根據(jù)《中國統(tǒng)計年鑒2017》[1]的數(shù)據(jù)：2016年全國廢水排放總量為711.10億m3, 廢水中的化學(xué)需氧量(COD)總排放量高達(dá)1 046.53萬t, 氨氮、總氮和總磷的排放總量分別為141.78、212.11和13.94萬t.城市污水處理廠(wastetwater treatment plants, WWTPs)是控制水污染, 保證人類可持續(xù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)設(shè)施.城市WWTPs中應(yīng)用最為普遍的是生物處理法, 而微生物是污水生物處理系統(tǒng)實現(xiàn)污染物去除和穩(wěn)定運(yùn)行的基礎(chǔ).深入了解活性污泥(activated sludge, AS)中微生物群落的特性是理解污水生物處理本質(zhì)的關(guān)鍵, 同時也可為污水處理系統(tǒng)的設(shè)計、優(yōu)化及穩(wěn)定運(yùn)行提供理論依據(jù)及合理建議.
近年來, 高通量技術(shù)的發(fā)展極大地擴(kuò)充了對AS群落多樣性的認(rèn)識, 但對AS群落的組成特征目前仍缺乏深入理解. WWTPs本質(zhì)上是一個開放系統(tǒng), 人類腸道、管網(wǎng)、空氣和降水等來源的微生物都可能對AS群落產(chǎn)生一定的影響, 解析AS群落微生物來源能夠在一定程度上揭示群落的組成機(jī)制, 有利于更加全面深入地認(rèn)識AS群落組成特征.目前, 關(guān)于WWTPs中微生物來源的報道十分缺乏.僅有的一些研究通過分析WWTPs中進(jìn)水微生物群落來源后發(fā)現(xiàn), 12.1%的進(jìn)水微生物源于糞便, 而81.4%的微生物則與城市的污水管網(wǎng)有關(guān), 不同城市WWTPs進(jìn)水微生物群落的地理分布差異主要來自高比例的管網(wǎng)微生物.此外, 降水能夠通過地表徑流或滲透攜帶土壤微生物進(jìn)入污水管道中從而增加進(jìn)水微生物群落的多樣性. Saunders等通過對比進(jìn)水微生物群落與AS群落后發(fā)現(xiàn), 進(jìn)水微生物的遷移對AS群落的組成具有一定影響.因此, 不同環(huán)境來源的微生物或許能夠在AS群落組成中得以反映.不同城市WWTPs由于所處地理環(huán)境及接收污水特性的差異, 其AS群落微生物來源可能也存在不同, 明晰各城市AS群落微生物來源可更加深入地認(rèn)識AS群落的組成, 為分析不同地域AS群落間存在差異提供新的角度, 為WWTPs的精準(zhǔn)調(diào)控提供理論依據(jù).然而, 目前的研究主要關(guān)注WWTPs中進(jìn)水微生物的可能來源, 對AS群落的溯源分析還未見報道.
此外, 關(guān)于微生物的溯源分析, 目前使用較多的方法是, 將不同環(huán)境來源的微生物群落進(jìn)行對比后, 分析共有微生物的種類與數(shù)量或根據(jù)幾種預(yù)先確定好的指示微生物進(jìn)行判斷, 具有極大的局限性.依據(jù)貝葉斯理論的溯源模型將已知的不同來源的微生物和待分析的微生物群落作為一個整體, 通過貝葉斯理論確定不同環(huán)境來源的微生物以及未知環(huán)境來源的微生物的相對占比, 能夠較好地避免上述方法的缺陷. Knights等已成功利用基于貝葉斯理論的SourceTracker分析工具對重癥監(jiān)護(hù)室(NICUs), 辦公室以及分子生物實驗室中的微生物污染的來源進(jìn)行了解析, 發(fā)現(xiàn)源于腸道及皮膚的微生物是實驗室中PCR實驗用水的主要微生物污染源; NICUs中皮膚是主要的微生物污染物來源, 此外還有大量未知污染物來源; 辦公室電話上的微生物主要來自皮膚與口腔.
基于以上背景, 本研究在全國15個城市的WWTPs開展采樣工作, 采用高通量16S rRNA基因測序技術(shù), 運(yùn)用生態(tài)學(xué)、統(tǒng)計學(xué)等相關(guān)分析方法并結(jié)合基于貝葉斯理論的溯源模型, 解析我國城市WWTPs中AS群落的組成以及微生物來源, 深化對污水處理系統(tǒng)中AS群落組成特征認(rèn)識, 以期為WWTPs的優(yōu)化設(shè)計和精準(zhǔn)調(diào)控提供理論依據(jù).
