1 引言(Introduction)

　　目前, 對顆粒污泥的研究多是關(guān)于如何快速培養(yǎng)、在不同進(jìn)水條件(酸化與部分酸化)、不同生產(chǎn)工藝條件及在不同反應(yīng)器中的特性等方面(郭徽等, 2018;邵享文等, 2018), 而關(guān)于含高濃度Ca2+的廢紙造紙廢水對生產(chǎn)性規(guī)模IC厭氧反應(yīng)器中不同高度處顆粒污泥中古菌的影響還鮮見報道.產(chǎn)甲烷菌的最大產(chǎn)甲烷活性是評估顆粒污泥活性最重要的指標(biāo).產(chǎn)甲烷菌是一個特殊的、專門的生理群, 具有特殊的細(xì)胞成分和生理功能, 是嚴(yán)格的專性厭氧菌, 其產(chǎn)甲烷途徑有3種, 它們以乙酸、甲基化合物、H2/CO2為基質(zhì), 通過不同的反應(yīng)途徑形成甲基輔酶M, 在甲基輔酶M還原酶的催化下最終形成甲烷.產(chǎn)甲烷菌對pH、氧濃度的高度敏感和以H2/CO2為基質(zhì)產(chǎn)生甲烷的自養(yǎng)生長, 使產(chǎn)甲烷菌具有繁殖世代周期長的特點(diǎn).因此, 一般情況下產(chǎn)甲烷是有機(jī)物甲烷化過程的限速步驟.有學(xué)者在研究高濃度造紙廢水厭氧處理中顆粒污泥的微生物多樣性時指出, 顆粒污泥中的古菌均為甲烷菌屬, 產(chǎn)甲烷菌包括食氫型產(chǎn)甲烷菌和食酸性型產(chǎn)甲烷菌兩個生理類群(尹礎(chǔ)等, 2008;易敏等, 2017).此外, 邢雅娟等(2019)在研究造紙廢水UMIC反應(yīng)器中微生物的縱向分布特性時也發(fā)現(xiàn), 系統(tǒng)內(nèi)古菌在門分類水平上多樣性較低, 主要是廣古菌門和深古菌門, 在屬水平上主要包括Methanosaeta、norank_p_Bathyarchaeotea、Methanobacterium、Methanosarcina等.李江等指出, 在厭氧反應(yīng)器中產(chǎn)生的CO2在水溶液中易生成HCO3-、CO32-, 再與系統(tǒng)中的Ca2+生成CaCO3沉淀在顆粒污泥的內(nèi)部或表面, 從而使顆粒污泥中大量的產(chǎn)甲烷活性受損(Yang et al., 2010;李江等, 2012).但目前還少有對CaCO3沉淀具體是影響甲烷菌的哪種類型進(jìn)行分析的研究.基于此, 本文針對造紙廢水中高濃度Ca2+與CO32-結(jié)合生成的CaCO3沉淀對顆粒污泥中產(chǎn)甲烷菌的影響進(jìn)行分析, 以期能為延緩顆粒污泥的鈣化提供一定的參考, 找出最適合處理廢紙造紙廢水的微生物種類和配比.

　　2 材料與方法(Materials and methods)

2.1 材料

2.1.1 厭氧顆粒污泥特性及水質(zhì)分析

　　取陜西某處理廢紙造紙廢水的IC厭氧反應(yīng)器(進(jìn)水容積負(fù)荷為10~15 kg·m-3·d-1, HRT為5 h, 上升流速為5 m·h-1, 進(jìn)水量為600 m3·h-1)內(nèi)不同高度處的顆粒污泥(AS2), 其取樣口見圖 1(1#和6#取樣口因凍結(jié)堵塞未能取樣).種泥是河南某淀粉廠的厭氧顆粒污泥(AS1), 樣品于-20 ℃的冰箱中保存待測.AS2顆粒較小, 平均粒徑為0.21 mm, 呈黑灰色.厭氧進(jìn)水及厭氧出水COD分別為2829、1151 mg·L-1, 去除率為59.31%.厭氧進(jìn)水和出水Ca2+濃度分別為6670、3893 mg·L-1, Ca2+在厭氧反應(yīng)器中的截留率為41.63%, AS2的其他特征見表 1.AS1的MLVSS/MLSS為93.46%, 顆粒較大, 平均粒徑為0.35 mm, 呈青黑色空心的球形, 表面光潔.

