1 引言

　　剩余污泥中存在著相當(dāng)數(shù)量難以生物降解的木質(zhì)纖維素.一方面，這些木質(zhì)纖維素難以在厭氧消化過程中被降解、轉(zhuǎn)化，使得能源(甲烷)產(chǎn)率過低.另一方面，殘留在消化污泥中的木質(zhì)纖維素也阻礙污泥減量，為污泥填埋處置形成潛在隱患(Mottet et al., 2010).

　　研究表明，木質(zhì)纖維素是一種由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的聚合物.其中，木質(zhì)素最難降解，且在厭氧條件下無法實(shí)現(xiàn)有效降解;而纖維素和半纖維素相對(duì)容易降解并轉(zhuǎn)化.如果能實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素其中2組分(纖維素、半纖維素)完全降解，不僅污泥能源轉(zhuǎn)化率將會(huì)提高，而且也會(huì)對(duì)污泥減量起到一定的促進(jìn)作用.污泥厭氧消化實(shí)踐表明，傳統(tǒng)厭氧消化幾乎對(duì)木質(zhì)纖維素沒有降解.這表明，傳統(tǒng)厭氧消化系統(tǒng)中很少或幾乎不存在降解復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)木質(zhì)纖維素的微生物.

　　面對(duì)上述實(shí)際情況，本研究旨在通過微生物富集培養(yǎng)方法去探知消化污泥中是否存在可降解纖維素/半纖維素的厭氧微生物，為后續(xù)研究污泥中木質(zhì)纖維素厭氧生物降解奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).如上述，纖維素和半纖維素生物降解相對(duì)容易，這是因?yàn)檫@2種組分在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，如木聚糖(半纖維素主要成分)和纖維素都是由單糖經(jīng)β-1，4糖苷鍵鏈接而成，它們的降解均是依靠胞外酶打破β-1，4糖苷鍵而實(shí)現(xiàn).可見，可以通過富集培養(yǎng)降解一種物質(zhì)的微生物便可實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維素2種組分的同步降解.本研究中微生物富集培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也就由此開始.

　　2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

　　2.1 種泥與基質(zhì)

　　富集培養(yǎng)木質(zhì)纖維素厭氧生物種泥分別取自北京市某大型市政污水處理廠剩余污泥(實(shí)際污泥)與實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中厭氧培養(yǎng)污泥(消化污泥).實(shí)際污泥為污水處理廠脫水后污泥(含水率：80%)，實(shí)驗(yàn)時(shí)按需要濃度進(jìn)行兌水稀釋.消化污泥原污泥來源于實(shí)驗(yàn)室一合成配水的SBR脫氮除磷中試裝置剩余污泥;用于消化污泥培養(yǎng)的發(fā)酵罐工作體積為4 L，在T=35 ℃、SRT=20 d、pH=7.0工況下運(yùn)行.

　　選擇木聚糖作為木質(zhì)纖維素降解微生物富集培養(yǎng)的唯一基質(zhì)，因?yàn)樗�相�?duì)于纖維素來說，結(jié)構(gòu)疏松，無晶體結(jié)構(gòu)，聚合度低，較容易被降解.

　　2.2 富集培養(yǎng)系統(tǒng)

　　富集培養(yǎng)采用系列平行搖瓶實(shí)驗(yàn)，配備有密封橡膠塞的250 mL血清瓶作為富集培養(yǎng)系統(tǒng).血清瓶置于空氣浴恒溫?fù)u床(T=35 ℃;搖動(dòng)速度100 r · min-1)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

　　兩種不同來源的種泥在血清瓶中的污泥濃度分別為：①實(shí)際污泥：MLSS≈22.28 g · L-1，MLVSS≈14.56 g · L-1;②消化污泥：MLSS≈22.37 g · L-1，MLVSS≈17.69 g · L-1.兩種污泥分別設(shè)置3個(gè)平行樣(編號(hào)：1、2、3)，并各設(shè)置1個(gè)不加基質(zhì)的空白樣瓶.實(shí)驗(yàn)中，以6 d作為1個(gè)周期進(jìn)行底物置換，并進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)方案列于表 1.細(xì)菌培養(yǎng)所需微量元素通過向血清瓶分別添加DIN EN ISO 11734 L47(簡(jiǎn)稱L47)和DIN EN ISO 11734(簡(jiǎn)稱M)培養(yǎng)液來補(bǔ)充，其成分見表 2.

