1 引言

　　高效、穩(wěn)定的亞硝化反應(yīng)是運(yùn)行SHARON、ANAMMOX、CANON等新型生物脫氮工藝的先決條件.本課題組的前期研究表明，培養(yǎng)具有亞硝化功能的完全自養(yǎng)型好氧顆粒污泥(簡稱“亞硝化顆粒污泥”)，有利于實現(xiàn)對氨氧化菌(AOB)的高度富集，以突破當(dāng)前限制“亞硝化路線”的技術(shù)瓶頸.

　　作為實現(xiàn)污泥顆�；�的關(guān)鍵步驟，胞外聚合物(EPS)的累積不僅是微生物適應(yīng)外界環(huán)境變化、保障自身聚集生長的必要條件，也是影響污泥形態(tài)結(jié)構(gòu)與降解活性的重要因素.因此，建立環(huán)境因素、污泥性狀與EPS組成的相互關(guān)系，對完善、優(yōu)化現(xiàn)有污水生物處理理論與技術(shù)具有重大意義.值得注意的是，EPS的化學(xué)組成與提取方法、污泥種類密切相關(guān).目前，國內(nèi)外鮮有關(guān)于亞硝化顆粒污泥EPS組成特性的報道.因此，有必要選出合適的提取方法并對其EPS組成進(jìn)行分析.

　　本研究以異養(yǎng)型好氧顆粒污泥(AGS)、普通活性污泥(AS)和厭氧顆粒污泥(AnGS)為參照，分別考察離心法、加熱法、熱堿法、甲醛-NaOH法和甲醛-熱堿法對亞硝化顆粒污泥(GNS)中EPS組分的提取效果，以選出最佳方法，并利用蛋白質(zhì)(PN)/多糖(PS)含量測定、三維熒光(3D-EEMs)與傅里葉紅外(FT-IR)光譜等表征手段，比較分析GNS有別于其他污泥樣品的EPS組成特性，以期為探究完全自養(yǎng)型好氧顆粒污泥的形成機(jī)理與形態(tài)特征提供參考.

　　2 材料與方法

　　2.1 污泥樣品

　　本研究所選污泥樣品的種類、來源與性質(zhì)如表 1所示.其中，AS是實驗室培養(yǎng)GNS和AGS的接種污泥.

表 1 4類污泥樣品的來源與性質(zhì)

　　2.2 EPS的提取方法

　　2.2.1 樣品預(yù)處理

　　采用離心預(yù)處理去除污泥樣品液中的可溶性有機(jī)物.取20 mL污泥液，在4 ℃、10000 r·min-1條件下離心10 min，棄去上清液，并使固體重新懸浮于中性磷酸緩沖溶液(含2 mmol·L-1 Na3PO4、4 mmol·L-1 NaH2PO4、9 mmol·L-1 NaCl和1 mmol·L-1 KCl)中，重復(fù)上述操作1次，所得樣品待用.隨后，對所有顆粒污泥均進(jìn)行了超聲處理，即在冰水浴、功率35 W條件下，超聲4 min.

　　2.2.2 EPS的提取方法與流程

　　為保證研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道的可比性，本文選擇了5種常用的EPS提取方法，并建立對照法，具體操作過程如圖 1所示.

  圖 1 EPS提取方法的流程

　　2.3 EPS的組分分析

　　在本研究中，EPS總量是指PN與PS質(zhì)量濃度之和，單位為 mg·g-1(以VSS計).蛋白質(zhì)含量采用Lowry法測定，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì).多糖濃度采用苯酚-硫酸法測定，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì).PN、PS的測定結(jié)果取3次平均值.污泥濃度(VSS)采用標(biāo)準(zhǔn)重量法測定.EPS提取液中的總有機(jī)碳(TOC)采用耶拿元素分析儀(HT1300-microN/C型)測定，并作為表征污泥EPS總量的輔助性指標(biāo).

　　三維熒光(3D-EEMs)光譜測定步驟：以Milli-Q純水為空白，使用1 cm熒光池在Cary Eclipse熒光分光光度計的同步掃描模式下進(jìn)行分析.光電倍增管電壓(PMT)為500 V，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長(λEx)和發(fā)射波長(λEm)分別為200~400 nm和200~600 nm，掃描間隔均為10 nm，掃描速度1200 nm·min-1，峰強(qiáng)度最大量程為1000 A.U..采用Origin 8.5繪制等高線圖.

　　傅里葉紅外(FT-IR)光譜測定步驟：將EPS提取液置于冷凍干燥機(jī)中24 h，對固體進(jìn)行仔細(xì)研磨，并按1 ∶ 100的質(zhì)量比與高純度KBr混合后壓片，使用Thermo傅里葉變換紅外光譜(SCIENTIFIC型)進(jìn)行分析.

