1 引言(Introduction)

　　人類活動(dòng)帶來的水體富營養(yǎng)化的問題(馬經(jīng)安等，2002)，使人們?cè)絹碓疥P(guān)注氮和磷(蔡順智等，2016)在自然界中的遷移轉(zhuǎn)化，尤其是氮的去除率已經(jīng)成為衡量某一自然或人工系統(tǒng)脫氮效果的重要指標(biāo).污水處理廠在設(shè)計(jì)之初，就將利于硝化和反硝化作用的發(fā)生作為重要的設(shè)計(jì)指標(biāo)(傅鋼等，2004).但是脫氮效率不穩(wěn)定，脫氮效果不達(dá)標(biāo)的現(xiàn)象在水處理過程中經(jīng)常發(fā)生(張雷等，2014).脫氮過程，即氨氮經(jīng)過硝化作用生成硝酸氮和亞硝酸氮，硝酸氮和亞硝酸氮再經(jīng)過反硝化過程被轉(zhuǎn)化為氮?dú)膺M(jìn)入空氣，最終達(dá)到脫氮的目的的過程(Ye et al., 2001).通常所說的氮去除效率不達(dá)標(biāo)只是表面現(xiàn)象，實(shí)質(zhì)上，是活性污泥沒有達(dá)到期望的處理能力.在自然水體或復(fù)雜水工構(gòu)筑物中，很難通過簡單的氮含量測定來描述該生態(tài)或生物系統(tǒng)的脫氮性能(盧陽陽，2013)，因此，從活性污泥入手建立一種檢測方法或者指標(biāo)來評(píng)價(jià)微生物的脫氮性能，并能根據(jù)其變化來反饋污水處理過程中的脫氮情況，將對(duì)污水處理廠脫氮效能的準(zhǔn)確把握與精準(zhǔn)調(diào)控意義重大.

　　基于同位素分餾效應(yīng)(Banner et al., 1995)，穩(wěn)定同位素檢測為水中氮素的遷移轉(zhuǎn)化過程(Hoefs et al., 1997)研究提供了技術(shù)方法.Handley和Raven(1992)在1992年，就將同位素分餾效應(yīng)用于解釋硝化反硝化過程中的物質(zhì)遷移轉(zhuǎn)化，Barford等(1999)，Karen等(2003)和Lehmann(2004)也對(duì)此開展了進(jìn)一步研究，得出在硝化與反硝化過程中均存在著明顯的同位素分餾效應(yīng)，使得液相中無機(jī)氮的氮同位素比值上升.隨著活性污泥同化作用的發(fā)生，其δ15N值隨液相無機(jī)氮δ15N值的升高而升高.所以，脫氮效果不佳，就意味著δ15N值下降.

