1 引言

　　養(yǎng)殖污水和液態(tài)排泄物是集約化畜禽養(yǎng)殖場污染物無害化處理的難點.目前，規(guī)�；�畜禽養(yǎng)殖場的污水通常采用沼氣池厭氧發(fā)酵進行處理，但產(chǎn)生的數(shù)量巨大的沼液中仍然含有高濃度的氮磷等營養(yǎng)鹽.隨著農(nóng)村城鎮(zhèn)化進程的推進，消納沼液的耕地日漸不足，產(chǎn)生的沼液直排到水體中，將會導(dǎo)致自然水體嚴重富營養(yǎng)化.如何凈化沼液越來越成為規(guī)�；�畜禽養(yǎng)殖場可持續(xù)發(fā)展的制約因素.

　　微藻屬于光合自養(yǎng)型生物，在自然界廣泛分布，能有效吸收利用水體中的氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)，很早就被人們用以處理污水、凈化環(huán)境.同時，微藻也是十分重要的生物資源，微藻細胞營養(yǎng)豐富，含多種生理活性物質(zhì)，某些微藻在特定的培養(yǎng)條件下能選擇性地蓄積高附加值的產(chǎn)品.利用微藻生產(chǎn)生物柴油或單細胞飼料蛋白源是當前微藻開發(fā)利用的熱點.若能利用養(yǎng)殖場污水培養(yǎng)產(chǎn)油微藻，既可以利用微藻凈化污水，還能為微藻生物柴油的生產(chǎn)提供資源，一舉兩得.

　　因此，本文選擇了15株淡水微藻，在實驗室條件下考察其在豬場養(yǎng)殖污水中的生長性能及其對污水中氮磷的去除效果，并檢測利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的各株微藻的細胞蛋白含量和脂肪酸組成，以期為豬場養(yǎng)殖污水的無害化高效凈化處理篩選出合適的藻株.

　　2 材料與方法

 　　2.1 試驗材料

　　2.1.1 豬場養(yǎng)殖污水

　　豬場養(yǎng)殖污水取自浙江嘉興余新鎮(zhèn)敦好農(nóng)牧有限公司的養(yǎng)豬場.養(yǎng)殖污水經(jīng)過厭氧發(fā)酵及露天氧化塘沉淀處理后，用于本試驗.試驗用污水的水質(zhì)狀況如表 1所示.

　　表1 試驗用豬場養(yǎng)殖污水的水質(zhì)狀況

　　2.1.2 試驗藻株

　　試驗用15個藻株均取自上海海洋大學生物餌料研究室微藻種庫，分別為纖維藻(Ankistrodesmus sp.)SHOU-F1、橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)SHOU-F3、單生卵囊藻(Oocystis solitaria)SHOU-F5、多棘柵藻(Scenedesmus spinosus)SHOU-F7、多棘柵藻(S. spinosus)SHOU-F8、肥壯蹄形藻(Kirchneriella obesa)SHOU-F9、斜生柵藻(S. obliquus)SHOU-F17、淡水小球藻(Chlorella sp.)SHOU-F19、橢圓小球藻(Ch.ellipsoidea)SHOU-F20、斜生柵藻(S.obliquus)SHOU-F21、四球藻(Tetrachlorella alternans)SHOU-F24、鐮形纖維藻(A.falcatus)SHOU-F26、小球藻(Chlorella sp.)SHOU-F28、四尾柵藻(S. quadric and a)SHOU-F35和針形纖維藻(A. acicularis)SHOU-F120.

　　2.2 試驗方法

　　2.2.1 藻種接種及培養(yǎng)

　　將各藻株先于f/2培養(yǎng)基中擴培，待培養(yǎng)到一定數(shù)量后，離心收集藻細胞，將藻細胞分別接種到經(jīng)高壓滅菌后的豬場養(yǎng)殖污水中，接種密度為2.0×106 cells · mL-1左右.將接種后的藻液在溫度25 ℃、光照1800 lx、光照周期24 h/0 h(L : D)的條件下培養(yǎng)，每天定時搖瓶.培養(yǎng)20 d后，測定藻細胞密度、培養(yǎng)液氮磷含量、藻細胞蛋白含量及脂肪酸組成.

　　2.2.2 微藻生長檢測

　　培養(yǎng)開始和結(jié)束時用血球計數(shù)板測定藻細胞密度，并根據(jù)公式K=(lnNt -lnN0)/t計算相對生長率，其中，N0為培養(yǎng)初始藻細胞密度(cells · mL-1)，Nt為經(jīng)過t時間后培養(yǎng)液中的藻細胞密度(cells · mL-1)，t為培養(yǎng)時間(d).測定平行3次.

