1 引言

　　水體沉積物為許多底棲生物提供棲息場(chǎng)所，是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分.研究表明，沉積物中污染物濃度通常是水溶液中的數(shù)百倍甚至數(shù)十萬倍.在適當(dāng)?shù)臈l件下，沉積物中的污染物會(huì)再次釋放到水體中，形成二次污染.重金屬作為沉積物中的一類主要污染物，具有毒性大、難降解、易被生物富集等特性，能經(jīng)過食物鏈傳遞最后影響生態(tài)系統(tǒng)和人體健康.沉積物中重金屬的毒性不僅取決于重金屬的總量，更與沉積物中的賦存形態(tài)有關(guān).Toro和Allen等認(rèn)為水體沉積物中重金屬的重要結(jié)合相是酸可揮發(fā)性硫化物(AVS)、顆粒有機(jī)碳和鐵與錳的羥氧化物.在厭氧和缺氧的沉積環(huán)境中，AVS是控制沉積物重金屬生物有效性的關(guān)鍵形態(tài)，也決定了沉積物重金屬的毒性大小.

　　目前關(guān)于水相中重金屬對(duì)水生生物毒性效應(yīng)的研究較多，而有關(guān)淡水沉積物中重金屬毒性與生物有效性的研究較少.國(guó)內(nèi)有以大型蚤為受試生物，通過測(cè)定其體內(nèi)的金屬硫蛋白和超氧化物歧化酶來研究重金屬Cd和Zn的聯(lián)合作用(張融等，2008);范文宏等也以大型蚤研究了水體-沉積物共存體系中Cd的毒性(范文宏等，2009).而趙艷民等以泥鰍死亡率、血液紅細(xì)胞數(shù)量等指標(biāo)考察了沉積物中Cd的毒性效應(yīng).

　　本研究以淡水單孔水絲蚓和伸展搖蚊幼蟲作為受試生物，它們都是典型的底棲生物物種，被廣泛應(yīng)用在生物毒性實(shí)驗(yàn)中(付榮恕等，2008; 曾毅等，2012).搖蚊幼蟲還是美國(guó)環(huán)�？偩�(EPA)推薦的生物毒性測(cè)試物種.通過對(duì)沉積物進(jìn)行Cu、Cd、Ni、Pb、Zn等5種重金屬染毒，分析沉積物中重金屬對(duì)水絲蚓和搖蚊幼蟲的毒性效應(yīng)，探討沉積物中酸可揮發(fā)性硫化物(AVS)、同時(shí)可提取金屬(SEM)與毒性效應(yīng)之間的關(guān)系.研究結(jié)果有助于了解沉積物重金屬對(duì)底棲生物的毒害效應(yīng)，為建立基于生物毒性的沉積物質(zhì)量基準(zhǔn)提供有效數(shù)據(jù).

　　2 材料與方法

　　2.1 沉積物的準(zhǔn)備

　　歐洲環(huán)境毒理化學(xué)學(xué)會(huì)認(rèn)為生物暴露試驗(yàn)是評(píng)價(jià)沉積物中重金屬毒性的唯一可靠途徑(趙艷民等，2011).由于難以獲得大量重金屬本底值較低的天然沉積物，本研究按照Pasteris等推薦的方法(Pasteris et al., 2003)，采用潔凈土壤模擬沉積物進(jìn)行加標(biāo)染毒.從天津市郊區(qū)農(nóng)田采集潔凈土壤，經(jīng)自然風(fēng)干后，過40目篩以去除粗顆粒，將所得土壤按1 ∶ 1的體積比與經(jīng)曝氣去氯的自來水混合并攪拌均勻，所得泥漿靜置一周，獲得與自然沉積物狀態(tài)相似的混合物質(zhì)，加標(biāo)染毒前棄去上覆水.

　　所用土壤的重金屬濃度值(測(cè)定結(jié)果見表 1)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，Cr、Ni、Cu、Zn、Hg、Pb的背景值達(dá)到我國(guó)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 15618—1995)的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，基本為自然背景水平，而Cd和As的濃度值高于一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，低于二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，基本不會(huì)對(duì)生物造成毒害作用.