　　圖 1

 

　　圖 1 IC反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖

表 1 AS2不同高度的污泥特征

　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及主要設(shè)備

　　實(shí)驗(yàn)藥品無水乙醇、戊二醛、乙酸異戊酯、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、溴化鉀、氯化鐵、磷酸鈉、無水氯化鈣均為分析純.主要儀器包括X射線衍射儀(XRD, D8 Advancee, 德國布魯克Bruker)、紅外光譜儀(IR, Vertex70, 德國布魯克公司)、掃描電鏡-能譜儀(SEM-EDX, COXEM, 捷克TESCAN)、烘箱(FCD-3000, Serials)、COD快速測定儀(5B-2F, 連華科技)、紫外-可見-近紅外分光光度計(Cary 5000, 美國安捷倫).

　　2.2 分析方法

　　每個待測樣品設(shè)置3個平行樣, 分別進(jìn)行如下的樣品預(yù)處理及測定.

　　2.2.1 顆粒污泥基本特征及水質(zhì)的測定

　　顆粒污泥的MLSS、MLVSS采用標(biāo)準(zhǔn)方法測定, pH使用pH計測定, COD采用連華COD快速測定儀測定, 乙酸濃度采用乙酸鐵比色測定(薛超友等, 2018), 最后將各樣品3個平行樣的平均值作為測定結(jié)果計入表 1.

　　2.2.2 厭氧顆粒污泥的XRD分析

　　對厭氧顆粒污泥進(jìn)行預(yù)處理, 每個樣品的各平行樣各取50 mL, 然后在105 ℃下烘干至恒重, 再將烘干后的樣品置于馬弗爐中在600 ℃下灼燒4 h, 灼燒完成后, 將各樣品的3個平行樣進(jìn)行混合, 用石英研缽研細(xì)后粉體備用.利用XRD對污泥中的無機(jī)鹽進(jìn)行晶型分析, 波長為0.1540 nm, 管電壓為40.0 kV, 管電流為40 mA, 掃描范圍為10°~80°, 步長為0.02, 掃描速度正常.

　　2.2.3 厭氧顆粒污泥的紅外光譜分析

　　每個樣品的各平行樣各取30 mL, 然后在40 ℃下烘干后將各樣品的3個平行樣進(jìn)行混合, 研磨成粉, 最后稱取0.01 g粉末樣品與1 g KBr混合均勻, 倒入壓片模中, 在10~80 MPa壓力下加壓1~2 min, 得到全透明壓片.以純KBr壓片作為背景值, 在紅外光譜儀中測量樣品的吸光度, 測定范圍為4000~500 cm-1.

