人類社會(huì)的快速發(fā)展帶來了一系列的環(huán)境問題, 水環(huán)境污染則是目前最為亟待解決的問題。傳統(tǒng)污水處理方法能夠有效的去除水體中的碳類污染物, 但對(duì)氮磷的去除效果并不理想; 且物理化學(xué)方法處理污水成本較高, 易造成二次污染[1]。

　　微藻生長(zhǎng)過程中對(duì)氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素具有較高的需求, 在污水的氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素的處理方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。隨著各國(guó)學(xué)者研究的不斷深入, 利用微藻處理污水的可行性也得到了證實(shí)。目前的研究主要集中在綠藻門的小球藻(Chlorella)和柵藻(Scenedesmus)以及藍(lán)細(xì)菌上, 其中研究最為廣泛的則是小球藻。一系列的研究表明, 小球藻在不同的初始濃度下都能有效的去除氮磷, 去除率為8%—100%[2]。Wang等[3]的研究還表明小球藻對(duì)氨氮具有一定的耐受能力。此外, 柵藻在污水中氮磷處理方面的能力也受到了廣泛的關(guān)注, González等[4]的研究表明, 柵藻對(duì)污水中氮磷的處理能力與小球藻相似, 且其對(duì)氨氮的去除率要高于小球藻。其他屬的綠藻也能有效地去除污水中的氮磷, 在氮磷比為1.0時(shí)Chlamydomonas reinhardtii能去除污水中42%—55%的氨氮, 使用光生物反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)其去除率更高[5]。雖然小球藻、柵藻等微藻對(duì)污水中氮磷處理能力較高, 但由于其藻體較小, 收集相對(duì)困難, 且在室外條件下易受捕食性的浮游動(dòng)物的污染。

　　絲狀藻藻絲體較大, 細(xì)胞壁較厚, 收集相對(duì)容易, 抗原生動(dòng)物等污染性較強(qiáng), 能在一定程度上提高生物量及污水氮磷的去除效率。研究表明水綿 (Spirogyra sp.)、水網(wǎng)藻(Hydrodictyon reticulatum)、剛毛藻(Cladophora oligoclona)等大型絲狀綠藻在人工合成污水中均能正常生長(zhǎng), 且對(duì)水體中氮磷的去除能力較強(qiáng)[6]。

　　早在1976年就有學(xué)者對(duì)毛枝藻(Stigeocloniumsp.)的鋅耐受能力進(jìn)行了研究, 他們野外采集34株毛枝藻, 在實(shí)驗(yàn)室條件下探索鋅對(duì)毛枝藻的生長(zhǎng)抑制臨界值和致死臨界值, 結(jié)果表明絕大部分毛枝藻對(duì)鋅具有較強(qiáng)的耐受能力, 其最大生長(zhǎng)抑制臨界值達(dá)到8.66 mg/L[7]。在Pawlik-Skowrońska[8]的研究中, 毛枝藻在含有鉛、鉻、鋅三種金屬離子的人工污水中均有絡(luò)合物產(chǎn)生, 表明毛枝藻對(duì)鉛、鉻、鋅均具有一定的去除能力。此外, Liu等[9]以毛枝藻和克里藻(Klebsormidium sp.)為研究對(duì)象, 就其對(duì)污水中氮磷的去除能力進(jìn)行了研究。結(jié)果表明, 兩株毛　枝藻S-1和S-2在氮起始濃度為47.2 mg/L, 磷起始濃度為11.6 mg/L的人工污水中氮的去除率分別為79%和>99%, 磷的去除速率均相對(duì)較低, 分別為36%和54%, 但在自然污水中其磷去除率則分別為88%和93%, 與以小球藻和柵藻為主要群落組成部分的原生污水藻群落的氮磷去除能力相似, 表明其在污水氮磷處理方面具有較大的前景。

