對(duì)人工濕地的凈化養(yǎng)殖污水的機(jī)理還了解不足，尤其是缺少針對(duì)濕地中ANAMMOX的研究. 為了解處理水產(chǎn)養(yǎng)殖排放污水潛流濕地中的厭氧氨氧化特征，本研究采用16S rRNA基因克隆文庫、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和多樣性分析等方法，探討了潛流濕地中ANAMMOX菌的菌群結(jié)構(gòu)、 多樣性、 豐度特征，分析了提高潛流濕地的反硝化作用的方法，旨在為優(yōu)化潛流濕地結(jié)構(gòu)，提高潛流濕地凈化養(yǎng)殖污水效率提供理論依據(jù).
1 材料與方法
1.1 潛流濕地
選擇中國水產(chǎn)科學(xué)研究院池塘生態(tài)工程研究中心(上海泖港，N30°57′1.89″，E121°08′52.21″)用于處理養(yǎng)殖排放水的潛流濕地作為研究對(duì)象. 該潛流濕地面積1 500 m2(寬40 m，長37.5 m)，基質(zhì)采用3級(jí)碎石配級(jí)，基質(zhì)厚度70 cm，底部鋪設(shè)0.5 mm HDPE 塑膠布做防滲處理. 潛流濕地的進(jìn)、 出水區(qū)為長1.5 m、 粒徑50～80 mm的碎石過濾區(qū)，中間凈化區(qū)為長34.5 m的3層基質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中底層基質(zhì)厚度為30 cm、 粒徑50～80 mm的碎石層，中間基質(zhì)為厚度30 cm、 粒徑20～50 mm的碎石層，上層基質(zhì)為厚度10 cm、 粒徑10～20 mm碎石層，濕地的水力坡度0.5%～2%，孔隙率0.30～1.0. 濕地表面種植有美人蕉、 鳶尾、 菖蒲等植物，種植密度為每平方米4株. 潛流濕地結(jié)構(gòu)如圖 1所示.
圖 1 濕地剖面示意
該潛流濕地于每年3月到11月的養(yǎng)殖期間運(yùn)行，運(yùn)行基本參數(shù)為：水體停留時(shí)間0.5～4 d，表面負(fù)荷率BOD 80～120 kg ·(hm2 ·d)-1.
1.2 樣品采集與處理
實(shí)驗(yàn)于2014年3月1日開始至11月15日結(jié)束. 分別于春季(3月20日)、 夏季(6月20日)、 秋季(9月20日)在濕地進(jìn)出水口的上、 中、 下層取基質(zhì)樣.
采樣位置及數(shù)量：在潛流濕地的進(jìn)水口(Wi)2-3 m處、 出水口(Wo)2-3 m處，上層(0-5 cm)、 中層(20-25 cm)、 下層(40-45 cm)采集基質(zhì)樣，每次采集基質(zhì)樣6個(gè).
采樣及保存方法：基質(zhì)樣采用人工挖掘到一定深度抽取泥水混合樣，取樣后立即裝入無菌塑封袋，排除空氣，密封，所有樣品用冰盒保存送至實(shí)驗(yàn)室冷凍保存.
實(shí)驗(yàn)室樣品處理：基質(zhì)樣品分析測定前需進(jìn)行預(yù)處理，處理方法為在500 mL無菌塑料廣口瓶中加入200 mL無菌水，放入半瓶基質(zhì)樣品，使用180 r ·min-1搖床振蕩30 min，去除基質(zhì)，然后將泥水混合物經(jīng)3 000 r ·min-1離心10 min或經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后(泥土較少時(shí))收集土壤，用于DNA提取.
1.3 DNA提取與PCR擴(kuò)增
使用FastDNA SPIN Kit for Soil(美國Mpbio公司)試劑盒提取基質(zhì)樣品(收集的土壤)中的DNA. DNA質(zhì)量經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，共得到18個(gè)樣，分裝成2份，一份用于菌群結(jié)構(gòu)、 多樣性的分析，一份用于定量分析.