　　2.2.4 厭氧顆粒污泥的掃描電鏡-能譜分析

　�、� 取樣與清洗：每個樣品的各平行樣各取50 mL, 靜置10 min, 去除上清液, 加入pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS, 由0.24 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO4、8 g NaCl、0.2 g KCl加蒸餾水至1 L配制而成)至原體積, 并輕微振蕩混合, 沖洗3次, 以洗掉樣品表面的雜質(zhì)、粘液等附著物, 再靜置, 自然沉淀, 去除上清液;②固定：向清洗好的顆粒污泥中加入2.5%的戊二醛溶液并淹沒樣品, 并置于4 ℃冰箱中固定8 h;③沖洗：固定好的顆粒污泥用PBS沖洗3次, 每次10 min;④脫水：采用梯度乙醇脫水, 將沖洗好的樣品依次置于30%、50%、70%、90%、95%、100%(體積比)的乙醇中各浸泡15 min(其中, 95%和100%乙醇分別浸泡2遍);⑤置換：分別用體積比為1:1的乙酸異戊酯和乙醇的混合液及純乙酸異戊酯各置換1次, 每次15 min;⑥干燥：將置換后的樣品小心取出, 放入濾紙疊成的小盒中, 置于干燥器中干燥8 h, 干燥后將各樣品的3個平行樣進(jìn)行混合;⑦粘樣與噴金：將干燥且混合均勻的樣品用鑷子小心取出, 用導(dǎo)電膠把樣品粘附在鋁制托盤上, 之后在樣品表面用離子濺射鍍膜儀鍍一層金屬膜;⑧觀測：利用掃描電鏡掃描, 并用能譜儀分析元素組成.

　　2.2.5 厭氧顆粒污泥的古菌菌群生物多樣性分析

　　將樣品用冰袋冷凍運(yùn)輸至北京某基因科技有限公司完成PCR擴(kuò)增和測序, 具體步驟如下.

　　① 使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA)提取樣品DNA, 在1%瓊脂糖凝膠上檢查基因組DNA的純度和質(zhì)量, 電泳條件：電壓170 V, 時間30 min.然后將基因組DNA于-20 ℃下保存.

　�、� 用引物序列為5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGC GA-3′、5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′, 對區(qū)域16S V3~V4(344F-806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.對每個樣品, 將10位數(shù)的條形碼序列添加到正向和反向引物的5′末端(由Allwegene Company, Beijing提供).使用25 μL反應(yīng)液在Mastercycler Gradient(Eppendorf, Germany)上進(jìn)行PCR, 其中含有12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix、3 μL BSA(2 ng·μL-1)、2 μL引物(5 μmol·L-1)、2 μL模板DNA和5.5 μL ddH2O.PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5 min, 35個熱循環(huán)(94 ℃變性30 s, 63 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s), 最后72 ℃延伸7 min.使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN, Germany)純化PCR產(chǎn)物, 使用實(shí)時PCR定量, 并在公司進(jìn)行測序.

　　③ 在Allwegene公司的Miseq平臺上進(jìn)行深度測序.運(yùn)行后, 使用Illumina Analysis Pipeline Version 2.6進(jìn)行圖像分析、堿基調(diào)用和誤差估計.

　�、� 通過Illumina平臺進(jìn)行Paired-end測序, 下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過去除低質(zhì)量reads(Q20, 90%標(biāo)準(zhǔn)過濾), 并剪除reads2尾部100 bp低質(zhì)量序列、引物序列.

　�、� 通過COPE軟件(Connecting Overlapped Pair-End, V1.2.3.3), 利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對reads組裝成一條序列, 利用內(nèi)部編寫程序去除兩端barcode序列、引物序列.Paired End Reads通過reads之間的overlap(19個堿基)關(guān)系拼接成Tags, 然后去掉barcode序列.為了得到高質(zhì)量的Tags, 將拼接的Tags按照長度過濾, 進(jìn)行去嵌合體等處理.

　　3 結(jié)果分析(Results and analysis)3.1 厭氧顆粒污泥的XRD-EDS分析

　　如圖 2a所示, AS2顆粒污泥結(jié)晶度較好, 與標(biāo)準(zhǔn)卡片譜圖對比表明, 顆粒污泥中的結(jié)晶成分主要為無機(jī)鹽CaCO3, 且以方解石的形式存在, 還有部分CaCO3以次穩(wěn)定狀態(tài)的文石存在, 含有少量的FeCO3成分.AS2中5 m處顆粒污泥中除CaCO3外還含有草酸鈣和少量CaF2.如圖 1b所示, AS1顆粒污泥中的無機(jī)鹽主要是MgCO3、硅酸鈣, 還有少量CaCO3, 峰較為寬化, 非晶相較多.

