申請日2015.10.19
公開(公告)日2016.02.10
IPC分類號C08B37/00; A61P1/16; A61P35/00
摘要
本發(fā)明涉及由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖及其提取純化工藝和應用，由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖Abnp1001，其特它的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖Abnp1002，它的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，活性多糖的提取純化工藝，它包括以下工藝步驟：材料預處理、離子交換柱層析、Sephadex?G-200凝膠柱層析，本發(fā)明取純化的活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002具有良好的生物活性，本發(fā)明的加工工藝簡單。
權利要求書
1.一種由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖Abnp1001，其特征在于：它的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖的摩爾比為39.4:10.3:3.9:17.2:27.4。
2.一種由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖Abnp1002，其特征在于：它的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩爾比為0.13:0.56:1.57:87.1。
3.一種活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：它包括以下工藝步驟：
(1)材料預處理：收集蘑菇罐頭加工過程中產生的工業(yè)廢水，然后對該工業(yè)廢水進行旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮至溶液折光率達到35～55%，得到蘑菇預煮濃縮液;量取單位體積的蘑菇預煮濃縮液，在蘑菇預煮濃縮液中加入等體積的去離子水進行混合，混合后在65-75℃水浴條件下將蘑菇預煮濃縮液中析出的晶體完全溶解，溶解之后離心機離心，離心機的轉速控制在11500-12500rpm之間，離心溫度為15-25℃，離心時間為10-20min，離心之后取上清液，上清液用 90-150KDa的超濾膜超濾，將超濾得到的截留液，按體積比為1:3.5-1:2.5的比例加入乙醇，在室溫下醇沉過夜，醇沉得到的沉淀用50～100ml去離子水溶解，并于65-75℃減壓蒸餾除去乙醇，再次離心機離心，離心機的轉速控制在 11500-12500rpm之間，離心溫度為15-25℃，離心時間為10-20min，收集上清液，即得到不小于100KDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法測Abcp的多糖含量， 3.5-5℃保存?zhèn)溆?
(2)離子交換柱層析：
a.DEAE-52預處理：將DEAE-52進行酸、堿預處理;
b.經柱層析得Abnp100;
(3)Abnp100的SephadexG-200凝膠柱層析：
a.SephadexG-200預處理;
b.經柱層析得活性多糖。
4.根據權利要求3所述的活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：步驟(2) 中DEAE-52預處理的具體過程為：在DEAE-52中加入蒸餾水，浸泡過夜后抽濾，先用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl堿洗，用蒸餾水洗至中性;用 0.45-0.55mol/L的HCl酸洗，用蒸餾水洗至中性;用0.45-0.55mol/L的 NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸餾水洗至中性即可。
5.根據權利要求3所述的活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：步驟(2) 的b工藝具體為：將預處理后的DEAE-52進行沸水浴脫氣，脫氣時間為10-20min, 脫氣之后冷卻裝柱，用0.015-0.025mol/L、pH為7.1-7.3的Tris-HCl緩沖液洗至分層明顯，之后注入DEAE-Sephadex-A50，將層析柱連接到組合紫外檢測儀和HW-2000色譜工作站，定時為5～20min/管，用0.015-0.025mol/L， pH為7.1-7.3Tris-HCl緩沖液洗平衡后上Abcp，待Abcp進入DEAE-52的界面時，開始平衡洗脫，先用0.015-0.025mol/L，pH為7.1-7.3的Tris-HCl 緩沖液洗脫平衡，收集主峰A的洗脫液，用4.5-5.5KDa超濾膜超濾主峰A的洗脫液，將超濾得到的截留液進行離心機離心，離心機的轉速控制在 11500-12500rpm之間，離心溫度為15-25℃，離心時間為10-20min，收集上清液，此即為中性粗多糖Abnp100。