　　2.2.3 藻細胞干重測定

　　取30 mL藻液，用預(yù)先恒重的0. 45 μm 濾膜抽濾，然后將濾膜再次恒重，計算藻細胞的生物量.測定平行2次.

　　2.2.4 水質(zhì)指標測定

　　用0.45 μm 濾膜過濾藻液，然后參照水和廢水監(jiān)測分析方法(第4版)(國家環(huán)境保測定濾液中氮磷，總氮測定采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法，氨態(tài)氮測定采用納氏試劑分光光度法，硝態(tài)氮測定采用紫外分光光度法，總磷測定采用鉬酸銨分光光度法.測定設(shè)2個平行.

　　氮、磷去除率r的計算公式為：r=(C0-Ct)/C0×100%，其中，C0和Ct分別為初始氮磷的濃度和培養(yǎng)t天后的濃度(mg · L-1).

　　2.2.5 蛋白含量測定

　　藻細胞蛋白含量的測定參照福林-酚測蛋白法進行，每藻株平行測定3次.

　　2.2.6 脂肪酸含量測定

　　藻細胞脂肪酸含量的測定參照文獻方法進行.稱100 mg濕樣(離心后去水)至帶硅膠襯里螺旋帽的15 mL棕色螺紋口頂空瓶中，加入250 μL C19-甲苯溶液(濃度0.2 mg · mL-1)，漩渦混勻后，加2 mL甲醇鈉(NaOMe，0.5 mol · L-1)，置于超聲波清洗機中80 ℃水浴混勻20 min;冷卻至室溫后，加2 mL BF3-甲醇溶液(14%)，再置于超聲波清洗機中80 ℃水浴混勻20 min;冷卻至室溫后，加800 μL去離子水和1200 μL正己烷，漩渦混勻后，4000 r · min-1離心3min，將上層含有脂肪酸甲酯的正己烷-甲苯層轉(zhuǎn)移至小玻璃瓶中，于氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀上參照文獻方法檢測脂肪酸含量.定量分析時采用對各組分峰面積積分，用歸一化法計算出脂肪酸組分的百分含量(以占脂肪酸總量的百分比表示).

　　各微藻脂肪酸甲酯的理論烷基值參照文獻的方法進行計算(Cetane Number，CN).

　　2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

　　結(jié)果以平均值±標準差表示，采用PASW.Statistics.18.0軟件進行方差分析并作Duncan多重比較，p<0.05表示差異顯著.

　　3 結(jié)果

　　3.1 不同微藻藻株在豬場養(yǎng)殖污水中的生長性能

　　由表 2可以看出，試驗條件下，小球藻SHOU-F28相對生長率最高，為0.15;其次為多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8和斜生柵藻SHOU-F21，3種柵藻的相對生長率分別為0.12、0.13和0.11;單生卵囊藻SHOU-F5、橢圓小球藻SHOU-F3、斜生柵藻SHOU-F17和針形纖維藻SHOU-F120的相對生長率最低.

　　表2 不同微藻藻株在豬場養(yǎng)殖污水中的生長性能

　　3.2 不同微藻藻株對豬場養(yǎng)殖污水中總氮的去除效果

　　豬場養(yǎng)殖污水經(jīng)高壓滅菌消毒后，水體中氮含量略有減少，總氮為30.00 mg · L-1，氨態(tài)氮14.00 mg · L-1，硝態(tài)氮14.00 mg · L-1.不同藻株對養(yǎng)殖污水中總氮表現(xiàn)出不同的去除效果(表 3)，多棘柵藻SHOU-F7和多棘柵藻SHOU-F8的總氮去除率最高(均為93.25%)，其次為四尾柵藻SHOU-F35(92.74%)、單生卵囊藻SHOU-F5(91.73%)和斜生柵藻SHOU-F21(87.78%)，纖維藻SHOU-F1、淡水小球藻SHOU-F19、小球藻SHOU-F28和針形纖維藻SHOU-F120對豬場養(yǎng)殖污水總氮的去除率較低，去除率僅為50.00%左右.

　　表3 不同微藻藻株對豬場養(yǎng)殖污水中總氮的去除效果

　　3.3 不同微藻藻株對豬場養(yǎng)殖污水中氨態(tài)氮的去除效果

　　從氨態(tài)氮的去除率來看(表 4)，橢圓小球藻SHOU-F3、單生卵囊藻SHOU-F5、多棘柵藻SHOU-F8、肥壯蹄形藻SHOU-F9、斜生柵藻SHOU-F17、橢圓小球藻SHOU-F20、斜生柵藻SHOU-F21、四球藻SHOU-F24、鐮形纖維藻SHOU-F26、小球藻SHOU-F28和四尾柵藻SHOU-F35對氨態(tài)氮的去除率均在95.00%以上，去除率最低的是淡水小球藻SHOU-F19，去除率為78.43%.