　　為研究城市污水廠活性污泥的脫氮效果，實(shí)際中通常監(jiān)測TN、NH4-N、NO3-N等指標(biāo)，并結(jié)合MLSS、MLVSS、SS、SVI等指標(biāo)來監(jiān)測活性污泥生長情況.這些指標(biāo)只能單一的反映水質(zhì)或微生物的某一項(xiàng)變化，當(dāng)城市污水廠出現(xiàn)脫氮問題時(shí)，需要對(duì)水質(zhì)和污泥分別進(jìn)行監(jiān)測才有可能找出問題所在，這些指標(biāo)不能很好地反映活性污泥中與脫氮相關(guān)的微生物群落狀況.然而，面對(duì)一些復(fù)雜的脫氮疑難問題時(shí)，需結(jié)合微生物狀況分析，但這些方法一般費(fèi)時(shí)費(fèi)力，如凝膠電泳法用時(shí)達(dá)一周.針對(duì)這一問題，本研究旨在開發(fā)一種既能反映活性污泥的實(shí)際脫氮性能，又能表征活性污泥中與脫氮相關(guān)的的微生物群落狀況的檢測方法.本文利用瑞利分餾方程建立了關(guān)于活性污泥δ15N值與污水中無機(jī)氮的去除效率之間的關(guān)系模型(活性污泥脫氮效率模型)，該模型的核心就是通過活性污泥本身的δ15N值來預(yù)測其脫氮性能.為確定該模型中的相關(guān)參數(shù)，對(duì)某A2O工藝的污水處理廠進(jìn)行長期監(jiān)測，并應(yīng)用于具有不同出水特性的污水處理廠，以證明該模型在不同無機(jī)氮組成情況下的適用性.最后，本文還設(shè)置了幾種典型工況，以證明該模型在不同工況下的適用性.該模型的建立，簡化了對(duì)水處理系統(tǒng)復(fù)雜的布點(diǎn)監(jiān)測程序，對(duì)污水處理廠的強(qiáng)化脫氮具有指導(dǎo)意義，為水處理系統(tǒng)脫氮性能評(píng)價(jià)提供了新的手段.本研究提出的檢測方法意在通過監(jiān)測活性污泥的δ15N值，實(shí)現(xiàn)對(duì)污水廠脫氮效率的預(yù)測，同時(shí)表征活性污泥的脫氮活性.與常規(guī)監(jiān)測方法不同，本方法只需取少量污泥，進(jìn)行一定的預(yù)處理后送檢即可計(jì)算出污泥脫氮效率及脫氮活性.該方法在污水處理廠的調(diào)試過程或分析脫氮問題遇到瓶頸時(shí)，可以提供借鑒作用，具有一定的實(shí)用價(jià)值.

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 樣品

　　本實(shí)驗(yàn)所用樣品分別取自陜西省西安市第三、第四及第五污水處理廠.西安市第三污水處理廠采用Orbal氧化溝工藝，轉(zhuǎn)碟曝氣，有效水深4.2 m，生物池總HRT為18 h，SRT為20 d.西安市第四污水處理廠采用內(nèi)嵌氧化溝倒置A2O二級(jí)生物處理工藝，微孔曝氣，有效水深6.0 m，HRT為11 h (其中缺氧池1.98 h，厭氧池1.0 h，內(nèi)嵌氧化溝的好氧池7.94 h)，SRT為24 d.第五污水處理廠一期污水處理規(guī)模20×104 m3·d-1，采用厭氧/缺氧/好氧(A2O)二級(jí)生物處理工藝，3個(gè)生物池的水力停留時(shí)間分別為2 h、5.5 h、8.9 h(金鵬康等，2014).其中，第五污水處理廠好氧池內(nèi)嵌填料氧化溝，以提高氧化能力，系統(tǒng)正常運(yùn)行過程中污泥濃度約為(4200±300), 污泥齡為20 d，污泥回流比為100%±5%，混合液回流比200%±10%.

　　3個(gè)污水廠的生物池進(jìn)水、生物池出水每隔3~5 d取樣1次，每次取樣100 mL.水樣經(jīng)0.45 μm膜過濾后測定常規(guī)指標(biāo);從濾膜上取少量(約1 g)活性污泥于10 mL離心管中，加入7 mL 10%的HCl溶液，振蕩反應(yīng)，除去樣品中的碳酸鹽，將該混合液15000 r·min-1離心1 min，棄去上清液;再加入7 mL超純水、振蕩、洗脫殘余的HCl，將混合液冷凍干燥，15000 r·min-1離心1 min，棄去上清液;洗脫過程重復(fù)兩遍，離心所得污泥樣品經(jīng)冷凍、干燥、研磨后，測定δ15N值.

　　2.2 測試方法

　　水樣常規(guī)指標(biāo)化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)、氨氮(NH4-N)、硝酸鹽氮(NO3-N)、亞硝酸鹽氮(NO2-N)測定方法分別采用重鉻酸鉀法、過硫酸鉀-紫外分光光度法、納氏比色法、紫外分光光度法和N-(1-萘基)-乙二胺光度法，具體操作步驟見國家標(biāo)準(zhǔn)(國家環(huán)境保護(hù)總局，2002).pH采用上海大普PHS-3C型精密酸度計(jì)測定.