　　表 1 實(shí)驗(yàn)用土壤中重金屬含量(以干重計(jì))

　　2.2 沉積物染毒

　　使用分析純的重金屬鹽試劑，用去離子水配制金屬離子濃度為1000 mg · L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.在250 mL的燒杯中放入平衡好的潔凈沉積物(約含干沉積物30 g)，加入一定體積的重金屬儲(chǔ)備液，按1 ∶ 4的體積比在燒杯中加入上覆水進(jìn)行混合，配制成含有不同濃度梯度的染毒沉積物，具體染毒濃度見表 2.用干凈的小木鏟攪拌1 h使混合均勻，然后靜止14 d.期間每隔3 d對(duì)加標(biāo)沉積物充分?jǐn)嚢?次，對(duì)照組沉積物除不加重金屬儲(chǔ)備液外按相同方式進(jìn)行處理.

　　表 2 沉積物中重金屬的染毒濃度(以干重計(jì))

　　2.3 生物測(cè)試

　　2.3.1 受試生物

　　淡水單孔水絲蚓和伸展搖蚊幼蟲均在實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期培養(yǎng)馴化.本研究挑選健康受試生物用于毒性實(shí)驗(yàn).馴養(yǎng)及生物實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)48 h 曝氣除氯處理的自來水，pH 7.80~8.30，DO > 6 mg · L-1，電導(dǎo)率 900~1100 μS · cm-1，水溫(22.4±0.3)℃.

　　2.3.2 毒性試驗(yàn)

　　選擇體長(zhǎng)3~4 cm左右、環(huán)帶明顯且大小一致的健康成年水絲蚓，將它們放入裝有清水的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行24 h清腸.清腸后仍然健康的水絲蚓方可用于正式實(shí)驗(yàn).根據(jù)美國(guó)EPA底棲生物標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法(Liber et al., 2011;Mehler et al., 2011; Anderson et al., 2012)進(jìn)行21 d毒性試驗(yàn).在每個(gè)燒杯中放入10只水絲蚓，每個(gè)濃度組設(shè)置5個(gè)平行.實(shí)驗(yàn)過程中輕微曝氣，實(shí)驗(yàn)溫度為(23±1)℃，光照比16h ∶ 8h，每周進(jìn)行1次喂食.

　　根據(jù)美國(guó)EPA底棲生物標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法(EPA，2000;OECD，2004)，使用二齡搖蚊幼蟲作為受試生物，24 h清腸后進(jìn)行14 d毒性試驗(yàn).在每個(gè)燒杯中放入10只搖蚊幼蟲，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)平行.實(shí)驗(yàn)條件基本同水絲蚓，每隔3 d喂食1次.及時(shí)觀察記錄受試生物的活動(dòng)情況、中毒癥狀和死亡情況等，用針刺激受試生物個(gè)體，無反應(yīng)的視作死亡.試驗(yàn)結(jié)束過篩后計(jì)算死亡個(gè)體.

　　2.4 AVS、SEM測(cè)定

　　采用美國(guó)EPA推薦的吹氣-吸收-比色方法測(cè)定沉積物中的AVS(雷琳，雷志丹，2009;孟妍等，2012).在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境中，稱取3~5 g濕沉積物放于反應(yīng)瓶中，與1 mol · L-1鹽酸溶液反應(yīng)40 min.所生成硫化氫氣體隨高純氮?dú)廪D(zhuǎn)移到吸收液(堿性醋酸鋅-醋酸鈉溶液)中，然后用亞甲基藍(lán)比色法測(cè)定其中的硫化物含量.

　　將提取完AVS剩下的泥水混合物離心，取上清液;往剩余沉積物中加入1 mL鹽酸(1 ∶ 1)清洗，離心，再取上清液;用蒸餾水清洗兩遍后離心;將離心所得溶液混合并過0.45 μm膜，然后用ICP-MS測(cè)定其中重金屬含量，即為SEM.將離心后的沉積物放入烘箱中烘干，稱重，即為樣品干重.

　　2.5 數(shù)據(jù)處理

　　試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2007進(jìn)行處理，對(duì)平均數(shù)做Pearson相關(guān)性分析，運(yùn)用Origin 8.5作圖.平行樣中SEM的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi).