　　表4 不同微藻藻株對豬場養(yǎng)殖污水中氨態(tài)氮的去除效果

　　3.4 不同微藻藻株對豬場養(yǎng)殖污水中硝態(tài)氮的去除效果

　　由表 5可知，多棘柵藻SHOU-F7和多棘柵藻SHOU-F8對污水中硝態(tài)氮的去除率最高，均達100%;其次為四尾柵藻SHOU-F35(99.61%)、單生卵囊藻SHOU-F5(99.21%)和斜生柵藻SHOU-F21(97.14%);針形纖維藻SHOU-F120對硝態(tài)氮的去除率最低，僅為39.75%.

　　表5 不同微藻藻株對豬場養(yǎng)殖污水中硝態(tài)氮的去除效果

　　3.5 不同微藻藻株對豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除效果

　　由表 6可知，試驗用各株微藻對豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除率很高，基本在90.00%以上，尤以斜生柵藻SHOU-F21、淡水小球藻SHOU-F19、多棘柵藻SHOU-F7、四尾柵藻SHOU-F35和多棘柵藻SHOU-F8對總磷的去除率高，可達到97.00%以上.

　　表6 不同微藻藻株對豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除效果

　　3.6 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的微藻細胞蛋白含量

　　利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的各株試驗微藻的藻細胞蛋白含量介于23.87%~43.90%之間(表 7).橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的蛋白含量分別為43.90%、38.28%和37.35%，顯著高于其他微藻.多棘柵藻SHOU-F7和多棘柵藻SHOU-F8的細胞蛋白含量最低.

　　表7 豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的微藻藻細胞蛋白含量

　　3.7 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的微藻藻細胞脂肪酸組成

　　由表 8可以看出，15株微藻細胞脂肪酸組成各不相同，但16 : 0和18 : 3n3含量在所有藻株中均較高.3種纖維藻(纖維藻SHOU-F1、鐮形纖維藻SHOU-F26和針形纖維藻SHOU-F120)的脂肪酸組成相近，16 : 0、16 : 4n3、18 : 1n9、18 : 2n6和18 : 3n3是纖維藻的主要脂肪酸.4種小球藻中，橢圓小球藻SHOU-F3和橢圓小球藻SHOU-F20的脂肪酸組成較接近，含有極豐富的18 : 2n6，且18 : 3n3和16 : 2n6含量較高;淡水小球藻SHOU-F19含豐富的18 : 3n3和18 : 1n9，18 : 2n6的含量很低;小球藻SHOU-F28含豐富的18 : 3n3和18 : 2n6，但18 : 1n9和16 : 2n6的含量很低.5種柵藻中，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、斜生柵藻SHOU-F21和四尾柵藻SHOU-F35均含有較為豐富的18 : 2n6和18 : 3n3，而斜生柵藻SHOU-F17含有極豐富的18 : 3n3，但18 : 2n6含量較低.單生卵囊藻SHOU-F5和肥壯蹄形藻SHOU-F9的脂肪酸組成中，18 : 3n3含量很高，但18 : 2n6含量較低.根據(jù)脂肪酸組成計算得到的脂肪酸甲酯的理論烷基值，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、淡水小球藻SHOU-F19和針形纖維藻SHOU-F120的理論烷基值較高，分別為48.70、47.21、47.66和47.06.

　　表8 豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的微藻藻細胞脂肪酸組成

　　4 討論

　　微藻是光能自養(yǎng)型生物，以水為電子供體，以CO2為碳源，通過光合作用將光能轉(zhuǎn)化為化學能貯存在藻細胞內(nèi)供細胞代謝.在代謝過程中，微藻細胞需要將環(huán)境中的N、P等元素吸收到藻細胞內(nèi)，以合成藻細胞內(nèi)各組成成分，在此過程中細胞外環(huán)境中的氮磷水平逐步降低.此外，微藻細胞對水環(huán)境中的N、P及重金屬等物質(zhì)也具有不同程度的吸附及富集作用，從而使污水得到凈化.從15株微藻在豬場養(yǎng)殖污水中的生長性能可以看出，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8和斜生柵藻SHOU-F21的相對生長率高，細胞增長快，說明上述柵藻具有較高的耐污能力，這與很多學者報道的關(guān)于選用柵藻來處理生活污水或者工業(yè)污水是一致的.