　　圖 2

 

　　圖 2厭氧顆粒污泥X-射線衍射圖譜 (a.不同高度的AS2, b.AS1)

　　通過EDS分析檢測厭氧顆粒污泥內(nèi)的元素組成及比例, 結(jié)果如表 2所示.由表可知, IC反應(yīng)器中AS2隨著取樣高度的增加, Ca含量呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢, 但5、7、10 m處顆粒污泥的Ca含量(百分比)遠(yuǎn)高于2 m處顆粒污泥, 占1/3以上, 另外含量較高的是C和O元素, Mg、Fe等其他金屬元素含量較低.在AS1中Ca含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AS2中, 僅占1.81%, 含量最大的是C元素, 其次是O元素, 說明種泥中有機(jī)成分占主要地位.在AS2中, 隨著取樣高度的增加, 無機(jī)成分所占的比例也在增加, 這與表 1中MLVSS/MLSS的變化情況相符.結(jié)合XRD圖可進(jìn)一步確定AS2中Ca的主要存在形式是CaCO3, 再與AS1比較可知, 這種CaCO3的形成主要是廢紙造紙廢水中高濃度Ca2+與CO32-結(jié)合而成.

　　表 2 顆粒污泥元素

　　

　　3.2 紅外光譜分析

　　為了比較IC反應(yīng)器中不同高度的顆粒污泥AS2和AS1化學(xué)結(jié)構(gòu)中各官能團(tuán)的分布情況, 對AS2和AS1進(jìn)行了紅外光譜分析(圖 3).AS2中2 m和7 m處顆粒污泥在一些特定區(qū)域(3300~2850、1750~1000、750~500 cm-1)存在相同的吸收帶, 但吸收峰分布有所差異.AS2中2 m處顆粒污泥在3696 cm-1處的吸收峰主要是由酸類物質(zhì)的—OH伸縮振動導(dǎo)致(de Oliveira Silva et al., 2012;Liu et al., 2015), 這可能是因?yàn)檫@一區(qū)域主要發(fā)生了復(fù)雜有機(jī)物的水解酸化;各高度的AS2與AS1在3300~2850 cm-1處的吸收峰主要是由—OH和烷基上的不飽和—CH伸縮振動導(dǎo)致;1690~1500 cm-1處是雙鍵的伸縮振動區(qū);在1475~1000 cm-1處的吸收峰是X—H面內(nèi)彎曲振動及X—H伸縮振動區(qū).其中, 由于厭氧顆粒污泥成分的復(fù)雜性和蛋白質(zhì)的電負(fù)性, 使AS2 4個取樣口的泥樣都表現(xiàn)為CO32-特征, 在713、700~864、844~1090、1450~1410 cm-1之間有一定的吸收峰.AS2中7 m處顆粒污泥在1407.43 cm-1處的吸收峰是礦物質(zhì)中的—OH拉伸振動導(dǎo)致;AS2中2、5、7 m處顆粒污泥在873~707 cm-1處出現(xiàn)的尖銳吸收峰代表芳香族化合物, 這主要是由于廢紙造紙廢水成分較為復(fù)雜, 含有較多的芳香族化合物(陳永靜等, 2008), 被微生物吸附富集導(dǎo)致.AS1與AS2的7 m處顆粒污泥呈現(xiàn)較為相似的紅外吸收帶, AS1中主要為O—H、N—H的伸縮振動和C—H的伸縮振動, 含較少的芳香族化合物, 沒有明顯的CO32-特征吸收峰帶, 這與XRD的分析結(jié)果大體上是相符的.具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 3

 