1 材料與方法 1.1 樣品采集
本研究于2014年7~8月期間采用統(tǒng)一方法對中國從南至北的15個城市, 包括三亞(SY)、深圳(SZ)、廈門(XM)、長沙(CS)、重慶(CQ)、武漢(WH)、成都(CD)、上海(SH)、無錫(WX)、西安(XA)、青島(QD)、濟(jì)南(JN)、大連(DL)、北京(BJ)和哈爾濱(HB)的WWTPs進(jìn)行采樣, 采樣點地理分布如圖 1所示.為保證后續(xù)相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果更加可靠, 采樣遵循每個城市至少采集4個WWTPs(其中DL只聯(lián)系到2個WWTPs, 因此在DL的同一個WWTP不同曝氣池中按照同樣標(biāo)準(zhǔn)分別取樣兩次), 每個WWTP至少采集3個曝氣池AS樣品(分別在曝氣池的前、中、后端), 若同一WWTP具有不同的處理工藝, 則在不同處理工藝的曝氣池中都進(jìn)行AS樣品的采集.采樣共獲得來自全國60個WWTPs的211個AS樣品.
圖 1
1.2 樣品16S rRNA基因高通量測序
使用美國MoBio公司(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA)的PowerSoil® DNA提取試劑盒對211個AS樣品離心后的污泥沉淀物進(jìn)行DNA提取.在確定提取的DNA樣品滿足上機(jī)測序的用量需求(DNA濃度保持在50~200 ng ·mL-1)和純度要求(A260/A280在1.8附近, A260/A230大于1.7)后, 對其進(jìn)行兩步法PCR擴(kuò)增.其中第一步PCR使用的是16S rRNA基因V4區(qū)通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′).之后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化, 純化后的產(chǎn)物通過MiSeq平臺(Illumina, San Diego, CA, USA), 利用基于Caporaso等提出的測序方法完成16S rRNA基因測序.測序得到的原始數(shù)據(jù)通過Galaxy平臺(http://zhoulab5.rccc.ou.edu:8080/)完成。
1.3 數(shù)據(jù)處理及分析方法
在進(jìn)行不同城市獨特OTUs的分析前, 先對211個樣品的OTU表格進(jìn)行城市水平上的數(shù)據(jù)處理：只保留城市水平樣品檢出率大于50%的OTUs, 并將其在該城市所有樣品中的平均豐度作為此OTU在城市水平上的豐度, 而其他城市水平樣品檢出率小于50%的OTUs的相對豐度記為0.
使用Knights等提出的溯源方法以及所提供的SourceTracker軟件包, 在Qiime平臺下完成AS微生物群落的溯源分析..
2 結(jié)果與討論2.1 不同城市的AS群落組成
211個AS樣品共獲得了源于58個門的33 849個OTUs. 58個門中相對豐度超過0.1%的門(優(yōu)勢門)有10個, 其相對豐度之和占AS群落總豐度的94.53%~97.04%.除HB外, 其余城市AS群落中相對豐度最高的門均為Proteobacteria(34.42%~54.09%), 其次為Bacteroidetes(10.49%~36.72%)和Chloroflexi(0.90%~12.83%).此外, Actinobacteria, Firmicutes, Acidobacteria, 和Planctomycetes的相對豐度也較高(圖 2).這與已報道的AS群落中的優(yōu)勢門類基本保持一致, 但除了Proteobacteria和Bacteroidetes外, 其他優(yōu)勢門類的順序略有不同.這些高豐度微生物或與WWTPs的功能有著密切聯(lián)系, 例如：來自Proteobacteria的Dokdonella和Thauera, 與污水處理系統(tǒng)中的反硝化過程相關(guān).來自Bacteroidetes的Ferruginibacter是AS中常見的核心物種, 能夠降解某些有機(jī)物; Lewinella能夠降解淀粉等多種有機(jī)碳; 而Solitalea同樣和反硝化過程有關(guān).此外, Nitrospirae在各城市AS群落中均屬于優(yōu)勢門, 具有較高的相對豐度(0.27%~1.61%)(圖 2), 與Guo等利用宏基因組測序技術(shù)探究WWTPs中優(yōu)勢菌所獲得的結(jié)論相一致. Nitrospirae是WWTPs廣泛存在的一類微生物, 隸屬于該門的Nitrospira屬, 能夠參與污水處理系統(tǒng)的硝化作用.因此, 各城市AS群落中較高豐度的Nitrospirae有益于WWTPs硝化作用的順利進(jìn)行.具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