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 沉積物中重金屬對(duì)水絲蚓的21 d毒性效應(yīng)

　　在實(shí)驗(yàn)過程中，上覆水pH值在6.98~7.87之間，DO值在3.4~4.9 mg · L-1之間.對(duì)照組的平均存活率為100%，其結(jié)果符合沉積物底棲生物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn).分別以水絲蚓的死亡率和自斷率為毒性終點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后過篩計(jì)算死亡個(gè)數(shù)，失蹤的個(gè)體按死亡計(jì)數(shù).自斷率為發(fā)生爛尾、尾部斷裂的個(gè)體之和.

　　水絲蚓對(duì)5種重金屬的毒性反應(yīng)類似，當(dāng)沉積物中重金屬濃度較高時(shí)，水絲蚓出現(xiàn)急劇身體扭動(dòng)且不鉆入沉積物中.隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，水絲蚓身體彎曲抱團(tuán)，對(duì)外界的刺激反應(yīng)逐漸變得遲緩，最終失去逃避能力，身體由紅變白，產(chǎn)生自斷或糜爛直至死亡.當(dāng)重金屬濃度降低時(shí)，水絲蚓的身體扭動(dòng)反應(yīng)減弱并有不同程度的延后，部分或全部水絲蚓鉆入沉積物中.

　　沉積物中重金屬(以干重計(jì))對(duì)水絲蚓21 d毒性效應(yīng)結(jié)果如圖 1所示.5種重金屬中Cd對(duì)水絲蚓的毒性效應(yīng)最強(qiáng).水絲蚓放入高濃度沉積物后立即開始劇烈扭動(dòng)，在濃度25 mg · kg-1出現(xiàn)自斷現(xiàn)象，在50 mg · kg-1出現(xiàn)個(gè)體死亡;而在濃度400 mg · kg-1的沉積物中死亡率達(dá)70%，自斷率達(dá)88%.水絲蚓的死亡率和自斷率均隨Cd濃度增加而增大，與濃度均呈顯著正相關(guān)(p<0.01).沉積物中Cu和Ni也會(huì)使水絲蚓產(chǎn)生身體自斷和個(gè)體死亡，但其毒性效應(yīng)略低于Cd.水絲蚓對(duì)沉積物中Pb和Zn的中毒癥狀較輕，沒有發(fā)現(xiàn)身體自斷現(xiàn)象，在較高濃度下會(huì)出現(xiàn)死亡.根據(jù)概率單位法計(jì)算，水絲蚓21 d半數(shù)致死濃度(LC50)和50%身體自斷效應(yīng)濃度(EC50)結(jié)果見表 3.

　　圖 1 水絲蚓的毒性效應(yīng)與沉積物中重金屬濃度的關(guān)系

　　表 3 沉積物中重金屬對(duì)水絲蚓21 d LC50和EC50值

　　根據(jù)水絲蚓的21 d LC50值可知，5種金屬對(duì)水絲蚓的毒性大小為Cd>Ni>Cu>Pb>Zn.本研究得出沉積物中Cd對(duì)水絲蚓21d LC50為281 mg · kg-1.有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)沉積物中Cd的濃度高于60 mg · kg-1(8 d暴露實(shí)驗(yàn))時(shí)，水絲蚓(Limnodrilus udekemianus)會(huì)出現(xiàn)死亡情況(Deeds，1999).美國(guó)USGS給出Ni加標(biāo)沉積物28 d對(duì)水絲蚓(Tubifex tubifex)無效應(yīng)濃度為494 mg · kg-1.由于不同種受試生物對(duì)同種污染物的耐受能力相差較大，同時(shí)不同實(shí)驗(yàn)室所采用實(shí)驗(yàn)條件不同也會(huì)造成毒性數(shù)據(jù)的差異.總體來說，本研究的毒性結(jié)果基本與已有文獻(xiàn)相符.

　　付榮恕(2008)采用靜水生物測(cè)試法，研究了Pb、Cd單一及復(fù)合情況下對(duì)霍甫水絲蚓的急性毒性.單一Pb和Cd對(duì)水絲蚓24h LC50分別為7.096和31.621 mg · L-1，48 h LC50分別為4.731和23.441 mg · L-1.孫新元(2010)測(cè)定了水中Cu對(duì)顫蚓的毒性效應(yīng)，其24 h LC50、48h LC50、72h LC50 分別為237.8、212.2、174.3 μg · L-1.由此可見，水體中Cu對(duì)水絲蚓的毒性要高于Cd和Pb，這與沉積物中幾種重金屬的毒性順序不同.這說明重金屬對(duì)生物的毒性與其在環(huán)境中存在的狀態(tài)有很大的關(guān)系.重金屬可以通過絡(luò)合等作用與沉積物中的組分發(fā)生結(jié)合，其結(jié)合態(tài)的生物可利用性決定了對(duì)生物的毒性.因而需要進(jìn)一步研究討論沉積物中重金屬的生物有效性與底棲生物毒性的關(guān)系.