　　活性污泥TN的測定需要在水常規(guī)指標(biāo)測定方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行性預(yù)處理，方法如下：稱取1.000 g(精確到0.001)左右樣品，將要測定的樣品稀釋到100 mL，在超聲波里面震動(dòng)30 min，再對(duì)樣品進(jìn)行離心處理(或用水沖洗過的中速濾紙過濾，棄去初濾液20 mL).取上清液5~15 mL按與校準(zhǔn)曲線相同的步驟測量吸光度.

　　冷凍干燥后的活性污泥樣品使用EAS vario PYRO元素分析儀-Isoprime 100同位素比值質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)測定δ15N.樣品的δ15N同位素比值用樣品(Rsmp)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Rstd)的同位素比值(R)(15N/14N)表示(Yamada et al., 2009), 即：

(1)

　　儀器采用的N參考標(biāo)準(zhǔn)為δ15Nair, 國際原子能機(jī)構(gòu)認(rèn)定的咖啡因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品，磺胺為實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，該方法測定15N的標(biāo)準(zhǔn)偏差為±0.3‰.

　　活性污泥樣品采用低溫保存，然后送樣至基因測序公司委托測序.測序沿用高通量基本測序流程，經(jīng)DNA提取、PCR擴(kuò)增、Miseq高通量測序等步驟.DNA提取采用土壤DNA提取方法，高通量測序通過IlluminaMise體系完成.所得結(jié)果進(jìn)行過濾處理，得到優(yōu)化序列，對(duì)優(yōu)化序列在97%相似度水平進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析，分析樣品的多樣性以及群落結(jié)構(gòu)(冷璐等，2015).

　　3 結(jié)果與討論(Results and discussion)3.1 活性污泥δ15N與無機(jī)氮含量關(guān)系模型的建立

　　為建立活性污泥δ15N與水中無機(jī)氮去除效率的關(guān)系模型.首先，用瑞利分餾方程(Mariotti et al., 1981)來表示水中無機(jī)氮同位素組成與脫氮過程的千分富集因子的關(guān)系：

(2)

　　式中，f表示某時(shí)刻，未反應(yīng)的無機(jī)氮占反應(yīng)前總無機(jī)氮的比例;ε表示千分富集因子，與同位素分餾系數(shù)α的關(guān)系為α=1+ε/1000;RA表示某時(shí)刻，未反應(yīng)無機(jī)氮的15N/14N值;RA0表示f=1時(shí)，無機(jī)氮的15N/14N值.

　　如圖 1所示，氨化過程中，同位素富集不明顯(Koba et al., 1998);在亞硝化作用、硝化作用和反硝化作用中，微生物優(yōu)先利用質(zhì)量較輕的14N(Onodera et al., 2015)，硝化過程的千分富集因子高達(dá)29.4‰ ± 2.4‰，而含有較重同位素的分子被富集在液相的含氮化合物中;在活性污泥同化無機(jī)氮的過程中，活性污泥優(yōu)先利用質(zhì)量較輕的14N.盡管如此，當(dāng)活性污泥的生長速率一定時(shí)，雖然活性污泥的同化作用存在著同位素分餾現(xiàn)象，但是活性污泥與污水中無機(jī)氮的氮同位素組成比例即分餾系數(shù)α為常數(shù)(Valero et al., 2007).故活性污泥的RM0和無機(jī)氮的RA0之比等于硝化過程中任意時(shí)刻活性污泥的RM和無機(jī)氮的RA之比，其中RM0與RA0對(duì)應(yīng)，表示f=1時(shí)，活性污泥和水中無機(jī)氮的15N/14N值，RM與RA表示脫氮過程任意時(shí)刻活性污泥和無機(jī)氮的15N/14N值，即：

　　圖 1氮的遷移轉(zhuǎn)化路線及其對(duì)δ15N值的影響

(3)

　　根據(jù)式(1)(2)(3)，剩余無機(jī)氮的占比與脫氮過程中活性污泥的δ15N的關(guān)系可表示為：

(4)

　　因?yàn)�，�?dāng)x≪1時(shí)，ln(x+1)≈x，故式(4)可化為：

(5)

　　此時(shí)，水中剩余無機(jī)氮的占比就可以表示為固相中活性污泥的δ15NM0的函數(shù)，其中，ε和δ15NM0為常數(shù);剩余無機(jī)氮占脫氮反應(yīng)發(fā)生前無機(jī)氮的比例f由[NH4-N+NOx-N]出水/[NH4-N+NOx-N]進(jìn)水定義.

