1 引言

　　我國(guó)紡織印染行業(yè)日產(chǎn)3×106~4×106 m3印染廢水，占整個(gè)工業(yè)廢水的35%，但印染廢水回用率不足10%(張斌等，2011).大量未經(jīng)處理的印染廢水直接排放到環(huán)境中，導(dǎo)致系列嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題.印染廢水較高的COD值和BOD值將大量消耗水體中的溶解氧，影響水環(huán)境中生物的生存;對(duì)水體動(dòng)物具有直接的致死、致畸毒性作用;此外，還會(huì)導(dǎo)致水體濁度升高，影響水生植物的光合作用，繼而改變局部水體生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈.

　　印染廢水的處理工藝，從傳統(tǒng)的理化處理工藝，逐漸發(fā)展出物理-生物處理工藝或化學(xué)-生物處理工藝，生物法處理工藝和酶法處理工藝.基于白腐菌及其產(chǎn)生的漆酶開發(fā)出的脫色工藝，是當(dāng)今生物法或酶法處理印染廢水的主流工藝(張曉昱等，2006;詹琪等，2014).然而，漆酶的催化活性高度依賴某些氧化還原介質(zhì)(如1-hydroxybenzotriazole，HBT等)，因此在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，漆酶介導(dǎo)的脫色工藝，常常須向反應(yīng)體系中加入各種氧化還原介質(zhì)，以提高漆酶的脫色效果.上述介質(zhì)的加入，在增加企業(yè)生產(chǎn)成本的同時(shí)，還導(dǎo)致對(duì)環(huán)境的二次污染.

　　強(qiáng)氧化劑過(guò)氧乙酸，在降解環(huán)境污染物方面，具有良好的使用效果，但過(guò)氧乙酸作為一種易爆的危險(xiǎn)化學(xué)品，大規(guī)模制備、貯存及運(yùn)輸條件苛刻，對(duì)一般企業(yè)而言，存在較高的難度.以乙酸乙酯和過(guò)氧化氫為底物，利用過(guò)水解酶(Perhydrolase)催化合成過(guò)氧乙酸(圖 1)，具有較好的安全性和易操控性.酶法催化合成過(guò)氧乙酸耦合過(guò)氧乙酸(原位)氧化各類底物的酶法-化學(xué)聯(lián)合催化工藝，已在醫(yī)療廢水的處理、環(huán)氧化合物的合成、油脂深加工、木質(zhì)素降解等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用效果和前景.本文報(bào)道本實(shí)驗(yàn)室自主制備的過(guò)水解酶酶法催化合成過(guò)氧乙酸及其原位氧化活性艷藍(lán)KN-R(Remazol Brilliant Blue KN-R，RBBR)的脫色工藝.

 圖 1 過(guò)水解酶催化合成過(guò)氧乙酸的方程式 

　　2 材料與方法

　　2.1 化學(xué)試劑及產(chǎn)酶菌株

　　活性艷藍(lán)KN-R購(gòu)自天津希恩思生化科技有限公司;2-氯-5，5-二乙基-1，3-環(huán)己二酮(Monochlorodimedone，MCD)購(gòu)自Alfa Aesar-A Johnson Matthey Company;乙酸乙酯、溴化鈉和過(guò)氧化氫均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;HisTrap HP(5 mL)購(gòu)自GE Healthcare公司;標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司.其他試劑均為市售分析純.

　　攜帶過(guò)水解酶編碼基因的重組Escherichia coli BL21(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，卡那霉素抗性.

　　2.2 過(guò)水解酶的制備

　　取E. coli BL21(DE3)重組菌株甘油管保藏菌液接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中(含50 μg · mL-1卡那霉素)，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，活化菌種.將活化后的菌種轉(zhuǎn)接到200 mL LB液體培養(yǎng)基中(含50 μg · mL-1卡那霉素，1 L三角瓶)，30 ℃培養(yǎng)至 OD600達(dá)到0.6~0.9.向培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為1 mmol · L-1，誘導(dǎo)過(guò)水解酶基因的表達(dá).16 h后離心收集菌體.菌體重懸于pH 7.4，20 mmol · L-1 NaH2PO4-Na2HPO4，20 mmol · L-1咪唑，500 mmol · L-1 NaCl的緩沖溶液中，超聲裂解細(xì)胞.細(xì)胞裂解液10625 × g離心10 min，收集上清，用0.22 μm超濾膜過(guò)濾后作為粗酶液進(jìn)行純化.