　　圖 3不同高度的AS2(a)和AS1(b)的紅外光譜

　　3.3 SEM分析

　　為了分析ICR反應(yīng)器中不同高度的AS2顆粒污泥和AS1的形態(tài)結(jié)構(gòu), 采用掃描電鏡(SEM)進(jìn)行分析, 結(jié)果如圖 4所示.AS2中2 m處的顆粒污泥內(nèi)除了分布有絲狀菌外, 還有少量桿菌和球菌, 同時還覆蓋有大塊的不規(guī)則沉淀物(圖 4 a1和a2);5 m處的顆粒污泥內(nèi)有大量粒狀的團(tuán)聚物和呈片狀的沉積物, 伴隨有少量的球菌及桿菌(圖 4 b1和b2);7 m處的顆粒污泥內(nèi)粒狀團(tuán)聚物和片狀沉積物更加密集, 孔隙中有桿狀菌存在(圖 4 c1和c2);10 m處的顆粒污泥因污泥濃度較低, 樣品處理后為稀少的粉末狀, 但仍可見顆粒內(nèi)有少量桿菌和球菌存在, 同時存在少量絮狀物(圖 4 d1和d2);與AS2相比, AS1則有大量規(guī)則排列的管狀孔隙(圖 4e1和e2), 這些孔隙就成了顆粒污泥中微生物產(chǎn)生的生物氣和水中營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸通道, 一旦這些孔隙堵塞, 微生物的傳質(zhì)過程就會嚴(yán)重受阻, 微生物活性也因此降低.

　　圖 4

 

　　圖 4厭氧顆粒污泥的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu) (a、b、c、d與e分別為AS2的2、5、7、10 m處及AS1的顆粒污泥電鏡掃描圖)

　　3.4 古菌菌群高通量測序結(jié)果及分析

　　本研究利用Illumina MiSeq測序平臺對AS1及AS2的2、5、7 m處的顆粒污泥樣品進(jìn)行測序, 結(jié)果如下.

　　3.4.1 Alpha多樣性分析

　　Alpha多樣性是對單個樣品物種多樣性的分析, 基于OTU的結(jié)果, 計算了樣品的Alpha多樣性(圖 5).Chao1多樣性估算值是根據(jù)所測的tags數(shù)和OTU數(shù)量及相對比例來預(yù)測樣品中微生物的種類(OTU數(shù)量), 是基于已知結(jié)果所得的相對值.Shannon指數(shù)是一個綜合OTU豐度和OTU均勻度兩方面因素的多樣性指數(shù)(Navarrete et al., 2015;Sengupta et al., 2015).由圖 5和圖 6的稀疏曲線可知, AS1的Chao1、Shannon指數(shù)、PD_whole_tree(Phylogenetic diversity)等均高于AS2, 說明種泥中物種更加豐富.稀疏曲線趨于平緩, 說明對所取樣本微生物群落的檢測比率接近飽和, 測序數(shù)量和測序深度都已足夠反映樣本的真實(shí)情況, AS2不同高度顆粒污泥中古菌的生物多樣性由多到少排序?yàn)椋? m>2 m>7 m.

　　圖 5

 

　　圖 5 Alpha多樣性分析盒型圖

　　圖 6

 

　　圖 6 AS1和AS2樣品的稀疏曲線 (AS2-1、AS2-2、AS2-3分別代表AS2的2、5、7 m處樣本)

　　3.4.2 Beta多樣性分析

　　在0.97的相似度下, 得到了每個樣品的OTU個數(shù).PCA分析即主成分分析, 是將多維變量降成2個變量進(jìn)行分析.樣本的第一主成分貢獻(xiàn)率達(dá)79.95%, 第二主成分貢獻(xiàn)率達(dá)18.35%, 結(jié)果顯示, AS1與AS2各自聚為一類(圖 7a).Flower OTU分析結(jié)果顯示, 4個樣本中共有95個OTU數(shù), AS1中所特有的OTU數(shù)最多, AS2系統(tǒng)中5 m處樣品所特有的OTU數(shù)最多, 2 m處樣品次之, 7 m樣品處最少(圖 7b), 這與3.4.1節(jié)中的分析結(jié)果一致.

