抗生素是一類在低濃度下就能選擇性抑制某些生物生命活動(dòng)的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物及其化學(xué)合成或半合成的衍生物(衛(wèi)生學(xué)大辭典).基于其良好的抑菌效果及生長(zhǎng)促進(jìn)作用, 該類物質(zhì)在醫(yī)療、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)得到了廣泛使用.但大量甚至過量使用及低代謝率也導(dǎo)致了其在環(huán)境中較高的檢出率.雖然環(huán)境中該類物質(zhì)的檢出濃度一般為ng~μg級(jí)別, 但由此誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗生素抗性基因及伴隨的基因水平轉(zhuǎn)移很可能使包括致病菌在內(nèi)的其他微生物獲得抗生素抗性, 最終對(duì)人體健康和生態(tài)安全造成威脅.研究顯示, 抗生素的大量輸入還可使環(huán)境中原有的微生物群落發(fā)生轉(zhuǎn)變, 而微生物群落是生物地球化學(xué)循環(huán)的重要組成部分, 其結(jié)構(gòu)和功能的改變很可能對(duì)原有物質(zhì)循環(huán)過程產(chǎn)生影響.氟喹諾酮是應(yīng)用十分廣泛的一類廣譜抗生素, 通過抑制細(xì)菌體內(nèi)的DNA復(fù)制達(dá)到抑菌目的, 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較好抑制效果.良好的穩(wěn)定性使其在沉積物、水生植物、河流湖泊、土壤中均呈現(xiàn)較高的檢出率和濃度.

　　人工濕地是一種模擬自然系統(tǒng)并經(jīng)過人工強(qiáng)化的凈水系統(tǒng), 因成本低、管理容易而獲得了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用, 其在抗生素去除方面同樣表現(xiàn)良好. Liu等分別采用火山巖和沸石作為基質(zhì)的人工濕地去除獸用抗生素和抗性基因.結(jié)果顯示, 環(huán)丙沙星的去除率達(dá)到78%以上, 且以沸石作為基質(zhì)的濕地表現(xiàn)更佳. Huang等發(fā)現(xiàn)垂直流人工濕地可以去除養(yǎng)豬廢水中69%~99%的土霉素、四環(huán)素和金霉素且土壤中抗生素的含量與總氮和氨氮的去除效果存在負(fù)相關(guān)關(guān)系.但人工濕地對(duì)抗生素的去除效果還會(huì)受到濕地基質(zhì)類型、植物種類、pH、溶解氧和溫度等環(huán)境因素的影響.目前, 大多研究關(guān)注了濕地對(duì)抗生素及抗性基因的去除、散播和影響因素等, 對(duì)濕地中微生物群落在氟喹諾酮壓力下的變化關(guān)注不足.

　　目前, 關(guān)于抗生素對(duì)微生物群落的影響已有不少研究, 但大多研究采用的是單一抗生素或不同種類抗生素的混合物, 針對(duì)同類多種抗生素的研究較為欠缺.氟喹諾酮具有良好的吸附性, 但其混合物在吸附過程中會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)從而減小單個(gè)氟喹諾酮藥物的Kd值, 進(jìn)而影響到單個(gè)氟喹諾酮藥物的吸附性.因此, 氟喹諾酮混合物對(duì)微生物產(chǎn)生的影響可能與單個(gè)氟喹諾酮藥物存在差異.本實(shí)驗(yàn)選擇環(huán)境中檢出率較高的3種氟喹諾酮：氧氟沙星(ofloxacin, OFL)、諾氟沙星(norfloxacin, NOR)和環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)的混合物作為添加物, 研究了人工濕地凈化能力及微生物群落在其壓力下的變化, 以揭示該類抗生素對(duì)人工濕地的潛在影響.

　　1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行

　　本實(shí)驗(yàn)中采用由PVC制成的圓柱形人工濕地實(shí)驗(yàn)裝置(如圖 1), 裝置直徑為40 cm, 高為80 cm.柱體自下而上依次填充卵石(高約3 cm)、陶粒(粒徑為5~8 mm和3~6 mm約1:1混合; 高12 cm)、沸石(粒徑為3~6 mm; 高30 cm)、土壤與蛭石的混合物(體積比約1:1混合, 高15 cm).裝置最上層種植兩株美人蕉, 外圍有鋁箔包裹.