　　從各株微藻對養(yǎng)殖污水中總氮的去除率看，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、四尾柵藻 SHOU-F35、斜生柵藻SHOU-F21和單生卵囊藻SHOU-F5對豬場養(yǎng)殖污水的總氮去除率都很高，經(jīng)多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8和四尾柵藻SHOU-F35處理后，養(yǎng)殖污水的總氮水平接近2 mg · L-1，基本達到了地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB 3838-2002)的Ⅴ類水總氮要求.從各株微藻對養(yǎng)殖污水中氨態(tài)氮的去除率看，除纖維藻SHOU-F1、淡水小球藻SHOU-F19及針形纖維藻SHOU-F120外，其余試驗微藻均能將養(yǎng)殖污水中的氨態(tài)氮從14 mg · L-1降低到2 mg · L-1以下，達到地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB 3838-2002)的Ⅴ類水氨態(tài)氮要求，其中，橢圓小球藻SHOU-F3、單生卵囊藻SHOU-F5、多棘柵藻SHOU-F8、肥壯蹄形藻SHOU-F9、斜生柵藻SHOU-F17、橢圓小球藻SHOU-F20、四球藻SHOU-F24、鐮形纖維藻SHOU-F26、小球藻SHOU-F28和四尾柵藻SHOU-F35更是將污水的氨態(tài)氮降到0.5 mg · L-1以下，達到了地表水環(huán)境質(zhì)量標準Ⅱ類水標準.報道小球藻對模擬的養(yǎng)殖廢水的氮磷有很好的去除效果，對水體中氨態(tài)氮的去除率達到80%以上，對磷的去除率達到85%以上.利用蛋白核小球藻和柵藻對沉淀的污水和活性污水進行處理，結(jié)果表明，兩種微藻對沉淀的污水的總磷和無機氮的去除率達到80%，并且蛋白核小球藻比柵藻處理效果更好.利用蛋白核小球藻對乙醇發(fā)酵的廢水進行處理可以實現(xiàn)廢水的循環(huán)利用.從各株微藻對養(yǎng)殖污水中硝態(tài)氮的去除效果看，單生卵囊藻SHOU-F5、多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、斜生柵藻SHOU-F17、斜生柵藻SHOU-F21和四尾柵藻SHOU-F35也均能將養(yǎng)殖污水中的硝態(tài)氮從14 mg · L-1降低到2 mg · L-1以下.15株微藻對豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除率都很高，均在90%以上，經(jīng)微藻處理后的養(yǎng)殖污水中總磷的水平均降低到0.2 mg · L-1以下，達到了地表水的Ⅱ~Ⅲ類標準.因此，綜合本試驗各株微藻對養(yǎng)殖污水中總氮、氨態(tài)氮、硝態(tài)氮和總磷的凈化效果，多棘柵藻SHOU-F8和四尾柵藻SHOU-F35能夠?qū)⒇i場養(yǎng)殖污水凈化并達到排放標準.

　　不同藻種及同種藻不同株系對污水中不同形態(tài)氮的凈化效果可能與藻種(株)的內(nèi)在生理特性差異有關(guān).已有報道表明，小球藻對污水中氨態(tài)氮的去除效果較好.研究認為，小球藻能夠較好地去除水產(chǎn)加工廢水中的氨態(tài)氮.報道，小球藻在無光異養(yǎng)條件下能利用啤酒廠污水中多種營養(yǎng)成分，且能去除污水中的氨態(tài)氮并將它們轉(zhuǎn)化為細胞中的蛋白質(zhì)、葉綠素等含氮物質(zhì)，同時顯著地降低污水中的COD和BOD.的研究表明，斜生柵藻去除硝態(tài)氮效果最好.利用柵藻LX1對由不同氮源配制的培養(yǎng)液進行處理，結(jié)果表明，柵藻LX1對以硝酸鹽和尿素作為氮源的培養(yǎng)液的氮磷去除效果較氯化銨作為氮源的好，能去除90%的總氮和將近100%的總磷;而氯化銨作為氮源，氮磷的去除率僅為31.1%和76.4%.微藻對水環(huán)境中氮磷的凈化效果也與藻細胞濃度、pH、溫度、光照強度和培養(yǎng)周期等影響藻類生長的因素有關(guān).培養(yǎng)液中氮磷組合濃度不同會影響小球藻對氮磷的吸收，升高溫度或加強光照有利于小球藻對磷、氮的吸收，在最佳pH條件下，小球藻對氮磷的吸收率可達80%左右.