　　以0.5 mL · min-1的上樣速度將粗酶液樣品加到HisTrap HP層析柱中，先用上樣緩沖溶液(pH 7.4，含20 mmol · L-1 Na2HPO4-NaH2PO4，20 mmol · L-1 咪唑，500 mmol · L-1氯化鈉)洗脫10個(gè)柱體積，再用洗脫液(pH 7.4，含20 mmol · L-1 Na2HPO4-NaH2PO4，500 mmol · L-1咪唑，500 mmol · L-1氯化鈉)以1 mL · min-1的流速線性梯度洗脫層析柱60 min.以3 mL · 試管-1分部收集洗脫液，分別通過(guò)酶活測(cè)定和SDS-PAGE電泳檢測(cè)洗脫液，收集具有過(guò)水解酶酶活的洗脫液，合并，再用pH 7.4，50 mmol · L-1 Na2HPO4-NaH2PO4的緩沖溶液平衡.

　　2.3 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定及酶活性的測(cè)定

　　過(guò)水解酶的純度及相對(duì)分子量采用SDS-PAGE檢測(cè)，分離膠濃度為12%.純化后的蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用Bradford法進(jìn)行測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

　　過(guò)水解酶酶活的測(cè)定參照Yin和Kazlauskas(2012)的方法進(jìn)行，具體反應(yīng)體系如下：pH7.4，20 mmol · L-1 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中，依次加入終濃度為817.16 mmol · L-1的乙酸乙酯，149 mmol · L-1的溴化鈉，適量的酶液，0.047 mmol · L-1 MCD和0.01 mol · L-1過(guò)氧化氫，40 ℃下反應(yīng)5 min.在上述條件下，每min減少1 μmol MCD所需要的酶量，定義為1個(gè)酶活單位(U)(在此條件下，ε290= 2.03×104 L · mol-1 · cm-1).

　　2.4 活性艷藍(lán)KN-R最大吸收光譜的測(cè)定

　　用 UV-2600 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)70 mg · L-1的RBBR在可見(jiàn)光波段(400~800 nm)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，檢測(cè)RBBR的最大吸收波長(zhǎng)λmax.在最大吸收波長(zhǎng)λmax下測(cè)定并繪制RBBR濃度對(duì)吸光度Abs的標(biāo)準(zhǔn)曲線(RBBR濃度范圍：10~180 mg · L-1).

　　2.5 活性艷藍(lán)KN-R的脫色試驗(yàn)和脫色率的計(jì)算

　　脫色基準(zhǔn)反應(yīng)體系總體積為5 mL，反應(yīng)時(shí)間為6 h，反應(yīng)體系的緩沖溶液為20 mmol · L-1的磷酸氫二鈉-檸檬酸，反應(yīng)溫度為室溫(26~28 ℃).基準(zhǔn)反應(yīng)體系為：20 mmol · L-1的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，80 mg · L-1的RBBR，3.0 U · 反應(yīng)-1的過(guò)水解酶添加量、0.8 mol · L-1的乙酸乙酯、0.01 mol · L-1的過(guò)氧化氫.

　　在單因子實(shí)驗(yàn)中，分別改變體系中的某一因子，而其他因子不變，以此考察pH、過(guò)水解酶添加量、染料濃度、乙酸乙酯與過(guò)氧化氫的摩爾比率等對(duì)脫色效果的影響.

　　RBBR脫色率的計(jì)算公式：脫色率(%)=(C0-Ct)/C0×100%，C0、Ct分別表示初始時(shí)刻和反應(yīng)終止后，反應(yīng)體系中的RBBR濃度.采用高溫滅活后的過(guò)水解酶作為對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)組脫色率數(shù)據(jù)均為減去對(duì)照組脫色率后的數(shù)值，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，并計(jì)算均方差.

　　2.6 正交優(yōu)化試驗(yàn)

　　根據(jù)上述單因子試驗(yàn)獲得的初步結(jié)果，進(jìn)行四因子三水平的正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化過(guò)水解酶對(duì)RBBR的脫色工藝.

