1 引言

　　活性污泥是微生物與懸浮物質(zhì)、膠體物質(zhì)混凝交織在一起所形成的絮狀物質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)和功能的中心是菌膠團(tuán).在菌膠團(tuán)上，生長著細(xì)菌、真菌、原生動物和某些后生動物，這些微生物能分泌具有粘著性的膠狀物質(zhì)，對微小顆粒和可溶性有機(jī)物有強(qiáng)烈的吸附能力，在水流的作用下與懸浮顆粒相碰撞、粘連，形成活性污泥絮體.通過重力作用進(jìn)行泥水分離是活性污泥處理系統(tǒng)中的重要環(huán)節(jié)，污泥的沉降性能決定了處理工藝的整體效率.已經(jīng)被研究的影響污泥沉降性能的主要因素包括：絲狀菌含量、絮體的粒徑分布、絮體的表面電荷和絮體的親疏水性等.目前普遍認(rèn)為，絲狀菌數(shù)量增多時，絮體變得松散.絮體的表面凈負(fù)電荷可以在絮體之間產(chǎn)生排斥勢能，使絮體難以進(jìn)一步接觸凝聚.絮體的親疏水性決定了其內(nèi)部的含水率，含水率越高污泥比重越小.胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substance，EPS)是微生物所分泌的覆蓋在細(xì)菌細(xì)胞壁外的高分子物質(zhì)，它的含量和組成對活性污泥的絮體結(jié)構(gòu)、表面電荷、親疏水性和沉降性能都有很大影響.此外，微生物群落結(jié)構(gòu)也是影響活性污泥處理系統(tǒng)正常運(yùn)行的重要因素.微生物種群豐富意味著其內(nèi)部貯存著可以在不同環(huán)境下生長具有不同特性的微生物，因此，可以抵抗環(huán)境的劇烈變化.微生物種群豐富強(qiáng)化了其對特定功能的保持及對沖擊負(fù)荷的快速恢復(fù)能力，同時豐富了基質(zhì)的利用途徑.

　　在生物流化床處理工程泥水分離區(qū)中，基于不同流體運(yùn)動速度，污泥相存在比重方面的差異，密實型絮團(tuán)沉在底部，顆粒大，而在反應(yīng)器的頂部，通常會出現(xiàn)少量污泥游離于上清液中難以沉降.因此，可以通過沉降作用或流體力場分離作用實現(xiàn)基于上述現(xiàn)象污泥的異質(zhì)性分離，由此，本文把通過異質(zhì)性分離得到的沉降速度快慢不同的污泥分別定義為聚結(jié)型污泥與離散型污泥，探究所分離的污泥在活性、胞外聚合物與微生物群落結(jié)構(gòu)方面是否存在內(nèi)部相關(guān)性.離散型污泥與聚結(jié)型污泥相比，其絮體顆粒更小，結(jié)構(gòu)更松散.目前還沒有發(fā)現(xiàn)針對生物流化床處理系統(tǒng)活性污泥的這種異質(zhì)性加以研究的文獻(xiàn)報道.為了初步考察聚結(jié)型污泥與離散型污泥的活性差異，本文采用連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行3年以上的焦化廢水處理工程好氧工藝的混合液作為研究對象，該生物處理單元采用流化床結(jié)構(gòu)，生物流化床通過置入軸向內(nèi)導(dǎo)流筒使氣液固三相在反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)運(yùn)動.混合液在強(qiáng)大的氣流沖擊性下呈流化態(tài)，因此，污泥呈絮體狀.利用旋流離心的方法分離出離散型絮狀污泥，以聚結(jié)型絮狀污泥作為對照，在異質(zhì)性方面考察兩種污泥在EPS、微生物活性和微生物群落結(jié)構(gòu)方面的差異.其中，微生物活性用有機(jī)物平均降解速率和比耗氧速率來表征.上述研究工作的動機(jī)是，若能夠證明在廢水生物處理工程中存在污泥的異質(zhì)性，而又可以通過工程手段應(yīng)用污泥的異質(zhì)性，則有可能調(diào)控生物處理系統(tǒng)使之處于污泥性質(zhì)分配功能化的過程，有選擇性地從反應(yīng)器中識別污泥齡長的老化污泥，由此保持系統(tǒng)內(nèi)的高活性.