6.根據權利要求3所述的活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：步驟(3) 中所述的SephadexG-200預處理的具體工藝為：將SephadexG-200干膠浸泡在蒸餾水中，不斷攪拌，放置于室溫下膨脹45-50h，并除去表面的碎片和沉降緩慢的細小顆粒，之后利用真空干燥器除盡凝膠液中的空氣。
7.根據權利要求3所述的活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：步驟(3) 的b工藝具體為：將預處理后的SephadexG-200填入層析柱中，將層析柱連接到組合紫外檢測儀和HW-2000色譜工作站，用去離子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面時上樣品Abnp100，待樣品完全進入填料界面時用 0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脫，控制流速為0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法測各管多糖濃度，根據所測得數據，繪制成多糖含量分布圖，根據多糖含量分布圖與洗脫譜圖，收集主峰C的洗脫液，合并主峰C的洗脫液，對主峰C的洗脫液用4.5-5.5KDa 超濾膜進行超濾到9-11mL，進行冷凍真空干燥后，得多糖純品Abnp1001。
8.根據權利要求3所述的活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：步驟(3) 的b工藝具體為：將預處理后的SephadexG-200填入層析柱中，將層析柱連接到組合紫外檢測儀和HW-2000色譜工作站，用去離子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面時上樣品Abnp100，待樣品完全進入填料界面時用 0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脫，控制流速為0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法測各管多糖濃度，根據所測得數據，繪制成多糖含量分布圖，根據多糖含量分布圖與洗脫譜圖，收集主峰D的洗脫液，合并主峰D的洗脫液，對主峰D的洗脫液用4.5-5.5KDa 超濾膜進行超濾到9-11mL，進行冷凍真空干燥后，得多糖純品Abnp1002。
9.根據權利要求3或5所述的活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：步驟(2)的b步驟中：所選用的層析柱為2.6cm×50cm層析柱，DEAE-52填料填的高度為柱高的2/5-3/5，填入DEAE-Sephadex-A50的高度為8-11cm，Abcp的上樣量為5-10毫升。
10.根據權利要求3或7或8所述的活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：步驟(3)的b步驟中：所選用的層析柱為2.6cm×50cm層析柱，Sephadex G-200填入的高度為35-45cm，Abnp100的上樣量分別為為5-10毫升。
11.根據權利要求1所述的活性多糖Abnp1001的應用，其特征在于：在制備治療急性肝損傷藥物以及抗腫瘤藥物中的應用。
12.根據權利要求1所述的活性多糖Abnp1002的應用，其特征在于：在制備治療急性肝損傷藥物以及抗腫瘤藥物中的應用。
說明書
由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖及其提取純化工藝和應用
技術領域
本發(fā)明涉及由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖及其提取純化工藝和應用。
背景技術
雙孢蘑菇性平、味甘，能補脾益氣，潤燥化痰，有滋補作用，消食，清神，平肝陽，主治消化不良，高血壓,雙孢蘑菇肉質肥厚,味道鮮美,而且熱能低,具有很高的醫(yī)療保健作用，被聯(lián)合國糧農組織譽為21世紀的健康食品，雙孢蘑菇子實體中含有豐富的氨基酸、礦質元素、多糖、核甘酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、灰分及其超氧化物歧化酶(SOD)。