　　圖 7

 

　　圖 7 PCA分析(a)及Flower OTU分析(b)

　　聚類分析：基于Weighted Unifrac距離, 對樣本進(jìn)行聚類分析(張飛燕等, 2018;程立君等, 2019), 樣本層級聚類分析結(jié)果表明(圖 8), AS2-3樣本與AS2-2樣本聚到一起, AS2-1與AS2-2、AS2-3分開, 說明AS2中2 m處的泥樣與5、7 m處的泥樣有一定的差異性, 而AS1與AS2的組成差異最大.

　　圖 8

 

　　圖 8樣本層級聚類分析

　　加權(quán)UniFrac的heatmap圖分析：通過對UniFrac結(jié)果的聚類, 具有相似Beta多樣性的樣品聚集在一起, 反映了樣品間的相似性(蘇瑤等, 2019), 具體結(jié)果如圖 9所示.根據(jù)顏色差異可以看出樣本之間的差異性, AS2中7 m處樣本與5 m處樣本相似性較高, 2 m處樣本與5、7 m處樣本具有一定的相似性, 結(jié)果與上述聚類分析的結(jié)果較為一致.

　　圖 9

 

　　圖 9加權(quán)UniFrac的heatmap

　　3.4.3 物種組成分析

　　門水平上菌群組成分析：AS1與AS2在門分類水平上的比較如圖 10所示.在AS1和AS2中占比最大的門類是廣古菌門, 所占比例都在90%以上;另一種主要的門類是深古菌門, 且AS1中深古菌門所占比例少于AS2中, 在AS2中隨著取樣高度的增加, 深古菌門所占的比例相對增加.深古菌具有多種生理生化功能, 參與甲烷代謝循環(huán), 產(chǎn)乙酸, 異化還原亞硝酸鹽和硫酸鹽, 能降解蛋白質(zhì)、多聚碳水化合物等有機(jī)質(zhì)(陳玉連等, 2017).廣古菌門包含了古菌中的大多數(shù)種類、產(chǎn)甲烷菌的全部(施嘉駿等, 2018)、極高鹽度下生活的鹽桿菌和一些超嗜熱的好氧和厭氧菌.

　　圖 10

 

　　圖 10門水平上的菌群組成

　　屬水平上的菌群組成：古菌在整個微生物體系中所占的比例較小, 但對整個厭氧系統(tǒng)有著至關(guān)重要的作用.此處將從屬分類水平上分析各樣本的古菌菌群組成(圖 11).在AS1中Methanosaeta(產(chǎn)甲烷絲菌)占42.53%, Methanolinea(產(chǎn)甲烷繩菌)占22.38%, 氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanoregula占13.78%, Methanobacterium(產(chǎn)甲烷桿菌)占6.99%, Methanospirillum(產(chǎn)甲烷螺菌)占2.15%, 未鑒別的和其他菌類共占12.18%.可知AS1中的優(yōu)勢菌分別為產(chǎn)甲烷絲菌、產(chǎn)甲烷繩菌、Methanoregula、產(chǎn)甲烷桿菌和產(chǎn)甲烷螺菌, 其相對豐度都大于1%.在AS2中2 m處的優(yōu)勢菌分別為產(chǎn)甲烷絲菌(83.22%)、產(chǎn)甲烷繩菌(10.81%)、產(chǎn)甲烷螺菌(1.38%), Methanoregula降低到0.37%;相較于AS1, 產(chǎn)甲烷絲菌的占比增加了近1倍, 產(chǎn)甲烷桿菌、產(chǎn)甲烷繩菌和Methanoregula等占比減少, Methanosarcina(產(chǎn)甲烷八疊球菌)只占0.03%.在AS2中5 m處的優(yōu)勢菌分別為產(chǎn)甲烷絲菌(85.56%)、產(chǎn)甲烷繩菌(2.78%), 產(chǎn)甲烷八疊球菌、產(chǎn)甲烷螺菌、Methanoregula分別占0.61%、0.45%、0.28%.在AS2中7 m處的優(yōu)勢菌分別為產(chǎn)甲烷絲菌(89.86%)、產(chǎn)甲烷繩菌(1.43%)、產(chǎn)甲烷八疊球菌(1.21%), 產(chǎn)甲烷桿菌、Methanoregula、產(chǎn)甲烷螺菌分別占0.28%、0.26%、0.15%.由圖可知, 無論是在AS1中還是在AS2中最大的優(yōu)勢菌都是產(chǎn)甲烷絲菌, 但在AS2中產(chǎn)甲烷絲菌平均占86.21%, 相對豐度大幅度增加.