　　圖 1

1.進(jìn)水桶; 2.進(jìn)水管; 3.蠕動(dòng)泵; 4.美人蕉; 5.土蛭混合層; 6.沸石層; 7.陶粒層; 8.卵石層; 9.出水管; 箭頭所示為水流方向圖 1 人工濕地實(shí)驗(yàn)裝置示意 Fig. 1 Constructed wetland used in this experiment

　　實(shí)驗(yàn)進(jìn)水采用人工配水, 每10.0 L水中含有4.40 g葡萄糖, 0.77 g氯化銨, 0.24 g磷酸二氫鉀, 0.14 g二水氯化鈣, 0.20 g七水硫酸鎂, 0.45 g六水三氯化鐵, 4.00 g碳酸氫鈉, 由蠕動(dòng)泵實(shí)現(xiàn)連續(xù)進(jìn)水, 每日進(jìn)水量為9.2 L, 水力停留時(shí)間約為39 h.裝置前期運(yùn)行3個(gè)月以構(gòu)建穩(wěn)定的系統(tǒng)及微生物體系, 之后開始在進(jìn)水中添加抗生素, 使3種抗生素在進(jìn)水中的濃度分別為氧氟沙星100 μg·L-1、諾氟沙星50 μg·L-1、環(huán)丙沙星50 μg·L-1.氧氟沙星(純度99%)、諾氟沙星(純度99%)、環(huán)丙沙星(純度≥98%)均購(gòu)買于上海源葉生物科技有限公司, 配水所用其他試劑均為分析純.抗生素儲(chǔ)備液用含有0.2%乙酸的去離子水于棕色瓶中分別配置并存于冰箱中, 每月更新一次.進(jìn)水中添加抗生素的時(shí)間為2017年4~6月.

　　1.2 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

　　本實(shí)驗(yàn)中, 進(jìn)出水的COD、氨氮、TP濃度每3 d測(cè)定一次, COD濃度測(cè)定采用快速消解分光光度法, 氨氮濃度采用納氏試劑分光光度法, TP濃度采用鉬酸銨分光光度法.出水抗生素濃度每周測(cè)定一次, 參考文獻(xiàn)[25]采用UPLC-MS/MS完成.

　　1.3 16S rRNA測(cè)序分析

　　在未添加抗生素前(C組)和添加抗生素兩個(gè)月后(T組)分別取3份最上層基質(zhì)進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析, 每次取樣間隔1 d, 取樣深度為表面下4~5 cm.樣品中的DNA提取采用Fast DNA SPIN Kit For Soil(MP Biotechnology)試劑盒完成.采用引物338F和806R對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min, 95℃變性0.5 min, 55℃退火0.5 min, 72℃延伸0.5 min, 循環(huán)27次, 并在72℃最終延伸5 min.擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè), 然后在Illumina MiSeq平臺(tái)完成測(cè)序分析.測(cè)序由美吉生物醫(yī)藥公司完成.測(cè)序結(jié)果按照97%的相似度進(jìn)行OTU分類, 采用RDP classfier進(jìn)行分類學(xué)統(tǒng)計(jì), 然后計(jì)算每組樣本的Shannon指數(shù)、Shannoneven指數(shù)和Chao1指數(shù).采用非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)判斷兩組樣本整體差異.顯著性水平為P < 0.05.

　　2 結(jié)果與討論2.1 人工濕地運(yùn)行效果

　　系統(tǒng)進(jìn)出水COD、氨氮、TP的濃度變化如圖 2所示.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中, 氨氮去除率始終大于95.40%, 未受到抗生素的明顯影響. COD和TP的去除效果變化較為明顯.未添加抗生素階段, COD去除率大于97.88%;抗生素添加初期, 出水COD濃度未呈現(xiàn)較大變化, 但從添加后的第16 d開始, 出水COD濃度開始逐漸上升, 直至第34 d達(dá)到最大值120.4 mg·L-1, 去除率為70.94%.之后, 出水COD濃度逐漸下降直至實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?對(duì)于TP, 未添加抗生素期間, TP去除率大于84.52%;添加抗生素后, 出水TP濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)并伴隨較大幅度波動(dòng).綜上, 氟喹諾酮對(duì)人工濕地的凈化性能產(chǎn)生了負(fù)面影響且主要體現(xiàn)在COD和TP去除方面.本實(shí)驗(yàn)中, 除有4周的出水中有抗生素檢出外, 其余出水中抗生素的濃度均低于檢出限, 因此, 垂直流人工濕地對(duì)氟喹諾酮具有良好的去除效果.