　　活性污泥脫氮效率P即為：

(6)

　　該模型即為活性污泥脫氮效率模型.

　　本研究認(rèn)為活性污泥的增長速率維持恒定.參數(shù)ε和δ15NM0由公式(6)確定.利用觀測到的P與δ15NM，在Microsoft-Excel規(guī)劃求解下利用非線性方法得出參數(shù)ε和δ15NM0的值，目標(biāo)函數(shù)為計(jì)算得出的P與相應(yīng)的實(shí)際觀測值的方差，當(dāng)方差達(dá)到最小值時(shí)，即得到參數(shù)ε和δ15NM0的取值.

　　當(dāng)進(jìn)水無機(jī)氮含量已知時(shí)，可推導(dǎo)出無機(jī)氮的去除量方程.進(jìn)水無機(jī)氮負(fù)荷用c0×Q表示，c0表示進(jìn)水無機(jī)氮濃度(mg·L-1), Q表示系統(tǒng)進(jìn)水量(m3·d-1)，無機(jī)氮去除量W(t·d-1)可以表示為W=[(1-f)]c0×Q×10-6，即:

(7)

　　該模型即為活性污泥脫氮量模型.

　　3.2 參數(shù)計(jì)算

　　為獲得式(6)的模型參數(shù)，本研究對(duì)西安市第五污水處理廠二級(jí)生物處理進(jìn)出水進(jìn)行了長期監(jiān)測.二級(jí)處理過程進(jìn)出水的無機(jī)氮(NH4-N、NO3-N和NO2-N)濃度(圖 2).其中，TN的進(jìn)出水濃度分別為(69.18±7.97) mg·L-1和(15.25±6.31) mg·L-1，NH4-N的進(jìn)出水濃度分別為(40.68±4.96) mg·L-1和(12.63±8.15) mg·L-1，NO3-N和NO2-N的出水濃度分別為(1.07±0.98) mg·L-1和(0.08±0.1) mg·L-1，NO3-N和NO2-N的進(jìn)水濃度極低，在圖中未作表示.檢測到的NO3-N和NO2-N濃度遠(yuǎn)低于NH4-N的去除量，這表明污水中的反硝化反應(yīng)速率很快，屬硝化作用限制因素.

　　圖 2生物池進(jìn)出水水質(zhì)

　　污泥的δ15N值與無機(jī)氮去除率的關(guān)系見圖 3.其中，無機(jī)氮的去除效率為67.58%±22.83%，污泥的δ15N值為8.06±2.00.從圖 3中可以看出污泥δ15N值與無機(jī)氮去除率具有極強(qiáng)的相關(guān)性(r=0.893，p<0.001).故利用本文3.1節(jié)建立的模型(式(6))，將圖 3數(shù)據(jù)在Microsoft-Excel規(guī)劃求解下利用非線性方法得出參數(shù)ε和δ15NM0的值，目標(biāo)函數(shù)為計(jì)算得出的f與相應(yīng)的實(shí)際觀測值的方差，當(dāng)方差達(dá)到最小值時(shí)，取得到參數(shù)ε和δ15NM0的值，計(jì)算結(jié)果為ε=-3.53‰，δ15NM0=3.55‰.已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)表明，在海洋環(huán)境下，浮游生物的δ15N值與NO3-N濃度之間的ε值介于-2.5‰到-5‰之間(Wada et al., 1980)，NO3-N中的δ15N值與NO2-N濃度之間的ε值介于-3‰到-9‰之間(Sigman et al., 2001).本文得到的ε值也處于上述范圍之內(nèi)，計(jì)算結(jié)果合理.

