氧化石墨烯( GO) 是石墨烯基納米材料中較為典型的一種，其優(yōu)異的性質(zhì)在新能源、電子信息、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域都有巨大的應(yīng)用潛力［1］。然而 GO 在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用和廢棄過(guò)程中將會(huì)不可避免地進(jìn)入到城市污水處理系統(tǒng)［2］，目前城市污水處理系統(tǒng)主要依賴(lài)于操作簡(jiǎn)便的活性污泥法，因此，探究 GO 對(duì)活性污泥及污水處理效果的影響至關(guān)重要。
GO 的抗菌性已被廣泛證實(shí)［3］，研究表明，其對(duì)細(xì)菌的毒性作用主要表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞膜的破壞以及氧化脅迫作用［4］，所以，GO 對(duì)活性污泥微生物也必然存在一定的影響�，F(xiàn)有關(guān)于 GO 細(xì)菌毒性的研究大多針對(duì)單一菌種，對(duì)活性污泥系統(tǒng)中微生物的毒性研究主要集中于高濃度的短期暴露影響，與現(xiàn)實(shí)情況中的低濃度、長(zhǎng)期暴露環(huán)境區(qū)別較大。因此，探究 GO 長(zhǎng)期暴露對(duì) SBＲ 性能和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響能為污水廠處理石墨烯基納米材料污染物提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而更加有效地處理各類(lèi)突發(fā)情況。

1 材料與方法
1．1 材料和儀器
實(shí)驗(yàn)用水為人工配制的模擬生活污水。模擬廢水組成: CH3 COONa ( 512 mg / L) 、NH3 Cl( 100mg / L) 、KH2 PO4 ﹒ H2 O( 60mg / L) 及濃縮微量元素液; 實(shí)驗(yàn)廢水的水質(zhì)指標(biāo)為 COD 400 mg / L，氨氮( NH4  N) 25 mg / L，總磷( TP) 10 mg / L，pH 為 7．0 ～ 7．5。微量元素包括: MgSO4 ·7H2 O( 5． 07 mg / L) ，MnSO4 ·4H2 O( 0． 31 mg / L) ，F(xiàn)eSO4 ·7H2 O( 2． 49 mg / L) ，CuSO4( 0． 25 mg / L) ，Na2 MoO4 ·2H2 O( 1． 26 mg / L) ，ZnSO4 ·7H2 O( 0． 44
mg / L) ，NaCl( 0． 25 mg / L) ，CaSO4 ·2H2 O ( 0． 43 mg / L) ，CoCl2 ·6H2 O( 0． 41 mg / L) ，EDTA( 1． 88 mg / L) 。實(shí)驗(yàn)所用儀器為: 磁力加熱攪拌器、電磁式空氣泵、蠕動(dòng)泵、電熱鼓風(fēng)干燥箱、電子天平、超聲波清洗器、掃描電鏡、紫外分光光度計(jì)、pH 計(jì)、電子萬(wàn)用爐。接種污泥取自長(zhǎng)春市北郊污水處理廠好氧池活性污泥。
1．2 實(shí)驗(yàn)裝置
實(shí)驗(yàn)裝置為 4 個(gè)SBＲ 反應(yīng)器，外徑 11cm，內(nèi)徑 10cm，有效容積 2L，排水體積 1L。反應(yīng)器設(shè)有進(jìn)水口、出水口、排泥口、曝氣頭和攪拌器。調(diào)節(jié)溫度為 22℃ ±3℃ 、pH 值為 7．6 ～ 8．0、溶解氧為 3 ～ 3．5mg / L。SBＲ 反應(yīng)器運(yùn)行周期為 8h，進(jìn)水 10min，厭氧攪拌 120 min，曝氣 210min，靜置沉降 130min，出水 10min。實(shí)驗(yàn)裝置示意圖如圖 1 所示。
 