　　圖 2

圖 2 進(jìn)出水COD、氨氮、TP濃度曲線

　　類似結(jié)果已有報(bào)道. Amorim等[26]研究氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)好氧顆粒污泥SBR系統(tǒng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)水中添加抗生素后, 出水COD濃度和TP濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 而氨氮濃度未受明顯影響. SBR添加氧氟沙星后, COD、氨氮和TP的去除效果與本實(shí)驗(yàn)相似. Zheng等發(fā)現(xiàn)當(dāng)諾氟沙星濃度為0~6 mg·L-1時(shí), SBR對(duì)COD和氨氮的去除效果保持穩(wěn)定, 當(dāng)諾氟沙星濃度上升至35 mg·L-1時(shí), COD和氨氮去除率由90.7%和94.1%下降至76.5%和73.6%.可見, 氟喹諾酮會(huì)對(duì)工藝出水水質(zhì)產(chǎn)生消極影響.氟喹諾酮具有良好的吸附性, 可通過靜電作用力、氫鍵、疏水力等被有機(jī)質(zhì)、無機(jī)礦物顆粒強(qiáng)烈吸附, 在人工濕地、污水處理廠, 吸附都是該類抗生素的重要去除途徑.本實(shí)驗(yàn)中, 土蛭混合層和其中的有機(jī)質(zhì)均具備良好的吸附性, 因此系統(tǒng)展現(xiàn)了良好的抗生素凈化能力.同時(shí), 基質(zhì)對(duì)氟喹諾酮的強(qiáng)烈吸附也對(duì)微生物產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用, 避免了抗生素添加初期出水水質(zhì)的劇烈變化.隨著添加時(shí)間的延長(zhǎng), 系統(tǒng)中抗生素的積累量逐漸上升, 其負(fù)面影響也逐漸顯現(xiàn), 與之伴隨的便是出水COD濃度和TP濃度的上升.盡管氟喹諾酮是一類廣譜抗生素, 但微生物亦可通過外排泵機(jī)制、改變細(xì)胞內(nèi)的抗生素敏感部位、使抗生素失活等方式增加自身對(duì)抗生素的耐受性和適應(yīng)性.值得注意的是, 某些抗生素還可以作為微生物代謝的碳源.另外, 微生物群落還可通過調(diào)整內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐步適應(yīng)抗生素的存在.這些原因都可能使系統(tǒng)的凈化性能在抗生素添加后期逐步恢復(fù).因此, 雖然氟喹諾酮會(huì)對(duì)人工濕地的凈化能力產(chǎn)生影響, 但其可以隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步恢復(fù).

　　2.2 微生物群落變化2.2.1 微生物群落概況

　　測(cè)序后得到各分類水平的微生物數(shù)目如圖 3所示, 樣本的Shannon指數(shù)、Shannoneven指數(shù)、Chao1指數(shù)如表 1所示.對(duì)比兩組結(jié)果發(fā)現(xiàn), T組樣本的Chao1指數(shù)顯著高于C組, 但Shannon指數(shù)和Shannoneven指數(shù)變化并不顯著(P>0.05)(表 1). NMDS分析結(jié)果(如圖 4)顯示, 不同組樣本點(diǎn)間距離較大, 同組樣本點(diǎn)間距離較小, 兩組樣本點(diǎn)呈現(xiàn)明顯分離趨勢(shì).可見, 氟喹諾酮確實(shí)使系統(tǒng)中的微生物群落產(chǎn)生了轉(zhuǎn)變.