　　圖 3無機(jī)氮去除率與δ15N關(guān)系

　　3.3 參數(shù)驗(yàn)證

　　因?yàn)槲靼彩械谖逦鬯畯S生物池出水無機(jī)氮中95%為氨氮(硝化限制作用)，為驗(yàn)證3.2節(jié)所得參數(shù)在不同無機(jī)氮組成情況下的適用性，本文挑選了出水無機(jī)氮中高硝態(tài)氮含量(反硝化限制作用)和硝態(tài)氮與氨氮含量相當(dāng)(氨化限制作用)的西安市第三、第四污水處理廠進(jìn)行參數(shù)驗(yàn)證.

　　西安市第三、第四污水處理廠生物池進(jìn)出水水質(zhì)特性如表 1所示.將測得的二沉池進(jìn)水中活性污泥的δ15N、ε及δ15NM0帶入式(6)進(jìn)行無機(jī)氮去除效率的預(yù)測并與實(shí)際測得的無機(jī)氮去除率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖 4所示.其中，圖 4a為西安市第三污水處理廠的預(yù)測結(jié)果與實(shí)際值的對(duì)比(r=0.857，p<0.001)，圖 4b為西安市的四污水處理廠的預(yù)測結(jié)果與實(shí)際值的對(duì)比(r=0.886，p<0.001).該結(jié)果表明，上文所得模型對(duì)具有不同水處理限制因素的污水處理廠均適用.

　　圖

　　圖 4西安市第三(a)、第四(b)污水處理廠無機(jī)氮去除率與δ15N的關(guān)系

　　3.4 模型應(yīng)用

　　為進(jìn)一步研究活性污泥脫氮效率模型在不同工況下的適用性，本研究設(shè)置了3種(1#、2#、3#)不同工況的反應(yīng)器.調(diào)節(jié)運(yùn)行參數(shù)，使3個(gè)反應(yīng)器具有不同的脫氮效率.本文對(duì)這三個(gè)反應(yīng)器進(jìn)行了長期觀測，測得3個(gè)反應(yīng)器的實(shí)際去除效率分別為94.54%、74.47%和23%;活性污泥同位素水平為13.97‰、8.33‰和4.47‰.測定每個(gè)循環(huán)的進(jìn)出水無機(jī)氮濃度、反應(yīng)器中活性污泥的δ15N值、進(jìn)水量Q以及模型參數(shù)，分別帶入評(píng)價(jià)模型(式(7))，對(duì)無機(jī)氮的實(shí)際去除量與預(yù)測去除量進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖 5所示.結(jié)果表明，1#(r=0.894，p<0.001)、2#(r=0.821，p<0.01)、3#(r=0.884，p<0.01)反應(yīng)器均表現(xiàn)出顯著相關(guān)，這說明該模型的使用不受工況限制，對(duì)于不同工況下的水處理系統(tǒng)，均可以用式(7)從微生物角度評(píng)價(jià)活性污泥的脫氮性能.

　　圖 5不同工況下無機(jī)氮去除量預(yù)測值與實(shí)際值的對(duì)比

　　為進(jìn)一步研究活性污泥δ15N值與脫氮細(xì)菌多樣性及群落組成之間的關(guān)系，本文對(duì)脫氮效率分別為94.54%、74.47%和23%，活性污泥同位素水平為13.97‰、8.33‰和4.47‰的1#、2#和3#3個(gè)反應(yīng)器中的細(xì)菌多樣性及豐富度進(jìn)行分析.