　　2 材料與方法

　　2.1 污泥的采集與分離

　　本研究采集的水樣與活性污泥樣品均來自寶鋼集團(tuán)廣東韶鋼焦化廠酚氰廢水處理站，該廢水處理站始建于2004年，由本團(tuán)隊提供技術(shù)并設(shè)計，生物處理水量為70~80 m3 · h-1，處理出水穩(wěn)定在《煉焦化學(xué)工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB16171—2012)限值以內(nèi).本研究從二級好氧池采集泥水混合液20 L，將混合液倒入水桶中，使用木棒緩慢攪動，利用離心作用分離污泥.從水桶邊緣采集到的污泥為比重更大的聚結(jié)型污泥，從水桶中央采集到的污泥為比重更輕的離散型污泥.采集污泥后立即測定污泥常規(guī)指標(biāo).

　　2.2 有機(jī)物降解實驗

　　通過比較兩種污泥的有機(jī)物降解速率來考察微生物活性的差異，具體做法為：通過離心機(jī)將聚結(jié)型污泥與離散型污泥脫水，得到含水率基本一致的濕污泥.將焦化廢水原水稀釋1倍，調(diào)節(jié)pH至7.0~7.5，按C ∶ N ∶ P=100 ∶ 5 ∶ 1的比例添加KH2PO4，獲得實驗廢水.搖瓶實驗設(shè)置4組對照組，所添加的濕污泥分別為3.0、6.0、9.0、12.0 g.投加配制好的實驗廢水250 mL，搖勻后立即從各搖瓶中取混合液100 mL測定MLSS和MLVSS. 隨后用薄膜和紗布封口，放入搖床中，溫度和轉(zhuǎn)速分別設(shè)為(30.0±1.0)℃和200 r · min-1.定時取樣檢測COD和TOC濃度，有機(jī)物平均降解速率按式(1)和(2)計算.

　　式中，[COD]0、[TOC]0和[COD]t、[TOC]t分別為某一時間段內(nèi)初始時和終止時的COD和TOC濃度(mg · L-1)，t為間隔時間(h)，[MLVSS]為揮發(fā)性懸浮固體濃度(mg · L-1).

　　2.3 測試方法 2.3.1 常規(guī)指標(biāo)

　　pH值、COD、MLSS、MLVSS均參照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第4版)》測定，TOC采用島津TOC-VCPH測定. 2.3.2 胞外聚合物(EPS)取2.1節(jié)中分離得到的聚結(jié)型污泥與離散型污泥各50 mL，在4 ℃下以5000 r · min-1離心20 min，得到污泥上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用于Soluble EPS的測定.棄去剩余上清液，以蒸餾水補(bǔ)足到原體積，充分混勻后加蓋密封，在80 ℃恒溫水浴鍋中加熱40 min后，在4 ℃下以5000 r · min-1轉(zhuǎn)速離心20 min，得到上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用于Bound EPS的測定. EPS中的多糖與蛋白質(zhì)的測定分別采用硫酸苯酚法和考馬斯亮藍(lán)G-250染色法.

　　2.3.3 比耗氧速率

　　將2.1節(jié)中分離得到的聚結(jié)型污泥與離散型污泥悶曝2 h，取20 mL污泥于血清瓶中，添加20 mL已配制好的焦化廢水原水和80 mL已曝氣至飽和溶氧狀態(tài)的蒸餾水，置于恒溫磁力攪拌裝置中，用磁力攪拌器將污泥混勻，溫度控制在(25.0±1.0)℃.密封瓶口，在線記錄DO變化曲線.內(nèi)源呼吸對照組則不添加焦化廢水原水，直接添加100 mL已曝氣至飽和溶氧狀態(tài)的蒸餾水.測試結(jié)束后，測定污泥MLVSS并按式(3)計算比耗氧速率(SOUR).

　　式中，[DO]0、[DO]t分別為測定初始時和終止時的溶解氧濃度(mg · L-1)，t為測定時間(h)，[MLVSS]為揮發(fā)性懸浮固體濃度(mg · L-1).