雙孢蘑菇具有降低血液中的總膽固醇、超低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、低密度脂蛋白膽固醇;雙孢蘑菇能夠促進CD40、CD80、CD86、主要組織相容性復合體、IL-12的表達、T細胞增殖、增高胸腺指數、脾臟指數等免疫活性;抑制乳癌細胞MCF-7aro等癌細胞的生長具有抗腫瘤活性;能顯著地抑制大腸桿菌390、大腸桿菌739、產氣腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等細菌的生長;具有除去大蒜所產生口腔惡臭的治療口臭功效;可顯著抑制正常小鼠的胃排空、對新斯的明負荷小鼠引起的胃排空亢進有顯著的拮抗作用，具有改善胃腸道功能等活性，雙孢蘑菇有這么多的功效，源于其含有豐富的營養(yǎng)成分和活性物質，具有相當大的開發(fā)潛力
雙孢蘑菇作為世界上人工栽培最廣泛、產量最高、消費量最大的食用菌，其貿易以罐頭為主，在雙孢蘑菇罐頭加工過程中清洗、預煮、灌裝、注液等工藝產生大量工業(yè)廢水，這些廢水中往往含有大量的雙孢蘑菇子實體中可溶性物質，然而諸多罐頭工廠著眼于眼前利益，對雙孢蘑菇罐藏預煮液沒有做任何處理，直接排入環(huán)境，這不僅給環(huán)境、生態(tài)、經濟協(xié)調發(fā)展造成很大的壓力，而且浪費了這些廢水中隱藏的有益成分，因此，有必要設計出一種能夠將雙孢蘑菇罐頭加工過程中產生的廢水中有益物質提取出來，將這些有益物質利用起來，防止資源的浪費，造福人類。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供具有良好生物活性的由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖及其提取純化工藝和應用。
本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)：一種由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖Abnp1001，其特征在于：它的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖的摩爾比為39.4:10.3:3.9:17.2:27.4。
一種由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖Abnp1002，其特征在于：它的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩爾比為0.13:0.56:1.57:87.1。
一種活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：它包括以下工藝步驟：
(1)材料預處理：收集蘑菇罐頭加工過程中產生的工業(yè)廢水，然后對該工業(yè)廢水進行旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮至溶液折光率達到35～55%，得到蘑菇預煮濃縮液;量取單位體積的蘑菇預煮濃縮液，在蘑菇預煮濃縮液中加入等體積的去離子水進行混合，混合后在65-75℃水浴條件下將蘑菇預煮濃縮液中析出的晶體完全溶解(因為折光率高于35%就會出現(xiàn)晶體析出，所以需要在65-75℃水浴條件下將晶體溶解)，溶解之后離心機離心，離心機的轉速控制在11500-12500rpm之間，離心溫度為15-25℃，離心時間為10-20min，離心之后取上清液，上清液用90-150KDa的超濾膜超濾，將超濾得到的截留液，按體積比為1:3.5-1:2.5的比例加入乙醇，在室溫下醇沉過夜，醇沉得到的沉淀用50～100ml去離子水溶解，并于65-75℃減壓蒸餾除去乙醇，再次離心機離心，離心機的轉速控制在11500-12500rpm之間，離心溫度為15-25℃，離心時間為10-20min，收集上清液，即得到不小于100KDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法測Abcp的多糖含量(測Abcp的多糖含量，是為了解粗多糖Abcp含量的多少，方便進行下一步實驗)，3.5-5℃保存?zhèn)溆?
(2)離子交換柱層析：
a.DEAE-52預處理：將DEAE-52進行酸、堿預處理;
b.經柱層析得Abnp100;
(3)Abnp100的SephadexG-200凝膠柱層析：
a.SephadexG-200預處理;
b.經柱層析得活性多糖。
步驟(2)中DEAE-52預處理的具體過程為：在DEAE-52中加入蒸餾水，浸泡過夜后抽濾，先用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl堿洗，用蒸餾水洗至中性;用0.45-0.55mol/L的HCl酸洗，用蒸餾水洗至中性;用0.45-0.55mol/L的NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸餾水洗至中性即可。