　　由表 2可以看出，3個(gè)反應(yīng)器的序列條數(shù)和OUT數(shù)差異較大，分別在30875~25188和20244~22341之間.Chao、Shannon、ACE指數(shù)表明各反應(yīng)器中的物種豐富度，其中，Shannon指數(shù)反映了基于物種數(shù)量的群落種類多樣性，其變化趨勢(shì)與Chao和ACE指數(shù)的變化趨勢(shì)一致.總體來看，活性污泥的多樣性指數(shù)與活性污泥脫氮效率和δ15N值成反比，由此可見，活性污泥的脫氮能力和δ15N值對(duì)其多樣性指數(shù)有明顯影響，這部分影響可能與活性污泥中與脫氮作用相關(guān)的微生物有關(guān).具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　為驗(yàn)證上述結(jié)論，對(duì)3個(gè)反應(yīng)器內(nèi)活性污泥的16S rDNA在門分類層面上進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖 6所示.3種活性污泥樣品共檢測出12個(gè)菌門，其中，與脫氮過程相關(guān)的菌門包括Proteobacteria(圖中C色塊), Planctomycetes(圖中B色塊)和Nitrospirae(圖中A色塊)3個(gè)菌門.大多數(shù)反硝化細(xì)菌、氨氧化細(xì)菌、亞硝酸鹽氧化細(xì)菌屬于Proteobacteria門(王春香等，2014)，厭氧氨氧化細(xì)菌屬于Planctomycetes門(曹雁等，2017)，部分亞硝酸鹽氧化細(xì)菌屬于Nitrospirae門(林婷，2012).隨著活性污泥δ15N值的下降，3個(gè)菌門的相對(duì)百分比均呈下降趨勢(shì).1#反應(yīng)器的無機(jī)氮去除率為94.54%，δ15N為13.97‰，Proteobacteria門、Planctomycetes門和Nitrospirae門的相對(duì)百分比在3個(gè)反應(yīng)器中最高，分別為31.12%、18.21%和0.57%，但其種群豐富度卻低于另外兩個(gè)反應(yīng)器，這說明與脫氮相關(guān)的功能性菌群的富集使得其他競爭力較弱的菌群數(shù)量減少，群落豐富度低，但無機(jī)氮去除效率高.2#反應(yīng)器中3個(gè)與脫氮相關(guān)的菌門所占的相對(duì)百分比分別為25.42%、15.17%和0.44%，略低于1#反應(yīng)器，但種群豐富度卻大于1#反應(yīng)器.這解釋了2#反應(yīng)器無機(jī)氮去除效率(74.47%)和δ15N(8.33‰)低于1#反應(yīng)器的內(nèi)因，即與脫氮相關(guān)的功能性菌群比例下降，原本競爭力較弱的菌群種類增多，與功能性菌群爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致2#反應(yīng)器中污泥脫氮活性較1#反應(yīng)器低.3#反應(yīng)器中Proteobacteria門占12.83%、Planctomycetes門8.44%、Nitrospirae門0.15%，在3個(gè)反應(yīng)器中占比最低，因此其無機(jī)氮去除效率(23%)和δ15N(4.47‰)水平也最低，活性污泥脫氮活性的降低也導(dǎo)致了其他種類微生物增多，種群豐富度大幅上升.

　　圖 6不同工況群落組成相對(duì)百分比

　　綜上，活性污泥δ15N值越大，其脫氮性能越強(qiáng)，與脫氮作用相關(guān)的細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo)地位，其種群豐富度越低;活性污泥δ15N值越小，其脫氮性能越差，與脫氮作用相關(guān)的細(xì)菌喪失了其主導(dǎo)作用，種群豐富度增高.

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　1) 建立了污泥脫氮性能評(píng)價(jià)模型，模型描述了在活性污泥持續(xù)生長的硝化反硝化系統(tǒng)中，活性污泥δ15N值與無機(jī)氮去除效率之間的相關(guān)關(guān)系.

　　2) 該模型參數(shù)適用于具有不同無機(jī)氮組成和不同工況的活性污泥處理系統(tǒng).實(shí)現(xiàn)了通過監(jiān)測活性污泥δ15N值，就能夠準(zhǔn)確反饋出生物系統(tǒng)的脫氮能力，為污水廠脫氮問題分析提供了新的方法和思路.

　　3)δ15N值的檢測不僅可以用于模型計(jì)算得出活性污泥無機(jī)氮去除效率，還可以表征活性污泥中微生物的脫氮活性。(來源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào) 作者：孟妮娜)