　　2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析 2.4.1 基因組DNA的提取

　　將2.1節(jié)中分離得到的兩種污泥抽濾脫水獲得干污泥，各取100.0 mg干污泥，使用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)，通過Buffer SCL裂解樣品，釋放基因組DNA，然后通過Buffer SP和氯仿去除蛋白質(zhì)的干擾. 抽提獲得的DNA樣品貯存于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增. DNA樣品用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測. 2.4.2 PCR擴(kuò)增 總細(xì)菌的PCR擴(kuò)增采用對大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)都具有特異性的引物對F341-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGG CGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和R534(5′-ATTACCGCGGCTGCTG G-3′)，氨氧化菌的PCR擴(kuò)增采用對氨氧化菌具有特異性的引物對CTO189f(5′-CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG GAGAAAAGCAGGGGATCG-3′)和CTO654r(5′-CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC-3′.反應(yīng)采用50 μL體系：2 μL DNA模板，2 μL上游引物，2 μL下游引物，25 μL Taq PCR Master Mix，19 μL無核酸雙蒸水. PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測.

　　2.4.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

　　采用Bio-rad公司Dcode突變檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離，凝膠濃度為8%，變性劑濃度為30%~60%，溫度60 ℃，在60 V的電壓下電泳12 h. 結(jié)束后，將凝膠進(jìn)行銀染，待條帶出現(xiàn)后拍照，在凝膠成像系統(tǒng)上成像檢測，獲得DGGE圖譜. 隨后用75%酒精消毒后的手術(shù)刀切下DGGE凝膠條帶，回收保存于200 μL薄壁管，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行克隆測序. 2.4.4 DGGE圖譜條帶分析 利用Quantity One軟件對DGGE圖譜中條帶的位置及強(qiáng)度進(jìn)行模擬分析，得到各條帶的波峰面積，利用Shannon指數(shù)(H)來評價污泥樣品的微生物豐富程度，計算公式為：

　　式中，ni為峰面積，N為所有峰的總面積.

　　利用戴斯系數(shù)(Cs)評價污泥樣品之間微生物種群的相似性，計算公式為：

　　式中，j為泳道A和B的共有條帶的數(shù)量，a和b分別是泳道A和B中的條帶數(shù).

　　將測序結(jié)果進(jìn)行處理后提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，采用BLAST進(jìn)行目標(biāo)序列和基因庫中所含序列的相似性分析，得到同源性最近的序列.

　　3 結(jié)果與討論(Results and discussion) 3.1 污泥形態(tài)與特性比較

　　通過旋流分離裝置分離得到聚結(jié)型污泥與離散型污泥后立即進(jìn)行掃描觀察，結(jié)果如圖 1所示.由圖 1可知，兩種污泥均呈絮體狀，外型不規(guī)則.相比而言，聚結(jié)型污泥結(jié)構(gòu)更為密實，絮體之間連接緊密，而離散型污泥絮團(tuán)較小，結(jié)構(gòu)更為松散.兩種污泥常規(guī)指標(biāo)如表 1所示，離散型污泥與聚結(jié)型污泥SVI值分別為78.9與56.0 mL · g-1. SVI即污泥體積指數(shù)，是衡量活性污泥沉降性能的指標(biāo)，聚結(jié)型污泥SVI值低于離散型污泥表明其污泥沉降性能更好，污泥比重更大.

　　采用2.3.2節(jié)中所述方法測定兩種污泥的胞外聚合物，結(jié)果如圖 2所示.胞外聚合物是微生物細(xì)胞分泌的粘性物質(zhì)，主要成分為多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì).其中，Bound EPS主要是緊密結(jié)合在細(xì)胞外殼的束縛性聚合物及附著有機(jī)物，Soluble EPS主要是可溶解的大分子物質(zhì)、膠體和粘液. 數(shù)據(jù)顯示，離散型污泥單位質(zhì)量MLVSS中的Bound EPS和Soluble EPS更高，這一結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果相符.EPS的含量與污泥的沉降性能呈負(fù)相關(guān).離散型污泥EPS含量更高，導(dǎo)致污泥表面電負(fù)性較大，絮體表面的凈負(fù)電荷可以在絮體之間產(chǎn)生排斥勢能，導(dǎo)致污泥結(jié)構(gòu)變得松散.

　　3.2 污泥有機(jī)物降解速率及耗氧速率比較

　　設(shè)置4組不同污泥濃度的對照組(表 2)，添加配制好的實驗廢水，進(jìn)行有機(jī)物降解實驗，計算得到COD、TOC平均降解速率如表 3和表 4所示.　