　　圖 11

 

　　圖 11屬水平上的菌群組成

　　在AS2中隨著高度的增加, 產(chǎn)甲烷八疊球菌和產(chǎn)甲烷絲菌的相對豐度呈現(xiàn)遞增的趨勢, Methanoregula、產(chǎn)甲烷螺菌和產(chǎn)甲烷繩菌則呈現(xiàn)遞減的變化趨勢.根據(jù)產(chǎn)甲烷菌可利用的底物類型, 可分為氫營養(yǎng)型、乙酸營養(yǎng)型和甲基營養(yǎng)型3種.厭氧消化過程中代謝乙酸的產(chǎn)甲烷菌有兩類：產(chǎn)甲烷八疊球菌和產(chǎn)甲烷絲菌(楊秀山等, 1998), 產(chǎn)甲烷絲菌為顆粒污泥的形成提供了骨架, 從而加速了污泥的顆�；�進(jìn)程.有學(xué)者認(rèn)為在自然界中乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的種類較少, 只有產(chǎn)甲烷絲菌和產(chǎn)甲烷八疊球菌, 但這兩種產(chǎn)甲烷菌在厭氧反應(yīng)器中居多, 特別是前者, 因?yàn)樵趨捬醴磻?yīng)器中乙酸是主要的產(chǎn)甲烷基質(zhì), 一般來說, 70%左右的甲烷來自乙酸的分解.而產(chǎn)甲烷八疊球菌中的Methanosarcina barkeri除了以乙酸為基質(zhì)外, 還能以甲醇、甲胺、H2/CO2為代謝基質(zhì)(端允等, 2010;Aresta et al., 2016;王祥錕等, 2016;Batsone et al., 2016;Zabranska et al., 2017).Methanoregula、產(chǎn)甲烷螺菌和產(chǎn)甲烷桿菌是氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌, 以H2/CO2和甲酸鹽為基質(zhì), 它們能夠利用H2為電子供體, CO2為電子受體, 通過電子傳遞還原CO2為CH4(Luo et al., 2016).由各樣本的菌群組成可知, AS1中氫營養(yǎng)型甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型甲烷菌分別占45.29%、42.6%, 在IC反應(yīng)器中氫營養(yǎng)型甲烷菌少于17%, 乙酸營養(yǎng)型甲烷菌多于83.28%.可以看出, IC反應(yīng)器內(nèi)的CaCO3沉淀對顆粒污泥中的氫營養(yǎng)型甲烷菌具有較大的抑制作用.