　　2.7 活性艷藍(lán)脫色動(dòng)力學(xué)及放大實(shí)驗(yàn)

　　在正交實(shí)驗(yàn)獲得的最優(yōu)脫色條件下，分別測(cè)定不同處理時(shí)間對(duì)染料脫色效果的影響，測(cè)定過(guò)水解酶催化RBBR脫色的動(dòng)力學(xué)曲線.

　　在最優(yōu)脫色條件下，將脫色體系放大到250 mL(50倍放大)，檢測(cè)過(guò)水解酶催化的脫色效果.

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 過(guò)水解酶的純化及比活力測(cè)定

　　經(jīng)過(guò)HisTrap HP層析柱純化后的過(guò)水解酶SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖 2所示.電泳結(jié)果顯示為單一條帶，分子量大小為28 kDa，與預(yù)期大小一致.酶活測(cè)定表明，該過(guò)水解酶比活力為7.53 U · mg-1，高于已報(bào)道的其他過(guò)水解酶的比活力.

 圖 2 過(guò)水解酶的SDS-PAGE電泳分析 

　　3.2 染料RBBR的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定

　　RBBR的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果如圖 3所示.在595 nm處，染料RBBR有最大吸收峰，與Enayatzamir 等(2009)報(bào)道的最大吸收波長(zhǎng)一致.在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，均以595 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).RBBR的濃度在10~180 mg · L-1范圍內(nèi)，吸光度Abs與RBBR濃度呈良好的線性關(guān)系.

 圖 3 染料RBBR的吸收波長(zhǎng)掃描圖 

　　3.3 不同因子對(duì)過(guò)水解酶脫色效果的影響

　　本實(shí)驗(yàn)使用的比色皿體積為5 mL，為方便后續(xù)檢測(cè)，確定了5 mL反應(yīng)體積的基準(zhǔn)反應(yīng)體系.為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果在后續(xù)實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中具有指導(dǎo)價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)溫度選擇室溫(福州地區(qū)常平均溫度在25℃左右).參照過(guò)水解酶酶活測(cè)定體系中的底物濃度設(shè)定基準(zhǔn)反應(yīng)體系中的乙酸乙酯和過(guò)氧化氫的初始濃度.在活性艷蘭KN-R標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)(中間濃度區(qū)段)，作為基準(zhǔn)反應(yīng)體系中活性艷蘭KN-R的初始濃度.為方便實(shí)驗(yàn)操作和比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以在一個(gè)工作日(8 h)的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，脫色率在80%~90%之間，確定基準(zhǔn)反應(yīng)體系中的初始加酶量(在前期調(diào)研其他酶制劑介導(dǎo)的染料脫色效果時(shí)，我們注意到大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的脫色率在80%~90%之間).

　　在5 mL基準(zhǔn)反應(yīng)體系中，緩沖溶液的pH、添加的酶劑量、乙酸乙酯與過(guò)氧化氫的摩爾比、RBBR濃度等因子對(duì)過(guò)水解酶脫色效果的影響如圖 4所示.

 圖 4 各種單一因子對(duì)RBBR脫色效果的影響(a. pH對(duì)脫色效果的影響；b. 過(guò)水解酶劑量對(duì)脫色效果的影響；c. 乙酸乙酯與過(guò)氧化氫摩爾比率對(duì)脫色效果的影響；d. RBBR濃度對(duì)脫色效果的影響)

　　在pH 3~5的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，脫色效果逐漸增強(qiáng);在pH=5時(shí)脫色率最高.隨著pH的進(jìn)一步提高，脫色效果逐漸降低(圖 4a).pH對(duì)過(guò)水解酶脫色效果的影響，是多重效應(yīng)共同作用的結(jié)果：①pH對(duì)過(guò)水解酶活性的影響.過(guò)水解酶的最適pH為6.0(實(shí)驗(yàn)室尚未發(fā)表數(shù)據(jù))，在pH 3~6的范圍內(nèi)，過(guò)水解酶的活性隨著pH的升高而升高;②pH對(duì)過(guò)氧化氫穩(wěn)定性的影響.過(guò)氧化氫在pH 3.5~4.5時(shí)最穩(wěn)定.作為過(guò)水解酶底物之一的過(guò)氧化氫的穩(wěn)定性，將直接影響到產(chǎn)物過(guò)氧乙酸的生成，從而間接影響到過(guò)水解酶的脫色效果;③pH對(duì)RBBR穩(wěn)定性的影響.在酸性或堿性pH條件下，中性的RBBR轉(zhuǎn)化為帶上正電荷或負(fù)電荷的離子型化合物，有助于RBBR的分解(Mahmoud et al., 2007).