　　圖 3

圖 3 各分類水平微生物數(shù)目 Fig. 3 Species numbers for each classification level

　　表 1 α多樣性指數(shù)1)

　　圖 4

圖 4 NMDS分析

　　2.2.2 門水平微生物群落變化

　　抗生素添加前后各樣本的門水平微生物群落構(gòu)成如圖 5所示, 其中C組的優(yōu)勢(shì)種群為Proteobacteria (44.90%)、Actinobacteria (24.61%)、Chloroflexi (7.37%)、Acidobacteria (7.93%)、Bacteroidetes (4.37%), T組的優(yōu)勢(shì)種群為Proteobacteria (34.12%)、Actinobacteria (21.82%)、Firmicutes (10.55%)、Acidobacteria (8.31%)、Chloroflexi (7.99%)和Bacteroidetes (5.25%). Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria與Bacteroidetes始終為優(yōu)勢(shì)種群, 其總豐度在C組和T組中分別占比89.17%、77.49%, 這與其他研究中的結(jié)果類似.具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 5

圖 5 門水平的群落構(gòu)成

　　從圖 5中可看出, Proteobacteria的相對(duì)豐度明顯減少而Firmicutes的相對(duì)豐度明顯上升. Kim等研究恩諾沙星對(duì)人體腸道微生物群落影響時(shí)發(fā)現(xiàn), 隨著恩諾沙星濃度的增加, Proteobacteria和Bacteroidetes的比例逐漸減小, 而Firmicutes所占比例逐漸增加.本實(shí)驗(yàn)所用的諾氟沙星和環(huán)丙沙星為恩諾沙星的生物降解中間體. Xiong等發(fā)現(xiàn)糞肥中的氟喹諾酮會(huì)對(duì)土壤中的Proteobacteria產(chǎn)生抑制, 且施用了含氟喹諾酮肥料的土壤中Firmicutes的豐度要高于對(duì)照組. Yan等發(fā)現(xiàn)氧氟沙星、磺胺甲唑可使人工濕地中Firmicutes的相對(duì)豐度隨抗生素濃度逐漸增加.可見, 氟喹諾酮對(duì)Proteobacteria有抑制作用而對(duì)Firmicutes有促進(jìn)作用.在眾多水處理工藝中, Proteobacteria均是發(fā)揮重要功能的優(yōu)勢(shì)種群, 與系統(tǒng)凈化能力密切相關(guān), 因此本實(shí)驗(yàn)中COD和TP凈化效果的下降很可能與Proteobacteria相對(duì)豐度的明顯下降有關(guān).

　　2.2.3 綱水平微生物群落變化

　　C組和T組各樣本綱水平的微生物群落構(gòu)成如圖 6所示, 其中C組的優(yōu)勢(shì)種群是Actinobacteria (24.61%)、β-Proteobacteria (17.03%)、α-Proteobacteria (11.69%)、δ-Proteobacteria (8.84%)、Acidobacteria (7.93%)、γ-Proteobacteria (7.05%), T組的優(yōu)勢(shì)種群是Actinobacteria (21.82%)、α-Proteobacteria (12.53%)、β-Proteobacteria (8.36%)、Acidobacteria (8.31%)、δ-Proteobacteria (7.52%)和γ-Proteobacteria (5.65%).比較兩組的構(gòu)成發(fā)現(xiàn), 相對(duì)豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)種群中, β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria的相對(duì)豐度變化較大(如圖 6).有研究顯示, 廢水中的四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素與β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系.另外, 當(dāng)同樣具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的三氯生進(jìn)入到水-沉積物系統(tǒng)中時(shí), β-Proteobacteria的相對(duì)豐度也發(fā)生了大幅下降.可見, β-Proteobacteria對(duì)該類物質(zhì)的出現(xiàn)比較敏感. β-Proteobacteria是Proteobacteria的重要組成部分, 其中含有大量可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)物降解、脫氮除磷等功能的微生物, 因此其豐度的減小可能與出水COD濃度和TP濃度上升之間存在相關(guān)關(guān)系.與β-Proteobacteria的變化趨勢(shì)相反, Clostridia、Bacilli、Bacteroidia的相對(duì)豐度呈現(xiàn)了比較明顯的增加(如圖 6), 分別從C組的0.50%、1.85%、0.10%增加到了T組的4.21%、4.64%和2.56%.有報(bào)道稱, Clostridia和Bacilli在盤尼西林和土霉素污染環(huán)境中呈現(xiàn)出很高的豐度, 且四環(huán)素類和磺胺類對(duì)Clostridia有選擇性優(yōu)勢(shì).因此, Clostridia和Bacilli可能與抗生素污染環(huán)境之間存在潛在聯(lián)系. Liao等還發(fā)現(xiàn)Bacteroidia中含有能夠降解環(huán)丙沙星的菌種.可見, Clostridia、Bacilli和Bacteroidia對(duì)氟喹諾酮具有較強(qiáng)適應(yīng)性.綜上, 氟喹諾酮對(duì)Clostridia、Bacilli和Bacteroidia具有選擇性優(yōu)勢(shì), 對(duì)β-Proteobacteria具有選擇性抑制作用.