　　3.2 沉積物中重金屬對(duì)搖蚊幼蟲14 d毒性效應(yīng)

　　在實(shí)驗(yàn)過程中，上覆水pH值在6.98~7.87之間，DO值在3.4~4.9 mg · L-1之間.毒性效應(yīng)采用死亡率和平均干重的抑制率為指標(biāo).生長(zhǎng)抑制率為14 d毒性試驗(yàn)后存活幼蟲的平均干重與對(duì)照組平均干重的差值的百分比.

　　沉積物中重金屬對(duì)搖蚊幼蟲14 d毒性效應(yīng)結(jié)果如圖 2所示.與水絲蚓的中毒癥狀相似，當(dāng)沉積物中重金屬濃度較高時(shí)，搖蚊幼蟲會(huì)發(fā)生劇烈的身體扭動(dòng)且不鉆入沉積物中.隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，搖蚊幼蟲由開始的劇烈扭動(dòng)逐漸變得行動(dòng)遲緩，失去逃避能力，最終身體會(huì)變透明甚至死亡.當(dāng)濃度逐漸降低時(shí)，搖蚊幼蟲會(huì)很快鉆入沉積物中，而且在沉積物中的挖洞行為逐漸變得活躍.但是，在一定重金屬濃度時(shí)，搖蚊幼蟲的生長(zhǎng)明顯受到抑制.如圖 2所示，搖蚊幼蟲的死亡率隨重金屬的濃度增加而增大，呈現(xiàn)較好的相關(guān)性;而其生長(zhǎng)抑制率也隨濃度增加而升高.同樣，對(duì)于搖蚊幼蟲Cd的毒性最強(qiáng)，在20.7 mg · kg-1時(shí)生長(zhǎng)抑制率達(dá)到61%，死亡率達(dá)到50%.5種重金屬對(duì)搖蚊幼蟲14 d LC50和50%平均干重抑制效應(yīng)濃度(EC50)結(jié)果見表 4.

　　圖 2 伸展搖蚊幼蟲的毒性效應(yīng)與沉積物中重金屬濃度的關(guān)系

　　表 4 金屬對(duì)搖蚊幼蟲的毒性結(jié)果

　　由伸展搖蚊幼蟲的14 d LC50可知，5種加標(biāo)金屬沉積物對(duì)搖蚊幼蟲的毒性順序?yàn)镃d > Pb ≈ Cu > Ni > Zn.Depledge和Rainbow(1990)認(rèn)為，生物體對(duì)重金屬的敏感度和毒性作用受其本身對(duì)重金屬離子的吸收、累積和排泄的平衡調(diào)節(jié)決定.而Bidwell和Gorrie(2006)的研究表明水體理化性質(zhì)，如溫度、鹽度、溶氧、pH等也會(huì)影響重金屬對(duì)生物的毒性效應(yīng).Klaas進(jìn)行的淡水沉積物暴露試驗(yàn)表明Cd在0.6~1030 mg · kg-1時(shí) 搖蚊幼蟲的存活率為46%~81%.得出Ni對(duì)搖蚊幼蟲的最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)為353 mg · kg-1，與本研究觀察到的致死率濃度基本相符.

　　除了Zn以外，其它4種重金屬的搖蚊幼蟲的LC50值都顯著低于水絲蚓，說明沉積物中重金屬對(duì)搖蚊幼蟲的毒性效應(yīng)要強(qiáng)于水絲蚓，也就是說搖蚊幼蟲比水絲蚓對(duì)沉積物中重金屬更敏感.綜合考慮，搖蚊幼蟲更適用于監(jiān)測(cè)沉積物中重金屬污染.