將每個(gè)同批樣的6個(gè)DNA樣等量混合，采用巢式PCR對(duì)樣品中的ANAMMOX菌16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增. 第一輪采用引物對(duì)Pla46f-630r，第二輪采用引物對(duì)Amx368f-Amx820r，反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[16]. PCR反應(yīng)體系為Premix Ex Taq 12.5 μL; Forward primer 1 μL; Reverse primer 1 μL; 模板1 μL; ddH2O 9.5 μL.
1.4 文庫構(gòu)建和測序
對(duì)巢式PCR擴(kuò)增樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后采用特異片段切膠，經(jīng)GeneJET Gel Extraction Kit(Thermo)試劑盒純化后，用pEASY-T1 Cloning Kit(全式金)試劑盒連接，然后轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞. 導(dǎo)入目的基因的感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)無氨芐LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后，涂布于含氨芐和藍(lán)白斑檢測試劑的固體LB平板上，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，每組樣品挑取20個(gè)單克隆. 采用菌落PCR進(jìn)行陽性克隆檢測，選出18個(gè)陽性克隆接種于1 mL氨芐LB液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床培養(yǎng)10 h，送上海Invitrogen公司測序.
1.5 菌落結(jié)構(gòu)，多樣性分析
所得序列經(jīng)DNAStar軟件編輯，去除載體序列后，采用Mothur軟件劃分操作分類單元(OTU). 選出每個(gè)OTU代表序列，用NCBI-BLAST工具比對(duì)，搜索相似序列并下載. 使用MEGA 5.05將相似序列與代表序列進(jìn)行多重序列對(duì)齊，然后用鄰接(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹. 用Mothur軟件計(jì)算菌落香農(nóng)指數(shù)、 辛普森指數(shù)、物種豐富度和覆蓋率，對(duì)菌落多樣性進(jìn)行分析.
1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與數(shù)據(jù)分析
分別用ANAMMOX菌16S rRNA的特異性引物AMX-808-F和AMX-1040-R對(duì)18個(gè)樣品中ANAMMOX菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量，用細(xì)菌16S rRNA通用引物1055F-1392R對(duì)總微生物16S rRNA基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量. 采用的PCR儀器為 iCycler iQ5 (Bio-Rad，California，USA)，PCR 反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[16].
2 結(jié)果與分析
2.1 潛流濕地中ANAMMOX菌群結(jié)構(gòu)
對(duì)春季(3月20日)、 夏季(6月20日)、 秋季(9月20日)(圖表中分別用取樣月份Mar、 Jun、 Sep表示)樣品進(jìn)行測序，共得到69條有效序列. 經(jīng)Mothur 3%差異度劃分OTU，共得到6個(gè)OTU. 其中，Mar、 Jun、 Sep樣的OTU個(gè)數(shù)分別為3、 3、 4，表明潛流濕地中的ANAMMOX菌在不同季節(jié)中的OTU個(gè)數(shù)差異不大. 在所有OTU中，有2種OTU一直存在于潛流濕地中，為潛流濕地中ANAMMOX菌的優(yōu)勢種. 其它OTU隨著時(shí)間變化而出現(xiàn)或消失，在Mar和Jun樣中分別發(fā)現(xiàn)一個(gè)該時(shí)期特有的OTU，在Sep樣中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)該時(shí)期特有OTU，以上OTU與已知ANAMMOX菌16S rRNA基因比對(duì)顯示親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是具有ANAMMOX作用的新菌種(圖 2).