1．3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程及采樣
反應(yīng)器運(yùn)行 45d，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)活性污泥進(jìn)行馴化，在脫氮除磷性能穩(wěn)定后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。在 4 個(gè)反應(yīng)器中加入 GO，使反應(yīng)器中 GO 濃度為 0mg / L、1mg / L、5mg / L、10mg / L。根據(jù)出水和排泥所損失的 GO 量，每天添加一定量的 GO。反應(yīng)器每天運(yùn)行 3 個(gè)周期，每 2d 選取固定時(shí)間對(duì)各反應(yīng)器出水取樣。
1．4 水質(zhì)指標(biāo)分析方法
各反應(yīng)器出水用 0．45 um 的水系濾膜濾后的 NH4  N、TN、TP 均采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。COD、PH、DO均采用哈納檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。
1．5 高通量測(cè)序方法
本文中污泥樣品的測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù) E．Z．N．A．�J soil 試劑盒 ( O- mega Bio－tek，Norcross，GA，U．S．) 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA 抽提，DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 進(jìn)行檢測(cè)，利用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 提取質(zhì)量; 用 338F( 5’－ACTCCTACGGGAGGCAGCAG－ 3’) 和 806Ｒ( 5’－
GGACTACHVGGGTWTCTAAT－3 ’)  引物對(duì) V3 － V4 可變區(qū)進(jìn)行 PCＲ 擴(kuò)增。利用 Illumina 公司的 Miseq
PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。原始測(cè)序序列使用 Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用 FLASH 軟件進(jìn)行拼接。使用的 UP-AＲSE 軟件( version 7．1) ，根據(jù) 97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行 OTU 聚類(lèi); 使用 UCHIME 軟件剔除嵌合體。

2 結(jié)果與討論
2．1 GO 對(duì) SBＲ 系統(tǒng)性能的長(zhǎng)期影響

各反應(yīng)器出水中 COD 濃度如圖 2 所示。進(jìn)水 COD 約為 400mg / L，在 45d 的運(yùn)行時(shí)間里，控制組的 COD 平均去除率達(dá)到 95．1%。1mg / L GO 對(duì) COD 的去除影響并不明顯; 在 11d 時(shí)，5mg / L GO 組的出水 COD 上升到 42mg / L，去除率下降到 89．5%; 在 21d 時(shí)，出水 COD 達(dá)到最高，濃度為 67mg / L，去除率下降到 83．3%; 21d 后，出水 COD 濃度有所下降，但平均去除率仍在 89% 以下。10mg / L GO組的出水 COD 高于控制組，最高時(shí)達(dá)到 43mg / L，去除率為 89. 3%。分析結(jié)果可知，5mg / L GO 與 10mg / L GO 均對(duì) SBr系統(tǒng)的 COD 去除率產(chǎn)生了抑制，5mg / LGO 對(duì) COD 去除的抑制作用更強(qiáng)。污水生物處理去除 COD 主要是通過(guò)污泥微生物的生產(chǎn)代謝對(duì)污水中的有機(jī)物進(jìn)行利用，除此之外，還有可能被菌膠團(tuán)等物質(zhì)吸附后隨剩余污泥排出。因此，10mg / L GO 對(duì)去除 COD 的抑制效果低于 5mg / L GO 的原因可能是GO 對(duì)反應(yīng)器中的有機(jī)物產(chǎn)生了更好的吸附，一定程度上降低了 COD。但顯而易見(jiàn)的是，GO 對(duì)活性污泥微生物產(chǎn)生了一定的毒性，并且能夠降低有機(jī)物的去除效率。
 
 
4 個(gè)反應(yīng)器中出水氨氮的濃度如圖 3 所示。進(jìn)水氨氮約為 25mg / L，控制組的氨氮濃度去除率達(dá)到95. 1%，1mg / L GO 組的出水氨氮濃度與控制組的區(qū)別不大，在 23d 后略高于控制組。5mg / L GO 與 10mg / LGO 對(duì)氨氮的去除有明顯的抑制，在 29d 前，10mg / L GO 的出水氨氮濃度高于 5mg / LGO 組，隨后氨氮濃度有所下降并趨于平穩(wěn)，而 5mg / L GO 在 29d 后的氨氮濃度高于 10mg / L GO。在出水氨氮趨于平穩(wěn)后，5mg / LGO 組的氨氮平均去除率下降到 70．5%，10mg / L GO 組的平均去除率為 70．2%。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，GO 能夠抑制硝化細(xì)菌的活性，削弱其將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮的能力。其原因可能是由于 GO 的存在，使得硝化細(xì)菌生長(zhǎng)速率降低，從而抑制硝化作用。各反應(yīng)器總氮濃度如圖 4 所示。
 
為期 45d 的實(shí)驗(yàn)期間，控制組與 1mg / L GO 組的總氮去除率區(qū)別不大，平均去除率分別為 84．1%和 83．4%。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，5mg / LGO 組與 10mg / LGO 組的出水總氮濃度逐漸上升，并在 17d 左右開(kāi)始趨于穩(wěn)定，且 10mg / LGO 對(duì)總氮去除的抑制程度高于 5mg / LGO。二者在 45d 內(nèi)的總氮平均去除率分別下降至 60．3%和 54．1%。這一結(jié)果說(shuō)明，GO 對(duì)脫氮細(xì)菌的生物活性存在抑制作用。
 
