城市污水是人類活動(dòng)的必然產(chǎn)物, 其產(chǎn)生量隨著城市與社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展不斷增加, 城市污水處理廠(wastewater treatment plant, WWTP)作為城市的“腸道”, 是控制水污染, 保證城市與人類可持續(xù)發(fā)展的重要設(shè)施.我國城市污水處理廠普遍采用活性污泥法處理污水, 其中微生物是污染物去除的主體, 因此微生物群落是系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的基礎(chǔ).

　　在群落中, 除原核生物外, 真菌、原生動(dòng)物、藻類等真核微生物作為不可或缺的一部分, 在保障系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行過程中發(fā)揮著重要的作用.一方面, 原生動(dòng)物可以攝食處理水中游離細(xì)菌, 指示活性污泥性質(zhì); 通過優(yōu)勢種群變化、形態(tài)變化、繁殖方式變化來指示反應(yīng)操作環(huán)境; 通過種群密度和種類的變化預(yù)測出水水質(zhì); 通過對(duì)細(xì)菌、有機(jī)顆粒和藻類等的強(qiáng)化和捕食作用強(qiáng)化凈化效果; 通過監(jiān)測纖毛類的多樣性可以預(yù)估污水處理廠的運(yùn)行狀況.另一方面, 隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲等病原性原生動(dòng)物能導(dǎo)致人和動(dòng)物腹瀉, 且具有個(gè)體小、潛伏期長、致病性強(qiáng)且易暴發(fā)流行的特點(diǎn), 對(duì)下游生物造成極大的威脅.

　　活性污泥中真菌的出現(xiàn)一般也與水質(zhì)有關(guān).一方面, 絲狀真菌是形成活性污泥絮凝體的骨架, 使污泥具有良好的沉淀性能, 保持高的凈化效率、低的出水濃度和出水懸浮物濃度.另一方面, 絲狀真菌, 如Trichosporon屬, 若大量異常地增殖則會(huì)引發(fā)污泥膨脹現(xiàn)象, 常造成處理水質(zhì)下降和污泥的大量流失, 影響處理系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行.因此, 深入理解污水處理系統(tǒng)中真核微生物的特性, 對(duì)提高出水水質(zhì)、保障污水處理系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行具有重要作用.

　　傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法和形態(tài)學(xué)研究手段因自身存在的不足和問題, 限制了人們對(duì)真核微生物的認(rèn)識(shí), Meng等利用密度梯度離心結(jié)合定量蛋白銀染色的方法在黃海48個(gè)站位的沉積物樣品中鑒定出198種底棲纖毛蟲; 代仁海利用同樣的方法在春季長江口及東海的39個(gè)站位的沉積物樣品中檢獲278種底棲纖毛蟲, 但其中約37%的種類由于數(shù)量過少等原因?qū)е路诸愋畔⒉蛔? 難以準(zhǔn)確鑒定.近年來高通量測序技術(shù)的研究手段極大地提高了微生物群落研究的深度與水平, 現(xiàn)已被廣泛用來解析農(nóng)田、森林、土壤、海洋等環(huán)境中的微生物.在污水處理系統(tǒng)中, 相關(guān)研究大多集中于利用高通量測序技術(shù)結(jié)合其他生物信息學(xué)方法解析系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能, 采用這一技術(shù)研究系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落的報(bào)道還很少見.此外, 我國不同區(qū)域的地理環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)均存在差異, 且有研究顯示自然系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落和污水處理系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌群落均具有地域性差異, 然而不同區(qū)域活性污泥系統(tǒng)內(nèi)的真核微生物群落地域性差異研究尚未開展.

　　因此, 本研究擬利用高通量測序技術(shù), 結(jié)合多種生態(tài)學(xué)及數(shù)理統(tǒng)計(jì)相關(guān)分析方法研究我國城市污水處理系統(tǒng)中真核微生物的群落特性與地域性差異, 深化對(duì)污水處理系統(tǒng)中真核微生物的認(rèn)識(shí), 以期為指導(dǎo)污水處理系統(tǒng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)、提高出水水質(zhì)、保障系統(tǒng)穩(wěn)定高效運(yùn)行提供科學(xué)依據(jù).

　　1 材料與方法1.1 樣品采集與DNA提取

　　污泥樣品采集于2014年7~8月, 選取了北京, 深圳和無錫的14個(gè)污水處理廠, 為保證后續(xù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果的可靠性, 樣品采集遵循每個(gè)城市至少采集4個(gè)WWTPs, 每個(gè)WWTP至少采集3個(gè)曝氣池活性污泥樣品(分別在曝氣池前、中、后端)以及一個(gè)曝氣池上清液樣(曝氣池中端), 若同一WWTP具有不同的處理工藝, 則在不同處理工藝的曝氣池中均進(jìn)行了活性污泥樣品和曝氣池上清液樣品的采集.同時(shí), 原位測定曝氣池混合液的溫度、pH、溶解氧濃度和電導(dǎo)率等參數(shù), 收集WWTPs的地理信息、城市氣候信息, WWTPs采用的處理工藝、設(shè)計(jì)參數(shù)、進(jìn)出水水質(zhì)情況和操作參數(shù)等基本信息.

　　采用統(tǒng)一的方法, 每個(gè)樣品采集30 mL, 并迅速置于冰上24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室, 充分搖勻后于15 000g離心10 min后棄去上清液, 取沉淀相保存于-80℃用于微生物DNA提取.采用PowerSoil®DNA提取試劑盒提取污泥樣品的DNA, 然后用ND-2000分光光度計(jì)和NanoDrop測定其濃度和純度, 保證每個(gè)樣品滿足測序的DNA質(zhì)量要求.