　　微藻在不同氮磷比條件下其生長(zhǎng)及對(duì)污水中氮磷去除率不盡相同[10—12], 且不同微藻對(duì)氨氮的去除能力不同[ 3 — 5 , 13 , 14 ] , 故本研究以兩株毛枝藻HB1617和SHY-370為研究對(duì)象, 探索其在不同的氮磷比條件下, 對(duì)人工污水中氮磷的去除能力, 以及在不同的氨氮初始濃度下對(duì)氨氮的耐受能力。

　　1 材料與方法

　　1.1 毛枝藻SHY-370與HB1617藻種來源及分離純化

　　本實(shí)驗(yàn)所用藻株HB1617采集自湖北宜昌污水口, SHY-370采集自湖北咸寧通ft溪流中。野外采集的藻株經(jīng)無(wú)菌水沖洗后在解剖鏡下挑取單根藻絲, 用刀片切取頂端藻絲, 接種于BBM固體培養(yǎng)基中, 20d后部分接種于裝有100 mL無(wú)菌BBM液體培養(yǎng)基的250 mL柱狀生物反應(yīng)器中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng), 另一部分用解剖針接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行保種。

　　10d后將柱狀生物反應(yīng)器中的藻液轉(zhuǎn)接至直徑5 cm的1100 mL柱狀生物反應(yīng)器中進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)大培養(yǎng)。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

　　1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

　　人工污水配方參考況琪軍等[6]和Xin等[10]的配方以BBM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)(NO{ -N 41 mg/L), 配制無(wú)磷培養(yǎng)基, 再通過添加KH2PO4使其氮磷比分別為2、5、10、20和40。

　　前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHY-370與HB1617的最大氨氮耐受濃度為10 mg/L, 故將氨氮濃度設(shè)為1、3、5和10 mg/L四個(gè)濃度梯度, 在此范圍內(nèi)探究其對(duì)水體中氮磷的吸收能力, 并設(shè)置正常BBM培養(yǎng)基(N/P為0.82)培養(yǎng)組為對(duì)照。氨氮耐受實(shí)驗(yàn)所使用人工污水同樣以BBM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)(P O3{ -P 50 mg/L),配置成無(wú)氮培養(yǎng)基, 通過加入NH4Cl使其NH+-N含量分別為1、3、5和10 mg/L。

　　藻種試驗(yàn)前在直徑5 cm的柱狀光反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)12d, GF/C膜過濾, 無(wú)菌水沖洗5遍洗去原培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(由于毛枝藻在干燥條件下易死亡, 故抽濾時(shí)每次剩余少量液體), 在無(wú)菌水中饑餓培養(yǎng)24h后以0.2 g/L的干重濃度接種至人工污水中每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

　　培養(yǎng)光照由日光燈組提供, 光照強(qiáng)度為50— 60 μmol photons/(m2·s), 光暗比為14h﹕10h; 培養(yǎng)溫度為25℃; 反應(yīng)器中只通入空氣, 實(shí)驗(yàn)過程中各條件保持不變。

　　1.3 Th長(zhǎng)測(cè)定

　　實(shí)驗(yàn)期間, 從第0天起, 每2天取樣1次測(cè)定藻的干重, 繪制生長(zhǎng)曲線。干重測(cè)定方法為: 將濾膜在105℃烘干8h, 放在干燥器中冷卻至室溫稱重, 后取5 mL藻液, 用AP-OIP真空泵及MFS微型過濾系統(tǒng)過濾, 再次105℃烘干8h稱重。

　　生物量濃度公式為:

　　在公式(1)中, DW0為濾膜干重(g); DW1為抽濾過后藻加濾膜的干重(g); V為抽濾的藻液的體積,L。在公式(2)中DWt0為第0天抽濾的藻的干重(g);

　　DWt為第t天抽濾的藻的干重(g); V為抽濾的藻液體積(L); t為培養(yǎng)時(shí)間(d)。在公式(3)中Bt為培養(yǎng)t時(shí)間后的生物量濃度(g/L); B0為初始生物量濃度(g/L);

　　t為培養(yǎng)時(shí)間(d)。

　　1.4 人工污水指標(biāo)測(cè)定

　　NO{ -N (硝態(tài)氮)采用紫外分光光度法(HJ/T346-2007)測(cè)定[15], TP(總磷)的測(cè)定采用鉬酸銨分光光度法(GB11893-89)[16],NH+-N(氨氮)的測(cè)定采用水楊酸分光光度法(HJ536-2009)[17]。