 表1 微生物富集培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案 

 
表2 培養(yǎng)液組成

　　在富集實(shí)驗(yàn)伊始，即使存在木聚糖降解類微生物，它們也不是優(yōu)勢(shì)菌種.所以，木聚糖如能降解，首先會(huì)形成單糖，隨后會(huì)被占優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)化為CH4和CO2.因此，可根據(jù)血清瓶產(chǎn)氣情況來作為木聚糖是否降解之指示.另外，木聚糖降解微生物主要是以分泌胞外酶的形式來水解木聚糖，且胞外酶之活性又與微生物的活性呈正比.故此，系統(tǒng)中的木聚糖酶活性可用作為一種指標(biāo)，以此判斷系統(tǒng)中木聚糖降解微生物的生物活性.

　　2.3 氣體組分測(cè)定

　　實(shí)驗(yàn)中采用氣相色譜儀(GC-2014型)檢測(cè)血清瓶中產(chǎn)生的甲烷等氣體，測(cè)定方法為外標(biāo)法;選取標(biāo)定物為高純度標(biāo)準(zhǔn)氫氣和甲烷制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖 1所示.

 圖 1 氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　2.4 木聚糖酶活性測(cè)定

　　2.4.1 測(cè)定原理

　　木聚糖經(jīng)過木聚糖酶水解后會(huì)生成寡糖和單糖.由于寡糖具有還原性末端和單糖具有還原基團(tuán)，所以，導(dǎo)致兩者在沸水浴條件下與DNS試劑會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng).因顯色反應(yīng)顏色強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，且還原糖量又與待測(cè)液中木聚糖酶活性成正比，所以，可通過顯色反應(yīng)強(qiáng)度來推算木聚糖酶活性.

　　2.4.2 測(cè)定方法

　　取 1%木聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液3.6 mL，滴入25 mL 具塞刻度試管中;加入0.4 mL適當(dāng)稀釋的富集培養(yǎng)上清液，于35 ℃水浴鍋中保溫30 min;加入6 mL DNS溶液，混勻，沸水浴15 min;冷卻至室溫，定容到25 mL，在540 nm測(cè)定溶液吸光度.平行測(cè)定加入滅活上清液的空白對(duì)照組.

　　2.4.3 酶活性計(jì)算方法

　　木聚糖酶活性單位是指每min催化木聚糖水解生成1 μmol木糖所需的酶量，其中一個(gè)酶活性單位為U.酶活性計(jì)算公式(李彩霞等，2001)為：

　　式中，H為木聚糖酶酶活性(U · mL-1);D為酶液稀釋倍數(shù);V1為比色管定容體積(mL);CX為木糖濃度(μmol · mL-1);T為反應(yīng)時(shí)間(min);V2為酶液體積(mL).

　　2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　采用高純度木聚糖溶液制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(外標(biāo)法)，標(biāo)定溶液中木聚糖酶活性，測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2所示.該方法可準(zhǔn)確地檢測(cè)出反應(yīng)液中的木糖含量，從而可以根據(jù)計(jì)算公式推算出待測(cè)液中木聚糖酶活性.

 圖 2 木聚糖酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　2.5 熒光顯微鏡鏡檢

　　本實(shí)驗(yàn)，微生物實(shí)驗(yàn)觀察采用熒光顯微鏡(Zeiss Axioskop 40，正置式)進(jìn)行，并配備了熒光激發(fā)光源和濾光片組，以確保紅、綠、藍(lán)色熒光觀察能夠正常進(jìn)行.此外，顯微鏡還配置以數(shù)碼相機(jī)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)觀察到的微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)拍攝，并隨之通過配置的AxioVision軟件進(jìn)行分析，以產(chǎn)生準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)信息.

　　2.6 熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗(yàn)

　　熒光原位雜交(FISH)被用于鑒定富集培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)菌種類.首先，對(duì)測(cè)試泥樣用4%多聚甲醛固定2 h;再對(duì)固定后的泥樣離心，并在1×PBS 中重新懸浮(重復(fù)3次).其次，對(duì)泥樣進(jìn)行機(jī)械破碎，并將破碎泥樣滴加在明膠包被的載玻片上，分別用50%、80%和98%酒精浸泡3 min.再次，將熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針(見表 3)溶解于雜交緩沖液中(組成：0.9 mol · L-1 NaCl，0.02 mol · L-1Tris-HCl(pH=7.4)，0.01% SDS和35% 去離子甲酰胺(DFA))，并在46 ℃下與污泥樣品雜交2 h.雜交結(jié)束后，采用清洗液(組成：0.005 mol · L-1 EDTA(pH=8.0)，0.02 mol · L-1 Tris-HCl(pH=7.2)，0. 01%SDS和0.9 mol · L-1 NaCl)在48 ℃下洗脫20 min.最后，對(duì)每個(gè)污泥樣品用熒光顯微鏡(Zeiss Axioskop 40)隨機(jī)拍照并進(jìn)行定量分析.