　　COD與TOC存在一定的相關(guān)性，實驗結(jié)果中二者在數(shù)值和變化規(guī)律上基本吻合.結(jié)果表明，在最初的8 h中，降解速率較低，大部分有機(jī)物在8~20 h中得到降解.對照組1由于污泥濃度小，有機(jī)物負(fù)荷更高，因此，每克污泥有機(jī)質(zhì)所降解的有機(jī)物更多，其降解速率最大值出現(xiàn)在16~20 h. 對照組2、3、4降解速率最大值出現(xiàn)在8~16 h. 在這個時間段中對照組1中離散型污泥降解速率更高，而在對照組2、3和4中聚結(jié)型污泥降解速率更高.由于微生物活性差異較小，因此，在對照組1和2中兩種污泥的有機(jī)物平均降解速率沒有明顯規(guī)律，而在高污泥濃度的對照組3和4中，有機(jī)物平均降解速率呈現(xiàn)的規(guī)律較為明顯，離散型污泥的有機(jī)物平均降解速率要低于聚結(jié)型污泥.

　　微生物內(nèi)源呼吸是指在沒有其他基質(zhì)可以利用的情況下微生物通過消耗內(nèi)在儲存的物質(zhì)完成生命活動，而外源呼吸是指在添加實驗廢水后微生物利用外界供給的物質(zhì)進(jìn)行代謝活動，此時內(nèi)源呼吸并不顯著. 實驗所采集的污泥為好氧污泥，微生物在降解有機(jī)物和硝化過程中都要消耗氧氣.微生物的新陳代謝速率可以通過耗氧速率來反映.本文測定了兩種污泥在內(nèi)源呼吸時和外源呼吸時的比耗氧速率，結(jié)果如圖 3所示.聚結(jié)型污泥無論是內(nèi)源呼吸還是外源呼吸時的比耗氧速率都要高于離散型污泥，說明其微生物活性更高.

　　3.3 污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

　　焦化廢水是由原煤的高溫干餾、煤氣凈化和化工產(chǎn)品精制過程中產(chǎn)生的一種成分極為復(fù)雜的廢水，除了氨、氰、硫氰根、氟化物等無機(jī)污染物外，還含有酚、油、胺、萘、吡啶、喹啉、蒽等雜環(huán)及多環(huán)芳香族化合物(PAHs). 在生物處理系統(tǒng)中多種微生物以廢水中有機(jī)物及無機(jī)成分為營養(yǎng)物質(zhì)，在系統(tǒng)中大量繁殖，形成了較為穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng).DGGE圖譜中處于不同位置的條帶代表一個可能的細(xì)菌類群或可操作分類單位(Operational Taxonomic Unit，OTU)，條帶越多說明生物多樣性越豐富，條帶染色后的熒光強(qiáng)度則反應(yīng)該細(xì)菌的豐富度，條帶信號越亮，表示該種屬的數(shù)量越多，從而反映污泥中微生物的種類和數(shù)量.通過條帶的信號強(qiáng)度可以看出處于優(yōu)勢地位的微生物種群.

　　總細(xì)菌DGGE圖譜如圖 4a所示，對比兩種污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)可以看出，離散型污泥與聚結(jié)型污泥內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異，二者的相似度以戴斯系數(shù)表示，為72.7%.在聚結(jié)型污泥DGGE泳道上觀察到40條不同的條帶，計算得到其Shannon指數(shù)為2.15. 在離散型污泥DGGE泳道上觀察到27條不同的條帶，其Shannon指數(shù)為1.55，表明聚結(jié)型污泥內(nèi)部微生物種群更為豐富，而離散型污泥上所附著的微生物種類更少，某些微生物種群在離散型污泥中豐度很低，如B and 1、2、3、4、5、21、27. 因此，離散型污泥中的微生物種類較少決定了其在抗干擾能力和基質(zhì)利用途徑方面與聚結(jié)型污泥存在差異. 兩種污泥內(nèi)部優(yōu)勢種群也存在差異，離散型污泥中優(yōu)勢種群為B and 9、11、12、20、24、25，聚結(jié)型污泥優(yōu)勢種群為B and 7、10、11、17、20、23、25.圖譜中的條帶經(jīng)克隆測序后將序列信息提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，所有的條帶均在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到了同源性很高的種群. 如表 5所示，大部分菌種為未鑒定或培養(yǎng)的菌種，分布于不同的綱及屬. B and 19、23、25、26、27、31、32屬于變形菌綱(Proteobacteria). B and 1經(jīng)比對鑒定其序列與硫桿菌屬(Thiobacillus sp.)細(xì)菌接近，同源性為100%，該菌可以將廢水中還原態(tài)硫化物氧化為硫酸鹽. 與B and 3同源性達(dá)99%的Diaphorobacter sp.是一種苯酚降解菌. 數(shù)據(jù)庫中與B and 4同源性最高的是Uncultured Bacteroidetes bacterium clone CG38，該菌種是在負(fù)載不同電極材料的微生物燃料電池當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的. B and 21與Sphingopyxis sp.的同源性達(dá)到100%，該菌種是從石油污染土壤和石油廢水中篩選得到，經(jīng)研究鑒定為高效多環(huán)芳烴降解菌.上述的3株菌種已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和鑒定為對污染物的去除具有主要作用的菌群，因此，與焦化廢水中污染物的去除有直接的聯(lián)系，它們均出現(xiàn)在聚結(jié)型污泥的DGGE圖譜中，但在離散型污泥中豐度很低，這與兩種污泥在有機(jī)物降解速率上的差異有著密切的聯(lián)系.