　　由于魚粉資源的短缺，新型飼料蛋白源的開發(fā)是水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料研究的熱點之一.單細胞微藻蛋白是重要的潛在蛋白源，螺旋藻和小球藻已作為單細胞蛋白源和飼料添加劑加以應(yīng)用.本研究表明，15株微藻細胞蛋白含量均在20%以上，達到蛋白質(zhì)飼料的標準.其中，橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的蛋白含量分別達43.90%、38.28%和37.35%，可與常用植物蛋白源豆粕(蛋白含量42%~48%)及菜籽粕(35%~38%)相媲美.而且，橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的細胞中含有豐富的亞油酸(18 : 2n6)和亞麻酸(18 : 3n3)(表 8).亞油酸和亞麻酸是陸生動物及淡水魚類的必需脂肪酸.因此，利用豬場養(yǎng)殖污水開展橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的培養(yǎng)以獲得飼料蛋白源或飼料添加劑具有潛在的開發(fā)價值.

　　本研究中，單生卵囊藻SHOU-F5、肥壯蹄形藻SHOU-F9和四球藻SHOU-F24的蛋白含量分別為35.03%、31.24%和30.73%.而在適宜的光照和溫度條件下用f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)的單生卵囊藻SHOU-F5、肥壯蹄形藻SHOU-F9和四球藻SHOU-F24的蛋白含量分別為27.61%、25.09%和23.08%.本研究各微藻的蛋白含量均較高，這可能與微藻培養(yǎng)液中氮的水平差異有關(guān).已有的研究表明，培養(yǎng)液中高的氮磷濃度有利于微藻合成蛋白質(zhì).養(yǎng)殖污水中的氮磷含量顯著高于f/2培養(yǎng)基中的氮磷水平.

　　21世紀，人類面對能源和水資源雙重危機和挑戰(zhàn)，基于微藻培養(yǎng)的污水深度處理和生物柴油生產(chǎn)耦合系統(tǒng)具有廣闊的發(fā)展前景.微藻生產(chǎn)生物能源中，利用污水培養(yǎng)產(chǎn)油微藻，既可以利用微藻使污水再生利用，還可以為能源微藻生產(chǎn)生物柴油提供資源，一舉兩得.概述了微藻深度脫氮除磷技術(shù)、微藻生產(chǎn)生物能源的研究現(xiàn)狀，并提出了將污水處理工藝和生產(chǎn)工藝耦合的概念，實現(xiàn)污水處理系統(tǒng)從“處理工藝”向“生產(chǎn)工藝”的轉(zhuǎn)化利用二級污水對分離出的淡水柵藻進行搖瓶培養(yǎng)，并和11種高油脂含量的微藻進行比較，結(jié)果顯示，柵藻對污水有很強的耐受力，生物量能達到0.11 g · L-1，總脂含量為31%~33%，在10 d培養(yǎng)中，油脂產(chǎn)率最高為0.008 g · L-1 · d-1，并且能有效地去除無機營養(yǎng)物質(zhì)，總氮總磷去除率達到98%，說明柵藻是耦合污水處理和生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良藻種.

　　烷基值是影響生物柴油點火性能的關(guān)鍵因素，也影響生物柴油燃燒后的污染物排放水平，高烷基值的生物柴油往往具有較低的氮氧化物排.而微藻生物柴油的烷基值則由微藻脂肪酸組成決定.根據(jù)美國生物柴油標準，生物柴油烷基值最低不得低于47，而從本研究中各株微藻脂肪酸甲酯的理論烷基值看，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、淡水小球藻SHOU-F19和針形纖維藻SHOU-F120的理論烷基值(CN)較高，分別為48.70、47.21、47.66和47.06.因此，利用豬場養(yǎng)殖污水養(yǎng)殖多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、淡水小球藻SHOU-F19和針形纖維藻SHOU-F120用于微藻生物柴油的生產(chǎn)具有較好的可行性.從污水凈化耦合微藻生物柴油生產(chǎn)角度考慮，多棘柵藻SHOU-F8是合適的藻株.具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　5 結(jié)論

　　1)多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8和四尾柵藻SHOU-F35是豬場養(yǎng)殖污水氮磷凈化的適宜藻株，能夠?qū)�養(yǎng)殖污水的氮磷降低到地表Ⅴ類水標準，且多棘柵藻SHOU-F8是豬場養(yǎng)殖污水凈化耦合微藻生物柴油生產(chǎn)的合適藻株.

　　2)利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28，具有高的蛋白含量(37.35%~43.90%)及豐富的亞油酸和亞麻酸，具備作為飼料蛋白源或飼料添加劑的潛在開發(fā)價值.