　　3.3 AVS與SEM之間的關(guān)系及對(duì)重金屬生物有效性的影響

　　沉積物中重金屬的不同存在形態(tài)決定著沉積物中重金屬的污染程度，即決定著沉積物中重金屬的毒性(曾毅，2012).研究表明，SEM/AVS的比值與沉積物中重金屬毒性有關(guān)，即當(dāng)二價(jià)金屬離子的含量高于沉積物中S2-時(shí)會(huì)引起毒性作用(Di Toro et al., 1992b).Di Toro和Ankley認(rèn)為，當(dāng)SEM/AVS<1或SEM-AVS<0時(shí)，沉積物中重金屬對(duì)底棲生物基本不產(chǎn)生毒害效應(yīng);SEM/AVS>1或SEM-AVS>0時(shí)，沉積物重金屬對(duì)生物具有潛在毒性(Di Toro et al., 1992b; Ankley et al., 1996).本研究中沉積物AVS含量、重金屬SEM含量以及兩種底棲生物的毒性效應(yīng)見表 5~表 6.

　　表 5 用于水絲蚓毒性實(shí)驗(yàn)的沉積物中AVS、SEM測(cè)定結(jié)果(以μmol · g-1計(jì))

　　表 6 用于搖蚊幼蟲毒性試驗(yàn)的沉積物中AVS、SEM測(cè)定結(jié)果(以μmol · g-1計(jì))

　　如圖 3所示，水絲蚓和搖蚊幼蟲的死亡率隨著SEM/AVS摩爾比值的增大而逐漸升高.當(dāng)SEM/AVS值大于1時(shí)，除Cd外，重金屬對(duì)水絲蚓和搖蚊幼蟲的毒性效應(yīng)比較明顯，這說明AVS確實(shí)是控制沉積物中重金屬毒性效應(yīng)的關(guān)鍵因素.而Cd加標(biāo)沉積物的SEM/AVS值雖然小于1，但其生物暴露實(shí)驗(yàn)表明其加標(biāo)沉積物具有較強(qiáng)的生物毒性.從圖 3可以看出，除了Cu和Cd以外，Pb、Zn、Ni對(duì)水絲蚓和搖蚊幼蟲的致死率與SEM/AVS比值之間表現(xiàn)出良好的一致性，進(jìn)一步說明用SEM/AVS可以較好的描述沉積物中重金屬的生物可利用性，同時(shí)也說明它們對(duì)兩種底棲生物具有相似的致毒機(jī)制.

　　不同重金屬與沉積物中S2-結(jié)合作用的強(qiáng)弱不同，因此會(huì)表現(xiàn)出不同的生物有效性.Cd的硫化物溶度積(Ksp=3.6×10-29)比其他幾種重金屬硫化物的溶度積都要低，因此Cd的SEM/AVS值非常低(均小于1).然而，Cd仍對(duì)水絲蚓和搖蚊幼蟲均有較高毒性，說明Cd對(duì)底棲生物的毒性效應(yīng)非常強(qiáng)，即使具有生物有效性的Cd濃度很低，仍然可能導(dǎo)致生物中毒.這也可能與底棲生物吞食沉積物的習(xí)性有關(guān)，沉積物中的AVS結(jié)合態(tài)Cd可以通過大量的吞食活動(dòng)在其體內(nèi)產(chǎn)生累積引起毒性.具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 3 水絲蚓、搖蚊幼蟲的死亡率與沉積物中SEM/AVS的關(guān)系

　　4 結(jié)論

　　1)5種重金屬加標(biāo)沉積物對(duì)淡水單孔蚓的21 d毒性順序?yàn)镃d > Ni > Cu > Pb > Zn;對(duì)伸展搖蚊幼蟲14 d毒性順序?yàn)镃d > Pb > Cu > Ni > Zn.搖蚊幼蟲比淡水單孔蚓對(duì)沉積物中重金屬更敏感.綜合考慮，搖蚊幼蟲更適用于監(jiān)測(cè)淡水沉積物中重金屬污染.

　　2)當(dāng)SEM/AVS>1時(shí)，除Cd外其余4種重金屬均對(duì)受試生物表現(xiàn)出較為明顯的毒性效應(yīng)，用SEM/AVS可以較好地反映沉積物中重金屬的生物有效性.

　　3)目前關(guān)于沉積物中重金屬對(duì)底棲生物毒性效應(yīng)的數(shù)據(jù)比較少，相關(guān)的理論也不成熟，急需開展相關(guān)的研究，為水體污染控制提供理論基礎(chǔ).