圖 2
對比10個優(yōu)勢門在不同城市AS群落組成中的占比后發(fā)現(xiàn)：來自DL的AS群落中Proteobacteria相對豐度高達(dá)54.09%, 但Chloroflexi僅占群落總豐度的0.90%, 低于Actinobacteria(4.18%)、Firmicutes(3.08%)、Ignavibacteriae(2.01%)和Verrucomicrobia(0.93%).來自SY的AS群落中Bacteroidetes的相對豐度僅有10.49%, 遠(yuǎn)低于Proteobacteria的相對豐度(53.73%); 而來自HB的AS群落中Bacteroidetes(36.33%)的相對豐度則略高于Proteobacteria(34.42%).相比于其他城市的AS群落, Ignavibacteriae在QD和WX的AS系統(tǒng)中豐度相對較高.優(yōu)勢菌(門水平)在各城市AS群落中的分布情況表明, 全國不同城市AS群落中的優(yōu)勢門類相似, 但相對豐度或許受地理位置等因素(如靠近中國兩端、沿海等)的影響而有所不同.
2.2 不同城市的獨特OTUs
研究表明, 雖然各個地區(qū)WWTPs執(zhí)行功能基本一致, 運(yùn)行條件基本相似, AS群落中存在著共有核心物種, 但不同地區(qū)WWTPs中的微生物群落組成同時存在一定地域差異; 此外, 有報道指出, WWTPs之間距離相距越遠(yuǎn), 其微生物群落及功能基因組成相似性均越小, 呈現(xiàn)出距離-衰減規(guī)律.為了進(jìn)一步探究AS群落組成的地理分布特性, 隨后分析了各城市WWTPs中所含有的獨特OTUs(僅在某一個城市的樣品檢出率大于50%的OTUs).結(jié)果顯示, 超過3 000個OTUs只廣泛存在于某一個城市的WWTPs中.這表明, 不同城市因其地理位置或所處自然環(huán)境的差異, 如氣候炎熱或寒冷, 臨近海洋或靠近內(nèi)陸等, 其AS群落中可能存在一些其他城市稀有, 但在當(dāng)?shù)胤植驾^廣的OTUs, 即獨特OTUs.獨特OTUs在不同城市的數(shù)量分布同樣受到地理因素的影響(圖 3).此次采樣最北端的HB(601個)和最南端的SY(489個)被檢測出具有最多的獨特OTUs.其中一個可能的原因是, 和其他采樣城市相比, HB和SY具有較低和較高的年平均氣溫, 溫度能夠直接影響AS群落中微生物的生長代謝速率, 進(jìn)而影響物種的進(jìn)化速率、群落結(jié)構(gòu)以及多種生態(tài)系統(tǒng)過程.此外, 一些沿海城市如DL(303個)、SH(248個)和SZ(205個)等也傾向于具有更多的獨特OTUs, 這些獨特OTUs或許和海洋微生物有關(guān), 隨后的AS群落溯源分析結(jié)果也證實了這一推測.相反, 中西部地區(qū), 尤其是WH、CS和CQ的WWTPs中被檢測出的獨特OTUs相對較少(圖 3).
圖 3
2.3 不同城市的特征微生物
在城市特殊OTUs的研究基礎(chǔ)上, 進(jìn)一步分析了其中相對豐度較高(相對豐度大于0.1%)的微生物(綱水平), 即城市的特征微生物.整體來看, SY的特征微生物最多, 有33個, 主要來自Deltaproteobacteria綱和Anaerolineae綱, 其次為DL和SZ, 分別有31個和18個; 而CD和CQ未檢測到特征微生物.由城市的特征微生物(綱水平)分布可以看出(圖 4), 各城市的特征微生物主要來自Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria、Gammaproteobacteria等, 而屬于Anaerolineae的特征微生物僅來自于SY和DL.此外, SY和DL的特征微生物組成最為相似, 被歸為一組, 而CD和CQ由于未檢測到特征微生物而同樣被歸為一組(圖 4), 表明地理環(huán)境因素可能是不同城市特征微生物存在差異的最大原因.