 表3 鑒定木聚糖降解菌的寡核苷酸序列探針

　　2.7 細(xì)胞活性染色(LIVE/DEAD)

　　采用熒光染料對(duì)富集培養(yǎng)系統(tǒng)中的微生物進(jìn)行染色，以確定富集培養(yǎng)系統(tǒng)中微生物的細(xì)胞活性，操作方法見參考文獻(xiàn)(Invitrogen Molecular Probes，2004; Ziglio et al., 2002).

　　3 結(jié)果分析與討論

　　3.1 產(chǎn)氣情況

　　血清瓶富集培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)氣變化曲線示于圖 3，甲烷產(chǎn)氣變化曲線示于圖 4，其中，實(shí)際污泥與消化污泥產(chǎn)氣曲線均以3組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求平均值繪制而成.

 圖 3 總產(chǎn)氣量趨勢(shì)圖

　　圖 3顯示，未投加基質(zhì)——木聚糖的兩個(gè)空白樣之氣體產(chǎn)量隨時(shí)間推移逐漸減少，直至第10周期(60 d)時(shí)為零，說明空白樣因無外加碳源而只能進(jìn)行內(nèi)源呼吸，直至內(nèi)源碳源消耗殆盡.反觀投加木聚糖血清瓶氣體產(chǎn)量，先升后降，先后出現(xiàn)兩個(gè)谷峰和谷底.這一產(chǎn)氣量變化趨勢(shì)說明，血清瓶中的木聚糖已被降解，即，兩種種泥中均存在著不同含量可降解木聚糖的厭氧微生物.

 圖 4 CH₄產(chǎn)氣量趨勢(shì)圖

　　圖 3、圖 4產(chǎn)氣量出現(xiàn)的連續(xù)谷峰、谷底圖形暗示，在實(shí)驗(yàn)的伊始，可能因降解木聚糖之細(xì)菌較少而造成木聚糖少量降解與細(xì)菌內(nèi)源呼吸并行的狀態(tài)，即，此時(shí)觀測(cè)到的產(chǎn)氣量為兩者的疊加(以內(nèi)源呼吸產(chǎn)氣量為主)，開始出現(xiàn)第一個(gè)谷峰.第2周期后，內(nèi)源呼吸作用開始減弱，由此產(chǎn)生的氣量隨之減少，使得總產(chǎn)氣量隨之減少，以至于出現(xiàn)第一個(gè)谷底.從第3周期開始，血清瓶中富集培養(yǎng)的降解木聚糖細(xì)菌開始增多，使得木聚糖降解效果明顯增強(qiáng)，由此通過水解產(chǎn)生的單糖并形成甲烷的份額出現(xiàn)跳躍式上升，于第5、6周間出現(xiàn)第2個(gè)谷峰.木聚糖降解率提高也意味著被水解成的單糖轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性有機(jī)酸(VFAs)的程度得以增強(qiáng)，導(dǎo)致pH開始下降，最終抑制了產(chǎn)甲烷細(xì)菌的活性，使產(chǎn)氣量不斷下降，以至于出現(xiàn)第2個(gè)谷底.

　　實(shí)際污泥與消化污泥產(chǎn)氣量高低略微不同的曲線表明，兩種種泥中均存在著可降解木聚糖的微生物，但消化種泥中因厭氧培養(yǎng)而含量較高.因此，在隨后投加富集木聚糖富集微生物實(shí)驗(yàn)中選擇了厭氧消化培養(yǎng)種泥.

　　3.2 木聚糖酶活性

　　從第6周期開始，每周期開始檢測(cè)并計(jì)算系統(tǒng)中木聚糖酶活性狀況，結(jié)果如圖 5所示.與圖 3繪制數(shù)據(jù)處理相同，實(shí)際污泥與消化污泥酶活性曲線均以3組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求平均值繪制而成，與圖 3對(duì)應(yīng)一致.