　　1.5 數(shù)據(jù)分析

　　使用origin 9.1作圖, SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析。

　　1 結(jié)果與討論

　　2.1 藻類Th長(zhǎng)狀況

　　如圖 1所示, HB1617與SHY-370植物體均為一列細(xì)胞組成的分枝絲狀體, 主軸與側(cè)枝無(wú)明顯分化,寬度相等。HB1617植物體鮮綠色, 分枝豐富, 通氣狀態(tài)下藻絲相對(duì)較短, 常纏繞成團(tuán)。SHY-370植物體淡綠色, 分枝較HB1617少, 藻絲體較長(zhǎng)。毛枝藻的形態(tài)學(xué)特性使得其在收集及抗污染方面優(yōu)于單細(xì)胞微藻。

　　接種時(shí)為減小平行樣品間誤差, 使用玻璃勻漿器將長(zhǎng)藻絲片段化, 因此接種初期藻絲較短。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng), 藻絲不斷延長(zhǎng)并產(chǎn)生新的分枝。大多數(shù)藻體在污水處理后期生長(zhǎng)代謝仍然旺盛,HB1617藻體色澤鮮綠、SHY-370藻體淡綠、藻體自然伸展, 新生藻絲清晰可見, 培養(yǎng)液內(nèi)幾乎無(wú)污染; 當(dāng)氨氮含量為10 mg/L時(shí), HB1617生長(zhǎng)受到抑制, 培養(yǎng)第4天開始細(xì)胞內(nèi)色素體減少、藻體色澤逐漸變淺, 培養(yǎng)末期藻體幾乎全部死亡, 培養(yǎng)液中有白色絮狀物生成, 可能因培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)菌和其他微型生物大量增殖所致。

　　2.1 在不同初始氨氮濃度條件下兩株毛枝藻的Th長(zhǎng)及其脫氮除磷能力

　　在不同初始氨氮濃度條件下兩株毛枝藻的Th長(zhǎng)狀況 如表 1所示, 在不同初始氨氮濃度條件下, SHY-370在初始氨氮濃度為1、3和5 mg/L時(shí), 比生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異(P>0.05), 且與正常培養(yǎng)基培養(yǎng)(氨氮初始濃度為0)條件下無(wú)明顯差異, 10 mg/L時(shí)其比生長(zhǎng)速率略小于以上3個(gè)初始氨氮濃度條件下, 表明10 mg/L的初始氨氮濃度對(duì)SHY-370的生長(zhǎng)有一定的抑制作用; HB1617與SHY-370生長(zhǎng)狀況相似, 在1、3和5 mg/L三個(gè)初始濃度條件下比生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異(P>0.05), 且與正常培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下無(wú)明顯差異, 初始氨氮濃度為10 mg/L時(shí)其比生長(zhǎng)速率僅為0.01, 表明在此條件下HB1617的生長(zhǎng)受到抑制。

　　初始氨氮濃度為1、3和5 mg/L時(shí)HB1617的比生長(zhǎng)速率顯著大于SHY-370, 表明在此條件下HB1617比SHY-370具有更好的生長(zhǎng)狀態(tài); 而初始氨氮濃度為10 mg/L時(shí), HB1617的比生長(zhǎng)速率顯著小于SHY-370, 表明在此條件下氨氮對(duì)HB1617的抑制作用要大于SHY-370 (圖 2)。

