煤化工企業(yè)排放的廢水中含有大量的酚、氰油、氨氮、多環(huán)芳香族化合物及含氮氧硫的雜環(huán)化合物等有毒有害物質(zhì)，綜合廢水中CODCr一般在2000～5000mg·L-1，氨氮在200～500mg·L-1，是典型的含有難降解有機(jī)化合物的工業(yè)廢水。據(jù)煤化工行業(yè)調(diào)查分析，約70%的機(jī)焦廢水未經(jīng)過(guò)脫氮處理直接外排，30%的機(jī)焦廢水未經(jīng)任何處理直接外排。廢水的超標(biāo)排放對(duì)水產(chǎn)、農(nóng)作物甚至人類健康都構(gòu)成了極大危害，因此，尋找高效的污水處理方法是當(dāng)前急待解決的課題。目前，國(guó)內(nèi)外處理煤化工廢水的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。生物法主要通過(guò)微生物的新陳代謝作用，將廢物吸收、分解，達(dá)到治理污染的目的，因其具有經(jīng)濟(jì)、綠色、安全、有效的特點(diǎn)，得到了廣泛應(yīng)用。污水中常含有多種性質(zhì)不同的物質(zhì)，用單一菌種很難將其徹底降解，在生產(chǎn)中主要以活性污泥法和高效菌劑相結(jié)合來(lái)處理這一問(wèn)題。當(dāng)前，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者在污水生物處理過(guò)程中引入PCR-DGGE方法，用以研究微生物群落的復(fù)雜性，監(jiān)測(cè)種群動(dòng)態(tài)，依據(jù)污水處理過(guò)程中的群落動(dòng)態(tài)變化，調(diào)節(jié)實(shí)際工藝參數(shù)，提高污水處理效率。本研究主要對(duì)煤化工廢水中篩選出的高效COD降解菌進(jìn)行生物強(qiáng)化，對(duì)菌株進(jìn)行高效配比研究，制成生物菌劑，研究其在污水處理過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化及降解特性，以期為提高煤化工廢水處理系統(tǒng)的效率提供科學(xué)依據(jù)。

　　材料

　　樣品來(lái)源

　　樣品主要采自中國(guó)神華煤制油化工有限公司包頭煤化工分公司(污水1)、康達(dá)東營(yíng)環(huán)保水務(wù)有限公司(污水2)、中海油天津化工研究設(shè)計(jì)院(污水3)。采回的樣品置于4℃保存。

　　培養(yǎng)基

　　分離培養(yǎng)基(固體)。牛肉膏1.5g，蛋白胨2.5g，KH2PO40.725g，Na2HPO41.136g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.02g，NaHCO385mg，2%瓊脂，微量元素Ⅰ，微量元素Ⅱ，蒸餾水1000mL，pH值7.0～8.0。其中，微量元素Ⅰ:FeSO45mg，EDTA5mg;微量元素Ⅱ:EDTA15mg，ZnSO4·7H2O4.3mg，CoCl2·6H2O2.4mg，MnCl26.29mg，CuSO4·5H2O2.5mg，Na2MoO4·2H2O2.2mg，NiCl2·6H2O1.9mg，H3BO30.14mg。將上述配置好的培養(yǎng)基置于0.11MPa，121℃條件下滅菌20min。富集培養(yǎng)基(液體)。C6H12O61.2g，其他成分同分離培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配好后置于0.11MPa，115℃條件下滅菌25min。

　　復(fù)篩培養(yǎng)基。配制模擬污水，COD濃度分別為2560，3040，5280mg·L-1，pH值7.0～8.0(用5%Na2CO3和HCl調(diào)pH值)。配好的培養(yǎng)基于0.11MPa，115℃條件下滅菌25min。

　　COD試劑

　　Ag2SO4，HgSO4，K2Cr2O7，C6H4(COOH)(COOK)，均為分析純，均購(gòu)自天津市化學(xué)試劑研究所。

　　DGGE試劑

　　DuRed核酸染料，40%C3H5NO/Bis(37.5∶1)，50×TAEBuffer，0%變性液(10%Gel)，80%變性液(10%Gel)，10%(NH4)2S2O8，1μL·mL-1TEMED。

　　煤化工廢水COD降解菌篩選

　　煤化工廢水取樣后富集培養(yǎng)，采用稀釋涂布平板法、平板劃線分離法篩選分離COD降解菌。分離純化菌株，4℃斜面保藏。按5%接種量接種至裝有100mL滅菌模擬污水培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃，150r·min-1振蕩培養(yǎng)，48h后更換培養(yǎng)基并逐步提高模擬污水COD濃度，測(cè)定降解后模擬廢水COD濃度，計(jì)算菌株降解率。