步驟(2)的b工藝具體為：將預處理后的DEAE-52進行沸水浴脫氣，脫氣時間為10-20min,脫氣之后冷卻裝柱，用0.015-0.025mol/L、pH為7.1-7.3的Tris-HCl緩沖液洗至分層明顯，之后注入DEAE-Sephadex-A50，將層析柱連接到組合紫外檢測儀和HW-2000色譜工作站，定時為5～20min/管，用0.015-0.025mol/L，pH為7.1-7.3Tris-HCl緩沖液洗平衡后上Abcp，待Abcp進入DEAE-52的界面時，開始平衡洗脫，先用0.015-0.025mol/L，pH為7.1-7.3的Tris-HCl緩沖液洗脫平衡，收集主峰A的洗脫液，用4.5-5.5KDa超濾膜超濾主峰A的洗脫液，將超濾得到的截留液進行離心機離心，離心機的轉速控制在11500-12500rpm之間，離心溫度為15-25℃，離心時間為10-20min，收集上清液，此即為中性粗多糖Abnp100。
步驟(3)中所述的SephadexG-200預處理的具體工藝為：將SephadexG-200干膠浸泡在蒸餾水中，不斷攪拌，放置于室溫下膨脹45-50h，并除去表面的碎片和沉降緩慢的細小顆粒，之后利用真空干燥器除盡凝膠液中的空氣。
步驟(3)的b工藝具體為：將預處理后的SephadexG-200填入層析柱中，將層析柱連接到組合紫外檢測儀和HW-2000色譜工作站，用去離子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面時上樣品Abnp100，待樣品完全進入填料界面時用0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脫，控制流速為0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法測各管多糖濃度，根據所測得數據，繪制成多糖含量分布圖，根據多糖含量分布圖與洗脫譜圖，收集主峰C的洗脫液，合并主峰C的洗脫液，對主峰C的洗脫液用4.5-5.5KDa超濾膜進行超濾到9-11mL，進行冷凍真空干燥后，得多糖純品Abnp1001。
步驟(3)的b工藝具體為：將預處理后的SephadexG-200填入層析柱中，將層析柱連接到組合紫外檢測儀和HW-2000色譜工作站，用去離子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面時上樣品Abnp100，待樣品完全進入填料界面時用0.015-0.025mol/L的NaCl溶液洗脫，控制流速為0.15-0.250mL/min，分部收集，每5～20min收集1管，每管的量是2～10mL，用苯酚-硫酸法測各管多糖濃度，根據所測得數據，繪制成多糖含量分布圖，根據多糖含量分布圖與洗脫譜圖，收集主峰D的洗脫液，合并主峰D的洗脫液，對主峰D的洗脫液用4.5-5.5KDa超濾膜進行超濾到9-11mL，進行冷凍真空干燥后，得多糖純品Abnp1002。
步驟(2)的b步驟中：所選用的層析柱為2.6cm×50cm層析柱，DEAE-52填料填的高度為柱高的2/5-3/5，填入DEAE-Sephadex-A50的高度為8-11cm，Abcp的上樣量為5-10毫升。
步驟(3)的b步驟中：所選用的層析柱為2.6cm×50cm層析柱，SephadexG-200填入的高度為35-45cm，Abnp100的上樣量分別為為5-10毫升。
以上所述的NaCl溶液為以NaCl作溶質，0.015-0.025mol/L，pH為7.1-7.3的Tris-HCl緩沖液作溶劑配得的溶液。
所述的活性多糖Abnp1001的應用，其特征在于：在制備治療急性肝損傷藥物以及抗腫瘤藥物中的應用。
所述的活性多糖Abnp1002的應用，其特征在于：在制備治療急性肝損傷藥物以及抗腫瘤藥物中的應用。
較之現(xiàn)有技術而言，本發(fā)明的優(yōu)點在于：1)本發(fā)明提取純化的活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002對急性肝損傷具有良好的保護活性可以作為潛在的急性肝損傷治療藥物或者可以用于制備治療急性肝損傷的藥物;2)本發(fā)明提取純化的活性多糖Abnp1001、活性多糖Abnp1002具有良好的抗腫瘤活性，它們可以作為潛在的抗腫瘤藥物或者可以用于制備抗腫瘤藥物;3)本發(fā)明將廢棄的雙孢蘑菇罐頭加工過程中產生的工業(yè)廢水作為原料，提取純化出能夠為人們所用的活性多糖，這不僅將廢水變廢為寶，減少了廢水的排放量，降低了對環(huán)境的污染程度，而且為人們帶來了具有良好生物活性的活性多糖;4)本發(fā)明的提取純化工藝簡單易實施，且得到高純度的活性多糖。