　　IC反應(yīng)器較大的高徑比將具有不同生理生態(tài)特征的微生物分布在反應(yīng)器的不同高度, 使其各自在適宜的環(huán)境條件下發(fā)揮最佳的代謝活性.有機(jī)物在厭氧消化過程主要包括水解發(fā)酵階段、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段、同型產(chǎn)乙酸階段和產(chǎn)甲烷階段.在第一階段, 復(fù)雜有機(jī)物(如碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等)轉(zhuǎn)化成小分子有機(jī)物, 如脂肪酸(丙酸、丁酸等)、簡單基質(zhì)(甲胺、甲醇、甲酸、乙酸和H2/CO2等)及醇類物質(zhì), 兩個碳以上的有機(jī)酸不能被甲烷菌直接利用, 因此, 又在產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的作用下分解成乙酸和CO2, 進(jìn)而為甲烷菌提供代謝基質(zhì).班巧英等(2018)的研究表明, 氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌比乙酸型產(chǎn)甲烷菌更耐酸, 氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌主要分布在ABR反應(yīng)器的1、2格室中, 乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌主要分布在3、4格室.在IC反應(yīng)器的下層首先進(jìn)行的是水解發(fā)酵, 此時丙酸是系統(tǒng)中的主要有機(jī)酸, pH較低, 乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌受到一定程度的抑制, 而氫營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌具有更強(qiáng)的耐酸能力, 能與食丙酸菌協(xié)同作用, 利用丙酸等分解的H2/CO2及甲酸甲胺等物質(zhì), 更適應(yīng)這樣的酸性環(huán)境.隨著高度的上升, 乙酸濃度增加, 丙酸等濃度降低, 系統(tǒng)中pH也在增加(表 1), 生長環(huán)境和代謝基質(zhì)方面都更加有利于乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的繁殖, 最終表現(xiàn)為隨著反應(yīng)器高度的增加其數(shù)量也增加.

　　由以上的分析結(jié)果可知, AS1中氫營養(yǎng)型甲烷菌占45.29%, 在IC反應(yīng)器中氫營養(yǎng)型甲烷菌卻少于17%, 氫營養(yǎng)型甲烷菌的相對豐度銳減, 表明CaCO3沉淀主要是對顆粒污泥中的氫營養(yǎng)型甲烷菌具有較大的抑制作用.氫營養(yǎng)甲烷菌是以H2/CO2為基質(zhì)產(chǎn)甲烷的一類自養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌, 通過提高這類甲烷菌的相對比例, 從而可以減少系統(tǒng)中的CO2含量, 同時又能降低系統(tǒng)的氫分壓, 最終可以促進(jìn)產(chǎn)甲烷階段的順利進(jìn)行, 又可以減弱系統(tǒng)中CO2對CO32-的貢獻(xiàn), 繼而減少Ca2+與CO32-結(jié)合生成CaCO3沉淀在顆粒污泥上, 最終能達(dá)到延緩顆粒污泥鈣化的目的.

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　1)在處理廢紙造紙廢水的生產(chǎn)性IC反應(yīng)器內(nèi), 隨著反應(yīng)器高度的增加, 顆粒污泥中的無機(jī)成分也隨著增加;結(jié)合XRD和EDS結(jié)果分析可知, 顆粒污泥內(nèi)的無機(jī)成分主要是CaCO3, 而在種泥中的鈣含量只有1.81%, 顆粒污泥的有機(jī)質(zhì)含量較高.

　　2)顆粒污泥在高鈣廢水的長期作用下, 隨著反應(yīng)器高度的增加, 氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的相對豐度降低, 以Methanoregula、Methanospirillum和Methanolinea為代表, 乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的相對豐度呈現(xiàn)遞增的趨勢, 以Methanosarcina和Methanosaeta為例, Methanosaeta是各自系統(tǒng)中最主要的優(yōu)勢菌.IC反應(yīng)器中不同高度處古菌的生物多樣性由高到低的順序?yàn)椋? m>2 m>7 m, 5 m處的古菌物種更加豐富.

　　3)AS1和AS2顆粒污泥中古菌在門分類水平上主要包括Euryarchaeota和Bathyarchaeota, 兩者之和占90%以上.在屬分類水平上, 主要包括Methanosaeta、Methanoregula、Methanobacterium、Methanosarcina、Methanolinea、Methanospirillum等.

　　4)AS1中氫營養(yǎng)型甲烷菌占45.29%, 在IC反應(yīng)器中卻少于17%, 可以看出, CaCO3沉淀使顆粒污泥的產(chǎn)甲烷活性降低, 主要表現(xiàn)為其對氫營養(yǎng)型甲烷菌具有較大的抑制作用.(來源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報 作者： 張安龍)