　     韶鋼焦化廠酚氰廢水處理站一期工程一級好氧池中大部分易降解有機(jī)物和部分可降解的有毒物質(zhì)得到去除，同時，氰化物、硫氰化物被氧化為氨氮，二級好氧池主要是負(fù)責(zé)氨氮的硝化，因此，其內(nèi)部含有豐富的氨氧化菌.氨氧化菌的DGGE圖譜如圖 4b所示，聚結(jié)型污泥內(nèi)部氨氧化菌種群比離散型污泥更為豐富，兩者的Shannon指數(shù)分別為0.90和0.60. 將氨氧化細(xì)菌的主要條帶進(jìn)行克隆測序，經(jīng)條帶克隆測序鑒定得出二級好氧池污泥中氨氧化細(xì)菌主要為β-變形亞綱中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，如B and 1、3、4、6、8. B and 5為亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira). B and 2與Uncultured bacterium clone LR A2-14同源性達(dá)到97%，該克隆序列是在A2O焦化廢水處理工程好氧池的污泥中發(fā)現(xiàn)的.基因數(shù)據(jù)庫中與B and 3最為相似的序列是Uncultured Nitrosomonas sp. clone R1-1，該克隆序列是在脫氮生物反應(yīng)器的污泥中提取的，該反應(yīng)器以喹啉為目標(biāo)降解物. B and 3、4、6、7為二者所共有，B and 1、2、5、8所代表的微生物菌屬在離散型污泥中豐度很低.活性污泥中氨氧化菌種類越少，對復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)能力就越弱，其硝化作用的抗干擾能力也越弱.

　　4 結(jié)論

　　1)生物流化床處理系統(tǒng)污泥中存在著離散型污泥與聚結(jié)型污泥的異質(zhì)性，前者結(jié)構(gòu)松散、沉降性能較差，后者結(jié)構(gòu)密實，沉降性能較好.造成兩種污泥在性狀和沉降性能上的差異初步認(rèn)為是由其中EPS含量的高低所造成.聚結(jié)型污泥較離散型污泥有更強(qiáng)的基質(zhì)降解能力，更高的內(nèi)、外源呼吸比耗氧速率.由此推測出沉降性能好即比重大的聚結(jié)型污泥表現(xiàn)出比離散型污泥更高的活性.這種異質(zhì)性的存在對于提高生物反應(yīng)器的處理效率具有實質(zhì)性意義.具體參見污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　2)生物流化床處理系統(tǒng)中污泥異質(zhì)性的存在還表現(xiàn)在內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)在種群豐度上的差異.無論是總細(xì)菌還是氨氧化菌，聚結(jié)型污泥的群落結(jié)構(gòu)比離散型污泥更為豐富.聚結(jié)型污泥總細(xì)菌DGGE圖譜中存在3株已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和鑒定為對污染物的去除具有主要作用的菌群，而它們在離散型污泥中豐度很低;聚結(jié)型污泥中氨氧化細(xì)菌的優(yōu)勢種群為β-變形亞綱中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira)，而離散型污泥中亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira)豐度很低，未出現(xiàn)在DGGE圖譜中.