圖 4
2.4 微生物群落的溯源分析
由上述研究結(jié)果得知, 每個城市的WWTPs中具有一些獨特OTUs或特征微生物, 且這些微生物的種類和數(shù)量可能與城市的地理位置及環(huán)境條件有關(guān).利用SourceTracker對不同城市WWTPs中AS群落進(jìn)行溯源分析后發(fā)現(xiàn), 不同城市AS群落的微生物來源(屬水平)存在一定差異(圖 5)：僅在沿海城市, 如DL、QD、SY、SZ和XM的AS群落中檢測到海洋微生物源, 但比例都不高, 約占2%.水系發(fā)達(dá)的城市, 如SY、QD、SZ、CS、WH、WX和XM的AS群落中淡水來源(包括地下水、湖和河)微生物的占比接近或高于土壤, 其中SY的AS群落中有31%的微生物來自淡水.相反, 在城市水系不太發(fā)達(dá)的地區(qū)如CD和CQ等, WWTPs中AS群落檢測到的土壤微生物來源高于淡水.因此, 淡水微生物來源在淡水資源相對較多的南方區(qū)域AS群落中所占比例較高, 這與人們的認(rèn)知是一致的.此外, 植物及根際來源的微生物在不同城市的AS群落中也占據(jù)了一定的比例(4%~12%), 可能的原因是采樣發(fā)生在降雨量較大的夏季, 雨水沖刷植物、土壤后, 大量攜帶有植物微生物或根際微生物的雨水匯入污水管網(wǎng)進(jìn)入WWTPs.除SY外, 每個城市都有一定量的工業(yè)廢水來源微生物(4%~14%), 這是由于所采樣的大部分WWTPs都處理一定量的工業(yè)廢水; 而SY未檢測到工業(yè)廢水來源微生物, 這與采樣時工作人員所填寫的SY市內(nèi)WWTPs不處理任何工業(yè)廢水的問卷結(jié)果相一致.
圖 5
從溯源分析的結(jié)果可以看出, AS群落結(jié)構(gòu)能在一定程度上反映該城市的進(jìn)水性質(zhì), 證明了進(jìn)水微生物的遷移的確對AS群落的組成具有一定影響.此外, 城市的部分地理環(huán)境特征也能通過AS群落結(jié)構(gòu)得以體現(xiàn).但值得注意的是, 人體腸道微生物的占比非常低, 一方面可能由于人體腸道微生物隨污水的處理過程被去除, 另一方面可能是數(shù)據(jù)庫中的人體腸道微生物多來自歐美人群, 而腸道微生物的組成主要由環(huán)境以及飲食決定的, 因此數(shù)據(jù)庫所提供的腸道微生物源對中國不太適用, 但具體原因還需進(jìn)一步研究.此外, 每個城市將近一半的微生物源未知, 表明AS群落可能還有大量源于污水管網(wǎng)中的微生物以及在AS系統(tǒng)操作參數(shù)條件下被馴化的微生物.
3 結(jié)論
(1) 全國不同城市AS群落中的優(yōu)勢微生物(相對豐度超過0.1%的門)種類相似, 包括Proteobacteria、Bacteroidetes以及和WWTPs硝化作用相關(guān)的Nitrospirae等.各城市AS群落中優(yōu)勢門的豐度之和占群落總豐度的94.53%~97.04%.
(2) 城市的地理位置及環(huán)境條件能夠影響AS群落組成：不同城市WWTPs中各優(yōu)勢門的相對豐度, 獨特OTUs個數(shù)以及特征微生物種類受地理位置等因素的影響而存在差異.接近中國大陸兩端的哈爾濱和三亞, 具有較多的獨特OTUs; 沿海城市WWTPs中的獨特OTUs也相對較多.所處地理環(huán)境相似的城市, 其AS群落中的特征微生物也更為相似.
(3) AS群落結(jié)構(gòu)能在一定程度上反映該城市的進(jìn)水性質(zhì)及地理環(huán)境特征.植物及土壤來源微生物在不同城市的AS群落中均占據(jù)了較高比例; 淡水來源微生物在淡水資源相對較多的南方區(qū)域中所占比例較高; 除SY外, 每個城市都有一定量的工業(yè)廢水來源; 但人體腸道微生物的占比非常低.除此之外, 還有大量微生物來源未知.(來源：環(huán)境科學(xué) 作者：張冰)