圖 2 不同季節(jié)潛流濕地ANAMMOX菌群結(jié)構(gòu)
采取系統(tǒng)發(fā)育分析方法對(duì)潛流濕地中獲得的ANAMMOX菌16S rRNA基因進(jìn)行比對(duì)分析(圖 3). 發(fā)現(xiàn)潛流濕地中包含Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia兩類ANAMMOX菌. OTU 1#和OTU 2#與Candidatus brocadia fulgida的16S rRNA序列相似度分別高達(dá)98.2%-99.8%和97%-98.2%，屬于Candidatus brocadia屬，是潛流濕地中ANAMMOX菌的優(yōu)勢種. 其中，OTU 1#與河北沙河中發(fā)現(xiàn)的ANAMMOX菌序列相似度達(dá)到98.4%-100%，OTU 2#與水稻田中發(fā)現(xiàn)的ANAMMOX菌序列相似度為97.7%-100%[17]. 在圖 3中，OTU 4#只存在于夏季Jun樣中，與Candidatus kuenenia的16S rRNA序列相似度高達(dá)98.4%-98.9%，屬于Candidatus kuenenia屬，與杭州西溪濕地的ANAMMOX菌序列相似度高達(dá)98.9%-99.8%，應(yīng)該是該時(shí)期特有種類.
圖 3中，OTU 3#、 OTU 5#、 OTU 6#與目前已知的ANAMMOX菌16S rRNA序列相似度小于97%，為未知菌種. OTU 5#和OTU 6#為秋季Sep特有的兩個(gè)種類，與已知ANAMMOX菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其中OTU 5#與Candidatus kuenenia stuttgartiensis的16S rRNA序列相似度僅為93.4%-93.6%. OTU 6#雖與Candidatus brocadia caroliniensis的16S rRNA序列相似度為93.1%-93.4%，但與錢塘江發(fā)現(xiàn)的ANAMMOX菌基因序列相似度高達(dá)97.5%-98.4%. OTU 3#為春季Mar特有，與Candidatus anammoximicrobium的16S rRNA序列相似度僅為76.4%，但與菖蒲根際土壤中發(fā)現(xiàn)的一些基因序列的相似度高達(dá)99.5%.
圖 3 潛流濕地中ANAMMOX菌群序列與相似序列系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2 潛流濕地ANAMMOX菌的多樣性
采用Mothur方法對(duì)潛流濕地中ANAMMOX菌的多樣性進(jìn)行分析. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，潛流濕地中ANAMMOX菌16S rRNA基因的克隆覆蓋率超過95%(表 1)，表明本克隆文庫結(jié)果能較好地代表潛流濕地ANAMMOX菌的菌群多樣性水平. 從表 1中看出，不同季節(jié)ANAMMOX菌的香農(nóng)多樣性指數(shù)(H′)在秋季Sep最高(H′，1.21)，春季Mar最低(H′,0.64)，說明隨著養(yǎng)殖時(shí)間延長和水體富營養(yǎng)化程度增大，潛流濕地中的ANAMMOX菌多樣性水平越來越高.
表 1 潛流濕地中ANAMMOX菌的多樣性水平
2.3 潛流濕地中ANAMMOX菌的豐度
使用定量PCR法對(duì)不同季節(jié)的18個(gè)樣品進(jìn)行分析. 結(jié)果表明，不同季節(jié)的樣品中均有ANAMMOX菌存在，其豐度(以鮮重計(jì)，下同)范圍在8.0×104-9.4×106 copies ·g-1之間，且多數(shù)樣品的豐度超過106 copies ·g-1. 在不同季節(jié)中，潛流濕地ANAMMOX菌的豐度差異較大，其中春季Mar出水口的下層最低，夏季Jun出水口的下層最大，二者差異超過102倍(圖 4).
Wi為進(jìn)水口，Wo為出水口,下同 圖 4 不同季節(jié)不同層面厭氧氨氧化菌豐度對(duì)比
對(duì)不同季節(jié)潛流濕地不同層面中ANAMMOX菌的豐度分析發(fā)現(xiàn)，在潛流濕地的水平方向，春季Mar進(jìn)水口的上、 中、 下層中ANAMMOX菌的豐度均高于出水口的上、 中、 下層. 夏季Jun出水口的上、 中、 下層中ANAMMOX菌的豐度均高于進(jìn)水口的上、 中、 下. 秋季Sep則表現(xiàn)為進(jìn)水口上層和下層中的ANAMMOX菌豐度低于出水口的上層和下層，進(jìn)水口中層ANAMMOX菌的豐度顯著高于出水口中層(圖 4).