4 個(gè)反應(yīng)器中出水 TP 濃度如圖 5 所示，進(jìn)水 TP 約為 10mg / L，控制組與 1mg / L GO 組的總磷去除率均在 90%以上，說(shuō)明低濃度 GO 對(duì)總磷的去除并無(wú)顯著影響。5mg / L GO 組的出水 TP 濃度最高達(dá)到 7． 11mg /L，去除率下降 28．9%，10mg / L GO 組的出水 TP 濃度最高達(dá)到 5．98mg / L，去除率為 40．2%。由數(shù)據(jù)可知，GO長(zhǎng)期暴露后，5mg / L GO 對(duì)總磷去除的抑制程度要略高于 10mg / L GO。GO 對(duì)除磷效率的抑制可能是由于其對(duì)活性污泥中除磷相關(guān)細(xì)菌活性的抑制，也有可能是由于微生物細(xì)胞因 GO 的毒性而破裂，使內(nèi)容物外泄從而導(dǎo)致總磷升高。

2．2  微生物群落多樣性分析
可以通過(guò)單樣本的多樣性( Alpha 多樣性) 分析來(lái)反映微生物群落的豐富度和多樣性，包括通過(guò)一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)來(lái)估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。OTU( Operational Taxonomic Units) 是為了便于分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元( 品系，屬，種、分組等) 設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志，再通過(guò)聚類(lèi)操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個(gè)小組就是一個(gè) OTU。反映群落豐富度的指數(shù)有 sobs、chao、ace 等; 反映群落多樣性的指數(shù)有 shannon、simpson、npshannon 等; 反映群落覆蓋度的指數(shù)為 coverage。
 
 
本文列舉了具有代表性的 OUT、shannon、simpson、coverage、chao 指數(shù)。shannon 指數(shù)越大，simpson 指數(shù)越小，說(shuō)明樣品生物多樣性越高; Chao 指數(shù)越高，表明群落豐度越高; coverage 數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高。如表 1 所示，GO 短期暴露的 4 個(gè)樣品中，5mg / L GO 的 OTU 數(shù)量最低，而 1mg / L GO 與 10mg / L GO 的OTU 數(shù)與空白組相差不大。短期暴露的 4 組樣品中，5mg / L GO 的多樣性最低，物種豐度也較其他 3 組更低。而 1mg / L GO 的多樣性比空白組更高，可能是由于低濃度 GO 對(duì)微生物有促進(jìn)作用。
長(zhǎng)期暴露的 4 組樣品多樣性與物種豐度普遍低于短期暴露的樣品，其原因可能是實(shí)驗(yàn)室的配水與實(shí)際污水相比過(guò)于單一。但不同濃度的 GO 仍然對(duì)活性污泥的多樣性產(chǎn)生了不同的影響。與短期暴露時(shí)相同，
5mg / L 的 OTU 數(shù)最低( 776) ，比空白組( 992) 降低了約 20%，1mg / L GO( 791) 與 10mg / L GO( 794) 的 OTU 數(shù)也都低于空白組。4 組樣品中，5mg / L GO 的 shannon、chao 指數(shù)最低，simpson 指數(shù)最高，物種多樣性與群落豐度最低。
 
總的來(lái)說(shuō)，5mg / L GO 對(duì)物種多樣性的負(fù)面影響最大，而 1mg / L GO 在短期暴露時(shí)會(huì)增加物種多樣性。
如圖 6 為污泥樣品在門(mén)水平的細(xì)菌豐度分布圖。由圖 6 可知，變形菌門(mén)( Proteobacteria) 、擬桿菌門(mén) ( Bacteriodetes) 、放線(xiàn)菌門(mén)( Actinobacteria) 綠灣菌門(mén)( Chloroflexi) 為 4 種優(yōu)勢(shì)菌群。其中，變形菌門(mén)的含量占總菌數(shù)的 43．2% ～ 67．5%，在所有樣本中處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。說(shuō)明變形菌門(mén)的變形菌門(mén)細(xì)菌能夠很好地去除廢水中有機(jī)物，是污水處理廠常見(jiàn)的菌種，且均為革蘭氏陰性菌。長(zhǎng)期暴露的樣品與短期暴露相比，變形菌門(mén)的比例均有提升，而長(zhǎng)期暴露的 5mg / L GO 污泥樣品中，變形菌門(mén)的比例最高，達(dá)到了 67．5%。擬桿菌門(mén)在長(zhǎng)期暴露時(shí)也受到較大的的影響，擬桿菌門(mén)能促進(jìn)含氮物質(zhì)的利用、轉(zhuǎn)化類(lèi)固醇生物和水解大分子物質(zhì)，對(duì)生物脫氮過(guò)程起到重要作用，是專(zhuān)性厭氧微生物。GO 長(zhǎng)期暴露后，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度有不同程度的上升，其中，10mg / L GO 的擬桿菌豐度上升最高，達(dá)到 34．5%。