　　圖 6

圖 6 綱水平的群落構(gòu)成

　　2.2.4 屬水平微生物群落變化

　　本實(shí)驗(yàn)中, C組和T組分別檢測(cè)到585個(gè)屬和670個(gè)屬, 其中551個(gè)屬為兩組共有, 其中42.65%、15.79%、9.44%、7.26%、5.26%的屬分別包含于Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Chloroflexi.在屬的分類水平上, C組的優(yōu)勢(shì)種群為Dechloromonas (8.56%)、Pseudarthrobacter (5.10%)、Pseudomonas(3.37%)、Skermanella (2.28%)、Nitrospira (2.03%), T組的優(yōu)勢(shì)種群為Trichococcus (3.84%)、Tessaracoccus (3.83%)、Dechloromonas (3.16%)、Pseudomonas (3.15%)、Desulfovibrio (2.06%).兩組樣本中豐度前15位屬的Heatmap圖如圖 7所示, 從中可看出Dechloromonas(屬于Proteobacteria)、Pseudarthrobacter(屬于Actinobacteria)的豐度下降明顯, 而Trichococcus(屬于Firmicutes)、Tessaracoccus(屬于Actinobacteria)、Desulfovibrio(屬于Proteobacteria)的豐度則出現(xiàn)明顯上升, 因此群落中不同種類的微生物在氟喹諾酮壓力下呈現(xiàn)了不同的豐度變化趨勢(shì).其中, Dechloromonas可以還原高氯酸鹽, 是生物水處理系統(tǒng)中常見的聚磷菌, 因此該屬豐度的減小可能與出水TP濃度上升有關(guān).另一個(gè)豐度減小的屬Pseudarthrobacter中的部分菌種(如Pseudarthrobacter sulfonivorans strain Ar51)可在低溫下降解原油和多苯化合物, 但本實(shí)驗(yàn)期間氣溫較高, 可能抑制了其對(duì)復(fù)雜有機(jī)物的適應(yīng)能力. Trichococcus具有良好的抗生素適應(yīng)性, Trichococcus flocculiformi更是在各類抗生素環(huán)境中廣泛存在的一類微生物, 因此該屬在氟喹諾酮的選擇性壓力下呈現(xiàn)了更高的豐度. Tessaracoccus是一類兼性厭氧(除T. lubricantis外)的革蘭氏陽(yáng)性菌, 在活性污泥、海底沉積物、被油污染的含鹽土中均有被分離出來的菌株, 因此, 該屬對(duì)環(huán)境良好的適應(yīng)能力使其未受到抗生素的負(fù)面影響. Desulfovibrio可以將有機(jī)物或者分子氫的氧化與硫酸鹽還原過程聯(lián)系起來生成硫化氫并從中獲得能量, 是嚴(yán)格厭氧菌.有報(bào)道顯示, 包括Desulfovibrio在內(nèi)的多種硫酸鹽還原菌都可以受到環(huán)丙沙星的促進(jìn)作用, 這與本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果類似. Nitrosomonas和Nitrosospira是重要的氨氧化菌, 其豐度在前后兩組未出現(xiàn)較大變化, 這與出水氨氮濃度一直保持穩(wěn)定狀態(tài)的結(jié)果相一致.

　　圖 7

圖 7 屬水平的Heatmap圖

　　3 結(jié)論

　　(1) 氟喹諾酮會(huì)對(duì)人工濕地凈化性能產(chǎn)生負(fù)面影響, 主要體現(xiàn)在對(duì)COD和TP的去除方面, 但其可以隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步恢復(fù); 同時(shí)垂直流人工濕地對(duì)氟喹諾酮具有良好的凈化效果.

　　(2) 氟喹諾酮使人工濕地中的微生物群落發(fā)生了轉(zhuǎn)變. Shannon指數(shù)和Shannoneven指數(shù)無顯著變化, Chao1指數(shù)顯著增加; 群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯轉(zhuǎn)變.(來源：環(huán)境科學(xué) 作者：李新慧)