　　高濃度氨氮對(duì)藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制的原因可能是, 以氨氮為氮源時(shí), 水體中的氨氮釋放H+, 使水體pH下降, 進(jìn)而抑制藻的生長(zhǎng)。Xin等[18]的研究結(jié)果也表明在氨氮、硝氮、尿素3種不同氮源培養(yǎng)條件下, 以氨氮為氮源的柵藻細(xì)胞密度要小于另外2種氮源條件下的細(xì)胞密度; 此外, 他們的pH梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, pH<6時(shí), 其細(xì)胞密度明顯小于pH>6時(shí),且其細(xì)胞密度隨pH的降低而減小。

　　在不同初始氨氮濃度條件下人工污水中總磷含量變化 如圖 3所示, 氨氮濃度在10 mg/L以下時(shí)HB1617對(duì)水體中總磷的去除能力明顯高于SHY-370。氨氮濃度為10 mg/L時(shí), 總磷含量基本不變。造成這種現(xiàn)象的原因可能有2個(gè); 一是氨氮濃度為 10 mg/L時(shí), 高濃度的氨氮抑制了藻的生長(zhǎng), 使其生物量明顯偏低, 且HB1617在培養(yǎng)第四天以后逐漸死亡; 二是高濃度的氨氮抑制了藻對(duì)水體中總磷的吸收利用。Xin等[18]的研究結(jié)果也表明在氨氮、硝氮、尿素3種不同氮源條件下培養(yǎng)柵藻, 以硝氮和尿素為氮源時(shí)水體中總磷的去除率均達(dá)到99%以上,而以氨氮為氮源時(shí)水體中總磷的去除率僅為76.4%。

　　氨氮濃度為1—5 mg/L時(shí), 總磷的去除率隨氨氮含量的升高而增大(圖 4), 在SHY-370與HB1617中總磷的最大去除率分別為6.38% 和20.48%,HB1617的總磷去除能力明顯高于SHY-370, 但其去除率也較低, 可能的原因是氮磷比(1﹕10)影響了磷的吸收。 Redfield定律認(rèn)為, 組成藻類細(xì)胞的氮磷原子比率為N﹕P=16﹕1, 氮磷比大于16﹕1時(shí),磷被認(rèn)為是限制性因素; 氮磷比小于 10﹕1時(shí), 氮?jiǎng)t被考慮為限制性因素[19], 本實(shí)驗(yàn)中N﹕P小于10﹕1, 所以氮的含量低可能影響了磷的吸收。

　　在不同初始氨氮濃度條件下人工污水中氨氮含量變化 如圖 5所示, 氨氮濃度為1—5 mg/L時(shí), 水體中氨氮均在48h內(nèi)減低至0.5 mg/L以下, 去除率均達(dá)到95%以上, HB1617與SHY-370兩株藻之間的氨氮去除效果并無(wú)明顯的差異(P>0.05)。

　　氨氮濃度為10 mg/L時(shí), 培養(yǎng)前2天氨氮含量迅速下降, HB1617對(duì)水體中氨氮去除速率可達(dá)3.98 mg/ (L·d), SHY-370略低, 為3.42 mg/(L·d); 培養(yǎng)第4天,HB1617的培養(yǎng)水體中的氨氮含量降至0.5 mg/L以下, 去除率達(dá)到99%以上, 而SHY-370的培養(yǎng)水體中氨氮含量降至0.61 mg/L, 去除率為94%。梁晶晶等[20]利用固定化微綠球藻處理人工污水中氮磷, 氨氮含量為17 mg/L時(shí), 不同的藻球投放質(zhì)量條件下細(xì)胞密度均有一定的增大, 氨氮最大去除率為75.08%,在充氣培養(yǎng)條件下氨氮去除率則達(dá)到85.93%。與梁晶晶等研究的微綠球藻相比本實(shí)驗(yàn)2株毛枝藻對(duì)氨氮的耐受能力較弱, 最大可耐受氨氮濃度僅為 10 mg/L, 但在氨氮濃度低于10 mg/L時(shí)其去除率能達(dá)到94%以上。因此, SHY-370和HB1617兩株毛枝藻在氨氮濃度低于10 mg/L的污水的處理方面具有一定的應(yīng)用前景。