在潛流濕地的垂直方向，春季Mar和秋季Sep均呈現(xiàn)為濕地中間層ANAMMOX菌的豐度高于上、 下層，但夏季Jun的ANAMMOX菌豐度卻表現(xiàn)為下層>中層>上層(圖 5).
圖 5 不同季節(jié)厭氧氨氧化菌豐度垂直分布
以上結(jié)果表明，潛流濕地中ANAMMOX菌的豐度存在明顯的空間差異，包括水平分布和垂直分布差異，但這種差異沒有隨時(shí)間變化的規(guī)律性(圖 4和圖 5).
2.4 潛流濕地中總細(xì)菌的豐度
對(duì)不同季節(jié)潛流濕地不同層面中的總細(xì)菌豐度進(jìn)行了測定. 結(jié)果顯示，潛流濕地中總細(xì)菌的豐度在7.3×109-9.1×1010 copies ·g-1之間，最小值出現(xiàn)在春季Mar出水口的上層，最大值出現(xiàn)在夏季Jun出水口上層(圖 6). 分析顯示，不同季節(jié)潛流濕地不同層面中的總細(xì)菌豐度在時(shí)空上差異不明顯，潛流濕地中ANAMMOX菌占總細(xì)菌的比率范圍在0.74×10-5%-10.8×10-5%之間.
圖 6 不同季節(jié)不同層面總細(xì)菌豐度對(duì)比
3 討論
本研究通過巢式PCR技術(shù)在處理養(yǎng)殖排放水的潛流濕地中檢測出了2種已知和3類未知ANAMMOX菌. 其中Candidatus brocadia屬在潛流濕地中分布最廣，為處理養(yǎng)殖排放水潛流濕地中ANAMMOX菌的優(yōu)勢種，與大多數(shù)淡水水域ANAMMOX菌優(yōu)勢種一致[14, 18, 19]. 另據(jù)其他研究鄰近水域厭氧氨氧化的報(bào)道，在長江口、 西湖底質(zhì)中檢測出Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia、 Candidatus scalindua 這3類ANAMMOX菌[11, 20]，在太湖底質(zhì)中檢測出Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia、 Candidatus jettenia 這3類ANAMMOX菌[21]. 本實(shí)驗(yàn)在潛流濕地中共檢測出Candidatus brocadia和Candidatus kuenenia 這2類已知ANAMMOX菌，雖然與附近水域相比種屬較少，但與白洋淀濕地和東江河完全一致[14, 22]. 在養(yǎng)殖期間的3個(gè)季節(jié)，潛流濕地中Candidatus brocadia屬一直都存在，說明是潛流濕地ANAMMOX菌的優(yōu)勢種. 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Candidatus kuenenia屬只出現(xiàn)在夏季，可能與該期間養(yǎng)殖水環(huán)境中的某些因子劇烈變化相關(guān). 多數(shù)研究認(rèn)為，鹽度是影響Scalindua屬分布的重要因子，但也有研究表明影響ANAMMOX菌種群的因素有很多，氮素、 碳氮比、 溫度等因素對(duì)ANAMMOX菌種群分布都有影響. 由于養(yǎng)殖排放水中的污染物以碳氮磷為主，關(guān)于碳氮磷等的比例、 組成等對(duì)ANAMMOX的影響作用研究還需進(jìn)一步深入.