　　在5 mL基準(zhǔn)反應(yīng)體系中，在0.5~25 U · 反應(yīng)-1的濃度范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)體系中酶劑量的增大，脫色效果逐漸增強(qiáng).在0.5~8 U · 反應(yīng)-1的濃度范圍內(nèi)，酶劑量與脫色率呈線性關(guān)系;當(dāng)酶劑量高于16 U · 反應(yīng)-1的范圍后，脫色率增高值極為有限，呈零級(jí)反應(yīng)(圖 4b).

　　在5 mL基準(zhǔn)反應(yīng)體系中，乙酸乙酯對(duì)過(guò)氧化氫的摩爾比率對(duì)RBBR的分解有較大的影響.當(dāng)摩爾比率低于40 ∶ 1時(shí)，RBBR的脫色率顯著降低(圖 4c).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)過(guò)水解酶對(duì)過(guò)氧化氫的親和力大于對(duì)乙酸乙酯的親和力.過(guò)氧化氫作為一種強(qiáng)氧化劑，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活.因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，構(gòu)建能耐受高濃度過(guò)氧化氫的過(guò)水解酶，有助于更好地大規(guī)模推廣過(guò)水解酶在印染廢水處理中的應(yīng)用.(2)反應(yīng)過(guò)程中，維持高濃度的乙酸乙酯是必要的.因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可考慮選用三酰甘油酯或二酰甘油酯替換乙酸乙酯，既可降低羧酸酯對(duì)過(guò)氧化氫的摩爾比，又有助于提高過(guò)水解酶在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性(在乙酸乙酯工藝中，產(chǎn)物中有乙醇生成;而三酰甘油酯或二酰甘油酯工藝中，產(chǎn)物為甘油).

　　在5 mL基準(zhǔn)反應(yīng)體系中，RBBR濃度在20~100 mg · L-1的濃度范圍內(nèi)，被分解掉的RBBR濃度隨初始濃度的增加而增加.RBBR濃度超過(guò)100 mg · L-1后，被分解掉的RBBR濃度增速減緩，呈零級(jí)反應(yīng)態(tài)勢(shì)(圖 4d).

　　3.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過(guò)水解酶脫色工藝

　　對(duì)反應(yīng)體系的pH、加酶量、乙酸乙酯與過(guò)氧化氫的摩爾比率和RBBR濃度4個(gè)因子進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表 1)表明：①對(duì)RBBR脫色率影響大小依次為B>D>C>A，即過(guò)水解酶劑量>RBBR濃度>乙酸乙酯與過(guò)氧化氫的摩爾比率>反應(yīng)體系的pH;②最優(yōu)組合為A2B3C2D1，即反應(yīng)體系的pH 5.0，加酶量為20 U · 反應(yīng)-1，乙酸乙酯對(duì)過(guò)氧化氫的摩爾比率為40 ∶ 1和RBBR濃度為80 mg · L-1.在最優(yōu)條件下，在5 mL反應(yīng)體系中進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，RBBR脫色率為81.11%.

 表 1 RBBR脫色的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)結(jié)果及分析

　　3.5 過(guò)水解酶脫色動(dòng)力學(xué)測(cè)定

　　在5 mL反應(yīng)體系中，過(guò)水解酶脫色動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖 5所示.在反應(yīng)的初始階段，具有極快的脫色速度(在反應(yīng)的初始30 min，體系中超過(guò)67%的RBBR被降解);隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乙酸乙酯、過(guò)氧化氫及RBBR濃度逐漸降低，導(dǎo)致脫色率增速逐漸減緩.24 h后脫色率達(dá)到91.96%.RBBR的氧化脫色動(dòng)力學(xué)符合兩相指數(shù)衰減(Two phase exponential decay)模型(Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)軟件Nonlinear Regression擬合結(jié)果)，脫色動(dòng)力學(xué)方程為：Y=12.32+65.82e(-9.61X)+21.86e(-0.2127X)(Y為脫色率，X為處理時(shí)間，R2=0.9986).