　　2.1 在不同氮磷比培養(yǎng)條件下毛枝藻的Th長(zhǎng)及其脫氮除磷能力

　　在不同氮磷比條件下兩株毛枝藻的Th長(zhǎng)狀況如表 2所示, SHY-370在2、5、10、20和40五種氮磷比條件下, 比生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異(P>0.05);HB1617在2、5、10和20四種氮磷比條件下比生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異(P>0.05), 而氮磷比為40時(shí)其比生長(zhǎng)速率明顯小于氮磷比為2—20 時(shí)。氮磷比為2—20時(shí), SHY-370的比生長(zhǎng)速率略小于HB1617。在不同氮磷比條件下2株毛枝藻的生物量及生物量生產(chǎn)率如圖 6、圖 7所示, 與比生長(zhǎng)速率相同,在5種氮磷比條件下SHY-370的生物量與生物量生產(chǎn)速率均無(wú)明顯差異(P>0.05), HB1617在氮磷比為2—20時(shí)生物量和生物量生產(chǎn)速率均無(wú)明顯差異(P>0.05), 而氮磷比為40時(shí)其生物量和生物量生產(chǎn)速率均小于氮磷比為2—20時(shí), 表明HB1617生長(zhǎng)的最適氮磷比為2—20。

 　　Liu等[21]在1—20的氮磷比內(nèi), 設(shè)置8個(gè)不同的氮磷比, 研究其對(duì)3種絲狀藻Cladophora sp.、Kleb- sormidium sp. 及Pseudanabaena sp.氮磷去除能力的影響。結(jié)果表明, 在1—20內(nèi)不同氮磷比對(duì)3種藻的生物量生產(chǎn)速率均無(wú)明顯影響, 與本研究結(jié)果相似。Cladophora sp.生物量生產(chǎn)速率最大, 為56.7 mg/　(L·d), 小于本研究中的最大生物量生產(chǎn)速率。氮磷比為40時(shí), HB1617的生物量及生物量生產(chǎn)率降低的原因可能是氮磷比過大,此時(shí)磷含量過低(1 mg/L),成為生長(zhǎng)的限制性因素, 限制了HB1617的生長(zhǎng)。在趙先富等[22]的研究中, 小球藻及銅綠微囊藻在磷濃度低于1 μmol/L時(shí)其生無(wú)量明顯低于5和50 μmol/L組。氮磷比為2—20時(shí), HB1617的生物量生產(chǎn)率大于SHY-370, 表明在此條件下HB1617更適于生長(zhǎng)。

　　SHY-370與HB1617生長(zhǎng)的最適氮磷比不同, 表明藻類生長(zhǎng)的最適氮磷比存在種間差異。在豐茂武等[23]的研究中, 銅綠微囊藻在N/P比為40時(shí), 藻細(xì)胞密度最大。

　　在不同氮磷比條件下人工污水中NO{ -N的含量變化 如圖 8所示, 5種不同氮磷比條件下人工污水中NO{ -N含量變化趨勢(shì)基本相同, 氮磷比為5—40時(shí), SHY-370的培養(yǎng)液中NO{ -N含量均在第12天降至1 mg/L以下, 去除率達(dá)到97%以上, 而氮磷比為2時(shí), 培養(yǎng)液中NO{ -N含量為2.28 mg/L, 去除率為94.45%; 氮磷比為2—20時(shí), HB1617培養(yǎng)液中NO{ -N含量均在培養(yǎng)第10天降至1 mg/L以下, 去除率達(dá)到97%以上, 而氮磷比為40時(shí), 在培養(yǎng)第12天培養(yǎng)液中NO{ -N含量?jī)H降為6.92 mg/L, 去除率為83.23%。

　　在5種不同氮磷比條件下, HB1617及SHY-370的去除速率均存在明顯的組間差異(P<0.05), 氮磷比為2—10時(shí)SHY-370的去除速率隨氮磷比的增大而增大, 氮磷比為10—40時(shí)去除速率無(wú)明顯差異,最大去除速率為4.03 mg/(L·d); 氮磷比為2—10時(shí)HB1617培養(yǎng)液中的NO{ -N去除速率最大, 為4.89 mg/(L·d), 氮磷比為10—40時(shí)培養(yǎng)液中NO{ -N的去除速率隨氮磷比的增大而減小(圖 9)。