　　3 結(jié)果

　　3.1 亞硝化顆粒污泥EPS的提取結(jié)果

　　如表 2所示，對于亞硝化顆粒污泥而言，各提取方法所獲得的EPS總量遵循：熱堿法>甲醛-NaOH法>加熱法>甲醛-熱堿法>離心法>對照法.對參照污泥的提取結(jié)果也大體如此.

 表 2 采用不同方法對4類污泥樣品EPS的提取結(jié)果

　　作為顆粒污泥中重要的結(jié)構(gòu)性組分，蛋白質(zhì)和多糖通�？梢哉嫉轿勰郋PS總量的70%以上.由圖 2可知，無論采用何種提取方法，亞硝化顆粒污泥EPS中PN/PS比值始終大于1.其中，離心法是一種較為溫和的提取方法，其結(jié)果僅代表松散結(jié)合的胞外聚合物(LB-EPS)含量，后者對污泥的絮凝、脫水性能有直接影響(Li et al., 2007;王紅武等，2004).相比之下，經(jīng)熱堿法處理后，污泥有明顯的破胞現(xiàn)象，提取液呈棕黃色，TOC濃度很高，大量蛋白質(zhì)的溶出導(dǎo)致PN/PS比值高達(dá)8.4.參照污泥的EPS提取過程也存在類似現(xiàn)象，這與張麗麗等(2007)對好氧顆粒污泥EPS提取方法的研究結(jié)果一致.同樣使PN/PS比值偏高的還有加熱法，具體表現(xiàn)為對多糖的提取效果較差.如果預(yù)先投加適量甲醛，起到固定與緩沖作用，將有效降低高溫、強(qiáng)堿對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使水相中DNA等胞內(nèi)物質(zhì)含量與胞漿酶(G6PDH)活性均處于較低水平.在本研究中，甲醛-NaOH法對污泥EPS的提取量僅次于熱堿法，且PN/PS比值與對照組結(jié)果接近.根據(jù)文獻(xiàn)報道，甲醛-NaOH法提取的DNA濃度在0.1~3.3 mg·g-1(以VSS計)，遠(yuǎn)小于熱堿法和加熱法的對應(yīng)值，但高于離心法的0.05~0.5 mg·g-1(以VSS計).本研究提出的甲醛-熱堿法對亞硝化顆粒污泥EPS的提取結(jié)果與甲醛-NaOH法相當(dāng)，提取時間縮短了近60%，但甲醛-熱堿法對參照污泥中蛋白質(zhì)的提取效果并不理想.

 圖 2 4類污泥樣品EPS中蛋白質(zhì)與多糖的含量 

　　由表 2可知，當(dāng)采用相同的提取方法時，4類污泥的EPS含量大體遵循：AGS>AS>AnGS>GNS.出于維持特殊結(jié)構(gòu)的需要，好氧顆粒污泥的EPS以緊密結(jié)合的胞外聚合物(TB-EPS)為主，其總量遠(yuǎn)高于活性污泥的水平.其次，當(dāng)污泥從好氧轉(zhuǎn)至厭氧環(huán)境中，部分EPS將以碳源、能源的形式被消耗掉(鄒小玲等，2010)，因而，厭氧顆粒污泥的EPS總量不高，并含有較多的腐殖酸類物質(zhì).相比之下，比生長速率僅為0.32~0.76 d-1的AOB等自養(yǎng)菌常被認(rèn)為不能產(chǎn)生充足的EPS，以保障其獨(dú)立完成顆�；�過程.即使在穩(wěn)定運(yùn)行100 d以上的完全自養(yǎng)硝化顆粒污泥中，異養(yǎng)菌仍具有一定的活性，并對維持污泥結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起到積極作用(張子健等，2010).最近，戴昕(2014)利用PCR-DGGE、454高通量測序和qPCR等分子生物學(xué)手段證明，AGS形成過程中定向分泌的胞外蛋白質(zhì)主要來自高度富集的Zoogloea spp.菌株.而Wu等(2012)的研究也表明，將反應(yīng)器進(jìn)水COD/NH4+-N控制在1~2之間，20 d內(nèi)即可獲得成熟的硝化顆粒污泥，高比例的多糖成分對于生長周期較長、附著能力較差的硝化細(xì)菌起到了很好的固定作用.本研究發(fā)現(xiàn)，亞硝化顆粒污泥的EPS組成也具有類似特點(diǎn).當(dāng)采用甲醛-NaOH法進(jìn)行提取時，GNS的PS/PN比例為0.77，遠(yuǎn)高于其他污泥樣品.