 圖 5 木聚糖酶活性趨勢(shì)圖

　　圖 5顯示，兩組空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)中酶活性均保證不變并維持在一很低數(shù)值，說明因空白樣中未投加木聚糖而使得其中可降解木聚糖微生物未能得到富集培養(yǎng).相比之下，投加木聚糖的6組血清瓶中酶活性均顯示出趨勢(shì)一致的上升勢(shì)頭，說明其中已成功培養(yǎng)并富集到相當(dāng)數(shù)量可降解木聚糖的微生物，這與圖 3顯示的產(chǎn)氣量變化曲線變化趨勢(shì)一致.實(shí)際污泥與消化污泥酶活性平均值顯示均是先穩(wěn)定增長(zhǎng)，至第8周期時(shí)趨于平穩(wěn)，說明了在整個(gè)富集培養(yǎng)過程中，可降解木聚糖微生物數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)至穩(wěn)定.此外，消化污泥酶活性略高于實(shí)際污泥亦說明，消化種泥中可降解木聚糖微生物數(shù)量略多，與圖 3產(chǎn)氣量結(jié)果推測(cè)一致.

　　3.3 微生物鑒定

　　3.3.1 細(xì)菌形態(tài)觀察

　　對(duì)兩種不同種泥富集獲得 的污泥和上清液各取1 mL并稀釋10倍后，取一滴 至載玻片上;風(fēng)干后用結(jié)晶紫染色1 min，并用蒸餾水洗凈后再次風(fēng)干;置載玻片于顯微鏡下觀察，觀察到如圖 6所示的結(jié)果.

　　圖 6顯示，兩種種泥富集培養(yǎng)獲得木聚糖降解細(xì)菌均為游離分散狀態(tài).其中，實(shí)際污泥富集后的細(xì)菌形態(tài)主要為桿狀和球狀，即，細(xì)菌主要以球狀細(xì)菌及桿狀細(xì)菌為主;消化污泥中的細(xì)菌形態(tài)為球狀、桿狀還有少量絲狀，即，細(xì)菌除球狀細(xì)菌及桿狀細(xì)菌外，也有少量絲狀細(xì)菌.由細(xì)菌鑒定知識(shí)可知，從形態(tài)學(xué)角度只能確定出富集獲得微生物為梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌和擬桿菌種的一種或多種，但并不能確切甄別出到底屬于哪一種或哪幾種.因此，只有分子生物學(xué)方法才能具體鑒定出菌種的類別.

 圖 6 富集污泥中細(xì)菌形態(tài)(a.實(shí)際污泥；b. 消化污泥)

　　3.3.2 FISH實(shí)驗(yàn)

　　富集獲得細(xì)菌菌種經(jīng)FISH鑒定后結(jié)果示于圖 7.圖 7顯示，兩張圖片中均有綠色出現(xiàn)，說明富集獲得微生物中梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬同時(shí)存在.此外，圖 7a顯示出較圖 7b多的綠色面積，說明富集獲得的微生物中以梭狀芽孢桿菌為主.由此可以斷定，富集獲得的微生物以梭狀芽孢桿菌為主，同時(shí)含有芽孢桿菌，為兩者的混合物.

 圖 7 FISH圖像(圖中CY3標(biāo)記探針CST440和BCE182為綠色，用于檢測(cè)降解木聚糖微生物；CY5標(biāo)記的探針為紅色，用于標(biāo)記所有微生物)

　　3.4 微生物活性比例(LIVE/DEAD)

　　LIVE/DEAD染色實(shí)驗(yàn)顯微圖像結(jié)果示于圖 8.根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以得出，富集獲得的微生物活性分別為：實(shí)際污泥83.6%、消化污泥92.8%.這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果足以說明，實(shí)際污泥與消化污泥中細(xì)菌存活率均保持在很高水平，具有很高活性.具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

 圖 8 LIVE/DEAD顯微圖像(a. 實(shí)際污泥；b.消化污泥; 圖中綠色為活菌；紅色為死菌；黃色為兩種熒光顏色疊加效果)

　　4 結(jié)論

　　通過兩種不同污泥投加同一底物——木聚糖進(jìn)行可降解木聚糖微生物富集培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)得知，無論是從污水處理廠剩余污泥中還是實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐厭氧培養(yǎng)污泥中均可富集到相當(dāng)數(shù)量(前者略低于后者)的可降解木聚糖微生物，說明污泥中至少存在著可厭氧降解纖維素和半纖維素的微生物.通過FISH與LIVE/DEAD實(shí)驗(yàn)可知，富集獲得的木聚糖降解細(xì)菌處于游離分散狀態(tài)，為梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬的混合物，以梭狀芽孢桿菌為主.從兩種不同種泥中獲得的富集微生物活性分別為：實(shí)際污泥83.6%，消化污泥92.8%，說明富集出的微生物具有很高的細(xì)菌活性.