　　不同的藻類對(duì)氮、磷的吸收率不同, 氮磷比對(duì)其影響也不相同, 因此Redfield定律并不適用于所有藻類。在本實(shí)驗(yàn)中SHY-370吸收NO{ -N的最佳氮磷比為10—40, 而HB1617為2—10。Xin等[10]的研究中Scenedesmus sp.在氮磷比為5—8時(shí)其氮磷吸收率最高。 Liu等[21]的氮磷比實(shí)驗(yàn)中, 在1—20內(nèi) Cladophora sp.、Klebsormidium sp. 及Pseudana- baena sp. 三種藻對(duì)人工污水中氮磷去除的最佳氮磷比則為1—15, 但3種藻的氮磷去除速率存在較大的差別, 其中Pseudanabaena sp.的NO{ -N去除速率最大為10.6 mg/(L·d), 為本實(shí)驗(yàn)中NO{ -N最大去除速率的2倍。但Pseudanabaena sp.在NO{ -N含量較高(30 mg/L)的條件下去除率較低, 僅為85.4%。因此, 本實(shí)驗(yàn)研究的毛枝藻在NO{ -N含量較高的污水處理中具有一定的優(yōu)勢(shì)。

　　在不同氮磷比條件下人工污水中TP含量變化如圖 10所示, 在5種不同氮磷比條件下TP含量變化趨勢(shì)基本相同。氮磷比為5—40時(shí), 培養(yǎng)12d后TP含量均降至0.3 mg/L以下, 去除率達(dá)到90%以上;而氮磷比為2時(shí), SHY-370培養(yǎng)液中TP的去除率僅為63.96%, HB1617則略低于SHY-370, 去除率為58.5%。不同藻類對(duì)磷的吸收都有其最大值, 當(dāng)超過其所能吸收的最大值時(shí)藻類對(duì)磷的吸收率就會(huì)下降, Aslan等[24]的研究表明Chlorella vulgaris對(duì)水體中磷的最佳吸收范圍為P O{ -P<7.7 mg/L。Liu等[21]的研究中Cladophora sp.、 Klebsormidium sp.以及Pseudanabaena sp. 三種藻在TP濃度為7 mg/L時(shí)去除率均低于80%, 其TP最佳吸收值小于7 mg/L。本實(shí)驗(yàn)所研究毛枝藻對(duì)水體中TP的最大吸收值為10 mg/L左右, 在水體中TP的去除方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　2 結(jié)論

　　毛枝藻SHY-370可耐受的最高氨氮濃度為10 mg/L優(yōu)于HB1617(5 mg/L), 但HB1617的生長(zhǎng)及對(duì)水體中氮磷的去除能力優(yōu)于SHY-370; 氮磷比對(duì)SHY-370的生長(zhǎng)影響不大, 但在氮磷比大于20時(shí)HB1617的生長(zhǎng)受到抑制; SHY-370對(duì)NO{ -N去除的最佳氮磷比為10—40, HB1617為2—10; SHY-370及HB1617的最大TP吸收值均為10 mg/L左右。本實(shí)驗(yàn)研究的2株毛枝藻SHY-370及HB1617在NO{ -N及TP含量較高的污水(NO{ -N 40 mg/L, P 8 mg/L)處理方面具有一定的優(yōu)勢(shì), 能有效地去除其中的氮磷(REN>99%,REP>90%), 且其對(duì)氨氮也具有一定的耐受和去除能力, 因此, 毛枝藻城市生活污水二級(jí)出水(TN≤ 15 mg/L、TP≤0.5 mg/L、NH+-N≤5 mg/L)的深度脫氮除磷方面中具有一定的應(yīng)用前景。（中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)）