　　3.2 亞硝化顆粒污泥EPS的三維熒光分析

　　在統(tǒng)一采用甲醛-NaOH法的前提下，對4類污泥樣品的EPS進(jìn)行三維熒光光譜分析，結(jié)果如圖 3所示.依據(jù)Chen等(2003)總結(jié)的3D-EEMs圖譜分析方法，可以獲得熒光特征峰的相關(guān)參數(shù)，具體見表 3.從圖譜形狀與特征峰位置來看，亞硝化顆粒污泥與異養(yǎng)型好氧顆粒污泥的結(jié)果非常接近，強(qiáng)熒光峰均主要來自可溶性微生物代謝產(chǎn)物和芳香類蛋白質(zhì)，這也體現(xiàn)了兩者在顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)上的相似性.盡管普通活性污泥的EPS也含有同類型的熒光峰，但峰強(qiáng)要低得多，這意味著顆粒污泥具有比絮狀污泥更高的微生物活性和更多的結(jié)構(gòu)性蛋白的研究結(jié)果表明，顆粒污泥較絮狀污泥含有更豐富的酪氨酸、色氨酸等芳香 類蛋白，該類物質(zhì)有利于促進(jìn)細(xì)胞聚集和增強(qiáng)顆粒的穩(wěn)定性.另外，本研究選取的好氧顆粒污泥是以簡單化合物為碳源和氮源.因此，好氧顆粒污泥EPS的3D-EEMs圖譜中并未找到厭氧顆粒污泥中常見的類腐殖酸峰.Zhu等(2012)發(fā)現(xiàn)，在污泥顆�；�過程中，類腐殖酸峰的強(qiáng)度呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢，并認(rèn)為除了進(jìn)水水質(zhì)的影響以外，顆粒污泥EPS中腐殖酸的含量與其成熟度存在一定的關(guān)聯(lián)性.

 圖 3 4類污泥樣品EPS的三維熒光圖譜 (等高線表征熒光強(qiáng)度)

表 3 污泥樣品EPS的熒光特性分析

　　3.3 亞硝化顆粒污泥EPS的傅里葉紅外分析

　　在相同前提下，對4類污泥樣品的EPS進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，結(jié)果如圖 4所示.波長在1000 cm-1以內(nèi)的指紋區(qū)特征峰大多由含硫、磷的不飽和鍵發(fā)出，而蛋白質(zhì)、多糖等EPS組分主要集中于1000~1800 cm-1區(qū)間.其中，1070、1296 cm-1附近的特征峰分別由多個C—O不對稱伸縮振動和O—H變形振動引起，均明確指向多糖組分.1454、1610和3430 cm-1則對應(yīng)于蛋白質(zhì)中常見的C—OH、H—N—H和N—H等酰胺類基團(tuán)，1667 cm-1更是與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)Amide III密切相關(guān).

 圖 4 4類污泥樣品EPS的傅里葉紅外光譜圖

　　與3D-EEMs的結(jié)果類似，亞硝化顆粒污泥EPS的紅外特征峰位置與異養(yǎng)好氧顆粒污泥基本一致，但前者的峰強(qiáng)更高.相比之下，普通活性污泥與厭氧顆粒污泥的峰型更為雜亂.這說明污泥顆粒化過程在對微生物種類進(jìn)行選擇性“淘洗”的同時，也簡化了胞外聚合物的組成.對于AnGS而言，EPS中的腐殖酸會在一定程度上干擾PN與PS對應(yīng)特征峰的定位.具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 結(jié)論

　　1)不同方法對亞硝化顆粒污泥EPS的提取總量遵循：熱堿法>甲醛-NaOH法>加熱法>甲醛-熱堿法>離心法>對照法.其中，甲醛-NaOH法能在有效保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時，獲得較高的EPS提取效率，濃度值為(58.4±2.1)mg·g-1(以VSS計).耗時更短的甲醛-熱堿法對亞硝化顆粒污泥同樣適用，但其對參照污泥的提取結(jié)果并不理想.

　　2)在本研究中，亞硝化顆粒污泥的EPS總量最低，這可能與自養(yǎng)菌分泌EPS的能力較弱有關(guān).但在GNS的EPS組分中，PS/PN比值為0.77，遠(yuǎn)高于以異養(yǎng)微生物為主的其他污泥樣品，豐富的多糖成分對于生長周期較長、附著能力較差的氨氧化菌能起到較好的固定作用.

　　3)由3D-EEMs和FT-IR圖譜可知，亞硝化顆粒污泥EPS的熒光特征與異養(yǎng)型好氧顆粒污泥非常類似，特征峰均主要來自可溶性微生物代謝產(chǎn)物(λEx/λEm=250~310 nm/320~380 nm)和芳香類蛋白質(zhì)(λEx/λEm= 200~250 nm/280~380 nm).與普通活性污泥相比，亞硝化顆粒污泥具有更高的微生物活性和更豐富的結(jié)構(gòu)性蛋白，且EPS組成也更為簡單.