本研究發(fā)現(xiàn)處理養(yǎng)殖排放水的潛流濕地中ANAMMOX菌的香農(nóng)多樣性指數(shù)在不同季節(jié)依次表現(xiàn)為秋季(Sep)>夏季(Jun)>春季(Mar)，說明潛流濕地中ANAMMOX菌的多樣性隨著養(yǎng)殖時(shí)間延長和養(yǎng)殖飼料投入增加而增高. 王謹(jǐn)[23]研究發(fā)現(xiàn)，秋季典型淡水養(yǎng)殖池塘中厭氧氨氧化細(xì)菌的多樣性比夏季更高，認(rèn)為秋季是水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料等投入最大的時(shí)期，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境變化的高峰期，為適應(yīng)外部環(huán)境，ANAMMOX菌可能表現(xiàn)出了更高的多樣性.
本研究發(fā)現(xiàn)處理養(yǎng)殖排放水潛流濕地ANAMMOX菌的豐度范圍在8.0×104-9.4×106 copies ·g-1之間，與淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)中監(jiān)測到的ANAMMOX菌豐度相當(dāng)[24, 25, 26, 27]. 另外，Zhu等[16]在研究水稻土壤中ANAMMOX菌豐度垂直分布特征時(shí)發(fā)現(xiàn)，土壤深度為40-50 cm處的ANAMMOX菌豐度最高，與本研究發(fā)現(xiàn)的夏季(Jun)潛流濕地ANAMMOX菌的垂直分布特征一致. 不同的是處理養(yǎng)殖廢水潛流濕地表層(0-5 cm)的ANAMMOX菌豐度要低于中層(20-25 cm)，這與Zhu的研究結(jié)果相反，可能與潛流濕地相對(duì)較為疏松的基質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān). 總體看，夏季(Jun)潛流濕地中ANAMMOX菌的豐度高于秋季(Sep)，但秋季(Sep) ANAMMOX菌的多樣性卻高于夏季(Jun). 前面分析認(rèn)為ANAMMOX菌多樣性增高是適應(yīng)外部環(huán)境的結(jié)果，雖然夏季(Jun)不是飼料等營養(yǎng)物投入的高峰期，但進(jìn)入夏季后大量投入的富營養(yǎng)物可能會(huì)引起ANAMMOX菌的大量生長.
反硝化是潛流濕地的重要功能. 目前，在處理水產(chǎn)養(yǎng)殖污水的潛流濕地設(shè)計(jì)中一般只關(guān)注濕地的硝化反應(yīng)和植物作用等，對(duì)濕地的反硝化作用重視不足. 鑒于ANAMMOX在濕地氮循環(huán)中具有重要的作用，提高濕地反硝化效果可以極大地提高濕地的凈化效率. 本研究發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)潛流濕地ANAMMOX菌的多樣性和豐度差異巨大，這種現(xiàn)象除與養(yǎng)殖排放水的污染濃度不同外，可能還與濕地的結(jié)構(gòu)以及布水方式有關(guān)，為了提高濕地的污水凈化效率，在夏秋季節(jié)適當(dāng)縮短潛流濕地的水力停留時(shí)間或?qū)鹘y(tǒng)推流布水方式改為垂直流進(jìn)水有可能會(huì)提高濕地的反硝化效果，另外采用多波段的濕地結(jié)構(gòu)可能也是提高反硝化的重要方法. 總之，隨著對(duì)濕地反硝化研究的深入，將會(huì)為處理養(yǎng)殖排放水提供更高效的人工濕地技術(shù).具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 結(jié)論
(1)處理水產(chǎn)養(yǎng)殖污水的潛流濕地中存在Candidatus brocadia和Candidatus kuenenia兩類厭氧氨氧化菌和3類未知的ANAMMOX.
(2)處理水產(chǎn)養(yǎng)殖污水的潛流濕地中ANAMMOX菌的多樣性在不同季節(jié)存在差異，且多樣性隨著養(yǎng)殖時(shí)間延長而逐步增大.
(3)處理養(yǎng)殖排放水的潛流濕地中ANAMMOX菌的豐度在水平分布和垂直分布上存在明顯差異，但無季節(jié)變化規(guī)律.（來源及作者：上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 曾憲磊 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所 劉興國 吳宗凡 時(shí)旭 陸詩敏）