GO 長(zhǎng)期暴露的樣品中放線(xiàn)菌門(mén)與綠灣菌門(mén)的相對(duì)豐度普遍低于短期暴露的樣品。長(zhǎng)期暴露的 4 個(gè)樣品中，放線(xiàn)菌門(mén)相對(duì)豐度的下降幅度更為明顯，而綠灣菌門(mén)的相對(duì)豐度隨 GO 濃度的增加而下降。從暴露時(shí)間角度考慮，GO 短期暴露與長(zhǎng)期暴露對(duì)污泥樣品門(mén)水平的菌群豐度分布會(huì)產(chǎn)生不同的影響，長(zhǎng)期暴露會(huì)增加變形菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的豐度，降低擬桿菌門(mén)與放線(xiàn)菌門(mén)的豐度。從暴露濃度角度考慮，暴露
45d 時(shí)，5mg / L GO 對(duì)變形菌門(mén)細(xì)菌促進(jìn)作如圖 7 所示。污泥樣品在屬水平上共檢測(cè)出 47 個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)菌屬有Cytophagaceae、Thiothrix、Xanthomonadaceae、Acinetobacter、Candidatus Competibacter、Anaerolineaceae、Saprospi-raceae、Nitrosomonadaceae、Comamonadaceae、Nitrospira、Zoogloea、Saprospiraceae 等。Cytophagaceae 具有脫氮除磷的功能，是污泥樣品中最優(yōu)勢(shì)的菌屬。暴露 45d 時(shí)，5mg / L GO 的 Cytophagaceae 菌屬豐度下降較為明顯，這可能是由于絲硫菌屬( Thiothrix) 在競(jìng)爭(zhēng)中形成了較大優(yōu)勢(shì)，對(duì) Cytophagaceae 菌產(chǎn)生了抑制。絲硫菌是引發(fā)污泥膨脹的主要菌屬，5mg / L GO 樣品中絲硫菌豐度上升了 23．3%，這也解釋了長(zhǎng)期暴露時(shí)反應(yīng)器的污泥沉降性下降的原因。Xanthomonadaceae 細(xì)菌具有脫氮功能，經(jīng)過(guò) GO 長(zhǎng)期暴露后，其相對(duì)豐度由空白組的7. 5%降到了 4．6%，且 GO 濃度越高下降幅度越大，這也可能是導(dǎo)致反應(yīng)器脫氮能力降低的原因。Nitrospira是典型的亞硝化細(xì)菌，Thauera 菌具有反硝化作用，這兩種菌在長(zhǎng)期暴露后的相對(duì)豐度也都下降到 1%以下。
Tetrasphaera 是除磷菌，該菌也在長(zhǎng)期暴露后豐度明顯減少。Anaerolineaceae 具有反硝化功能，經(jīng) GO 長(zhǎng)期暴露后豐度有一定程度的上升。

3 結(jié)論
( 1) 1mg / LGO 對(duì)各水質(zhì)指標(biāo)沒(méi)有明顯影響，5mg / L GO 與 10mg / L GO 則對(duì) COD、NH4 + － N、TN、TP 都有不同程度的抑制作用，其中，5mg / L GO 對(duì)出水水質(zhì)的影響大于 10mg / L GO; 而 GO 對(duì)磷去除的抑制作用最強(qiáng)，GO 濃度為 5mg / L 時(shí)，去除率最低時(shí)下降到 28．9%。
 
( 2) 結(jié)果表明，高濃度 GO 會(huì)明顯降低微生物群落的豐富度和多樣性，其中，5mg / L GO 的影響大于 10mg / L GO，1mg / L GO 在短期暴露時(shí)能夠提升物種多樣性。GO 長(zhǎng)期暴露后變形菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的種群豐度有明顯提升; 5mg / L GO 樣品中絲硫菌( Thiothrix) 豐度上升到 23．3%，這解釋了污泥膨脹及沉降性變差的原因; Xanthomonadaceae、Nitrospira、Thauera 等與脫氮有關(guān)的功能性菌屬在高濃度 GO 暴露后豐度有明顯下降，這解釋了 SBＲ 反應(yīng)器脫氮能力下降的原因; 除磷菌( Tetrasphaera) 在 GO 長(zhǎng)期暴露后豐度也有所下降，這也對(duì)應(yīng)了 GO 對(duì) SBＲ 反應(yīng)器除磷能力的抑制。

作者：楊豐銘，楊 武