　　OD降解率測(cè)定

　　采用快速消解分光光度法對(duì)化學(xué)需氧量進(jìn)行測(cè)定。取待測(cè)菌懸液樣品10mL，7000r·min-1離心10min，上清液稀釋至COD量程范圍內(nèi)，加入到裝有消解液的消解管中，放入HACH消解儀消解，波長(zhǎng)600nm測(cè)吸光度，超純水作參照，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算COD降解率。

　　ρ(COD)=n[k(As-Ab)+a]。(1)

　　式(1)中，ρ(COD)為水樣COD值，n為水樣稀釋倍數(shù)，k為鄰苯二甲酸氫鉀COD校準(zhǔn)曲線靈敏度，As為試樣測(cè)定的吸光度，Ab為空白試驗(yàn)測(cè)定吸光度，a為校準(zhǔn)曲線截距。

　　M/%=100×(x0-x)/x0。(2)

　　式(2)中，M為COD降解率，x為反應(yīng)后COD濃度，x0為初始COD濃度。

　　生物菌劑的復(fù)配研究

　　將篩選出的5株高效菌株搖瓶培養(yǎng)，采用不同方式進(jìn)行組合，測(cè)各組合COD降解率，得最優(yōu)復(fù)配組合，配制成菌劑進(jìn)行生物強(qiáng)化研究。具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　生物菌劑的生物強(qiáng)化

　　取3種煤化工污水進(jìn)水水樣和氧化段活性污泥。在最優(yōu)降解條件下，將生物菌劑分別接種3種污水培養(yǎng)基，并對(duì)高效降解菌的降解特性進(jìn)行研究。處理1到處理3，分別向污水1到污水3中加入菌劑;處理4到處理6，分別向污水1到污水3中加入菌劑及活性污泥;處理7到處理9，分別向污水1到污水3中加入活性污泥。

　　每組樣品廢水體積150mL，接菌量統(tǒng)一按照10%設(shè)置，投加污泥量統(tǒng)一為75mL。試驗(yàn)所加活性污泥系生物菌劑強(qiáng)化，出水鏡檢，微生物量較少時(shí)，污泥強(qiáng)化完成。每組試驗(yàn)平行2次。各處理均于30℃，150r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每隔24h測(cè)定各處理COD降解率。

　　PCR

　　采用OMEGA-SoilDNAKit試劑盒提取污泥DNA，采用LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR試劑盒提取菌株DNA。PCR擴(kuò)增采用TouchDownPCR模式運(yùn)行。先對(duì)16SrDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物是27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-TACCTTGTTACGACTT-3');然后再對(duì)16SrDNA的V3可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物是338f-GC(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和518r(5'-ATACCGCGGCTGCTGG-3')。PCR反應(yīng)體系(50μL):10×PCRBuffer(Mg2+)5μL，dNTPmixture(各2.5mmol·L-1)4.0μL，引物各1μL(10pmol·μL-1)，模板DNA2.5ng，TaKaRaTaq酶(5U·μL-1)0.25μL，滅菌蒸餾水定容至50μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.1℃，終至51.5℃，35個(gè)循環(huán);72℃最終延伸10min，4℃保存。取2μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，0.8%瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)菌落16SrDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化測(cè)序，步確定所分離細(xì)菌的分類學(xué)地位。

　　DGGE

　　采用Bio-Rad公司UniversalMutation檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)神華廢水的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。具體步驟:制備垂直膠，確定分離含有核苷酸改變的DNA片段的最佳梯度范圍;制備水平膠，用梯度混合器制備變性劑濃度不同的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從膠的上方向下方依次遞增，待膠凝固后，將膠板放入裝有電泳緩沖液的裝置中。經(jīng)前期條件優(yōu)化，確定DGGE操作條件:樣品/上樣緩沖液為6∶1，上樣15μL，電壓60V，60℃條件下電泳15.5h;DuRed凝膠染色，搖床振蕩30min，超純水沖洗脫色;最后用QuantityOne4.6.2軟件分析DGGE圖譜，得各樣品間相似性矩陣圖，研究微生物多樣性、豐富度、條帶強(qiáng)度分布情況和不同處理階段樣品中微生物相似性等。選擇條帶強(qiáng)度較大的優(yōu)勢(shì)菌帶，切膠回收，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的V3區(qū)，DGGE分析是否為單一菌。

　　本研究篩選得到5株COD高效降解菌，將菌株經(jīng)復(fù)配、污泥強(qiáng)化，得到強(qiáng)化菌劑，對(duì)3種煤化工廢水COD的去除率均達(dá)89.3%以上，抗沖擊負(fù)荷能力顯著增強(qiáng)，菌劑在投加污水后經(jīng)過(guò)適應(yīng)期后一直占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，且對(duì)高濃度COD污水的處理效果也很理想，表明該菌劑具有發(fā)展成為商品菌劑的潛力。開(kāi)發(fā)該商品菌劑有利于節(jié)約污水處理成本，對(duì)污水處理系統(tǒng)的快速啟動(dòng)也具有積極意義。