 圖 5 過(guò)水解酶原位合成過(guò)氧乙酸氧化RBBR脫色動(dòng)力學(xué)分析

　　3.6 250 mL反應(yīng)體系試驗(yàn)結(jié)果

　　在最優(yōu)工藝條件下，將反應(yīng)體系放大50倍(250 mL)后，進(jìn)行脫色試驗(yàn).以滅活的過(guò)水解酶作為對(duì)照組試驗(yàn);反應(yīng)24 h，測(cè)定RBBR的脫色率.放大體系試驗(yàn)的RBBR脫色效果如圖 6所示.和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組具有非常明顯的脫色效果：溶液濁度(顏色)變淺，瓶底出現(xiàn)明顯的絮狀沉淀;24 h后RBBR的脫色率為84.55%，較5 mL反應(yīng)體系，略有下降，具體原因及機(jī)制還有待深入調(diào)查.

 圖 6 過(guò)水解酶在最適條件下在250 mL反應(yīng)系統(tǒng)中催化PBBR氧化脫色的效果

　　由于酶制劑的過(guò)水解活性(Perhydrolysis activity)屬于酶的催化混亂性活性(Promiscuous activity)，因此，常常需要加入過(guò)量的底物，以推動(dòng)反應(yīng)向正反應(yīng)反向進(jìn)行.按照優(yōu)化后的脫色體系，處理每噸污水需要加入274 mL的過(guò)氧化氫，而乙酸乙酯的量則達(dá)到反應(yīng)體系體積的4%(V/V).因此單就一個(gè)批次的污水處理而言，成本高于現(xiàn)有污水處理方法的運(yùn)行成本.但在實(shí)際操作過(guò)程中，處理后的污水，形成大量的絮狀沉淀物(圖 6).經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單沉淀濾過(guò)后，只需向上清液中補(bǔ)加極少量的過(guò)氧化氫和乙酸乙酯，即可進(jìn)行下一批次的污水處理，脫色效果基本維持不變.在實(shí)驗(yàn)室階段，通過(guò)酶制劑的固定化技術(shù)，已實(shí)現(xiàn)6個(gè)批次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù)，后續(xù)論文將發(fā)表).事實(shí)上，利用三乙酸甘油酯(Glyceryl triacetate，GTA)替換乙酸乙酯，底物濃度可以進(jìn)一步降低到現(xiàn)有濃度的1/3.通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化工藝和酶制劑的固定化技術(shù)等措施，可實(shí)現(xiàn)底物的多批次循環(huán)利用，從而實(shí)現(xiàn)本技術(shù)路線的低成本運(yùn)行. 具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 結(jié)論

　　1)利用過(guò)水解酶原位制備過(guò)氧乙酸進(jìn)行印染廢水(RBBR模型)處理，是完全可行的.通過(guò)酶促反應(yīng)(過(guò)氧乙酸的合成)和化學(xué)氧化反應(yīng)(過(guò)氧乙酸氧化RBBR脫色)耦合的兩階段反應(yīng)工藝，獲得了較好的脫色效果.在5 mL反應(yīng)體系中，6 h脫色率為81.11%;24 h脫色率為91.96%(由于對(duì)照組具有3%~5%的數(shù)值，因此實(shí)際脫色率已超過(guò)95%).

　　2)該工藝中，不同單一因子對(duì)RBBR脫色率的影響依次為：過(guò)水解酶劑量>RBBR濃度>乙酸乙酯與過(guò)氧化氫的摩爾比率>反應(yīng)體系的pH;最優(yōu)組合為：反應(yīng)體系的pH=5.0，加酶量為20 U · 反應(yīng)-1，乙酸乙酯對(duì)過(guò)氧化氫的摩爾比率為40 ∶ 1和RBBR濃度為80 mg · L-1.

　　3)在最優(yōu)條件下，250 mL反應(yīng)體系中，24 h后RBBR脫色率為84.55%;較5 mL反應(yīng)體系中的脫色率略有下降，具體原因及機(jī)制還有待深入調(diào)查.

　　致謝(Acknowledgement): 感謝國(guó)家留學(xué)基金管理委員會(huì)的資助;感謝瑞典皇家理工學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)系的Hult Karl教授、Martinelle Mats博士及Hendil-Forssell Peter博士在過(guò)水解酶研究方面的指導(dǎo).