　　1.2 18S rDNA高通量測序

　　利用引物TAReuk454FWD1(5′-CCAGCASC YGCGGTAATTCC-3′)和TAReukREV3(5′-ACTTTCG TTCTTGATYRA-3′)通過Illumina MiSeq測序平臺(tái)完成活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物18S rDNA測序, 然后在Galaxy平臺(tái)(http://zhoulab5.rccc.ou.edu:8080/root)上完成原始數(shù)據(jù)的整合, 物種信息分類, 生成操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)表格, .

　　1.3 數(shù)據(jù)分析

　　本研究使用了非度量多維尺度法(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)和相異性分析非參數(shù)檢驗(yàn)方法ADONIS(permutational multivariate analysis of variance)、ANOSIM(analysis of similarities)和MRPP(multi-response permutation procedure)檢驗(yàn)北京、深圳和無錫這3個(gè)城市微生物群落結(jié)構(gòu)的差異, 采用多元回歸矩陣分析(multiple regression on distance matrix, MRM)和partial mantel test分析確定影響群落結(jié)構(gòu)的重要因素.以上分析通過R語言vegan、ape、ecodist程序包和Excel完成.

　　2 結(jié)果與討論2.1 OTU及其相對(duì)豐度的分布特征

　　為了保證樣品間數(shù)據(jù)的均等性, 本研究按照每個(gè)樣品8 190條序列的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行隨機(jī)抽平處理, 61個(gè)樣品共得到499 590條序列.然后按照97%相似度的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行序列的OTU劃分, 共獲得3 794個(gè)OTUs.

　　數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明, OTU的相對(duì)豐度分布極其不均勻, 只有少數(shù)的OTU相對(duì)豐度較高, 其中, 相對(duì)豐度大于0.10%的OTU僅有120個(gè)[圖 1(a)], 這也是常被觀測到的一種生態(tài)學(xué)現(xiàn)象.此外, 前84個(gè)OTUs(1.07%)的累積相對(duì)豐度就已達(dá)到總豐度的80%[圖 1(b)].同樣地, OTU在樣品中的分布也十分不均勻[圖 1(c)], 只有4個(gè)OTUs被所有樣品共有, 存在于50或更多個(gè)樣品中的OTU只有37個(gè), 85.40%的OTU僅存在于不超過10個(gè)樣品中.另外, 從圖 1(c)還可以看出：活性污泥系統(tǒng)真核微生物群落中絕大多數(shù)OTU的分布頻率與相對(duì)豐度都很低, 但分布頻率較高的OTU傾向于具有較高的相對(duì)豐度, 即存在少量分布廣泛且相對(duì)豐度較高的OTU, 這與污水處理系統(tǒng)中細(xì)菌群落的分布規(guī)律相似.

　　圖 1

(a)OTU相對(duì)豐度排名-相對(duì)豐度; (b)OTU相對(duì)豐度排名-累積相對(duì)豐度; (c)OTU分布頻率-相對(duì)豐度圖 1 OTU豐度-頻率分布示意

　　2.2 活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落的α多樣性

　　α多樣性能夠反映樣品內(nèi)的微生物群落的豐富度和均勻度.本研究中, 活性污泥系統(tǒng)內(nèi)每個(gè)樣品中真核微生物群落的OTU數(shù)目為212~689, 估算的OTU豐富度(Chao1)為370~1192, 香農(nóng)-威納指數(shù)為1.58~4.80, 辛普森相關(guān)指數(shù)為1.8~38.65, 均勻度指數(shù)為0.29~0.73.城市水平來看, 3個(gè)城市活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落多樣性不同(表 1), 其中無錫群落的物種豐富度(實(shí)際值和估測值)最高, 深圳次之, 北京群落的物種豐富度則明顯低于無錫和深圳, 香農(nóng)-威納指數(shù)在3個(gè)城市間也呈現(xiàn)相同的規(guī)律, 各城市群落物種均勻度差異不大.

表 1 城市樣品水平活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落α多樣性指數(shù)

 　　與傳統(tǒng)的研究方法相比, 本研究利用高通量測序技術(shù)檢獲的真核微生物多樣性更高. Matsunaga等通過構(gòu)建18S rRNA基因克隆文庫的方法研究了活性污泥中的真核微生物多樣性, 在獲取的834個(gè)克隆中, 60%的克隆很難鑒定, 最終僅獲取了80個(gè)OTUs; Matsubayashi等利用同樣的方法研究了厭氧污泥中的真核微生物多樣性, 發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)內(nèi)85%的真核微生物都是未知的, 樣品中估算的OTU數(shù)量(Chao1)僅為34~77個(gè).盡管不同的數(shù)據(jù)處理軟件、參數(shù)的選擇等均可導(dǎo)致OTU數(shù)量的改變, 進(jìn)而影響分子多樣性的評(píng)價(jià), 且前期PCR擴(kuò)增和測序等過程均可能導(dǎo)致微生物群落物種多樣性的高估, 但目前對(duì)其高估程度還難以準(zhǔn)確定量.

　　與活性污泥系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌群落比較發(fā)現(xiàn), 真核微生物多樣性較低. Zhang等使用454焦磷酸測序方法獲得的活性污泥系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌群落OTU數(shù)目為1 183~3 567個(gè), Xia等采用Illumina測序方法分別研究了MBR和OD系統(tǒng)內(nèi)12周的活性污泥樣品內(nèi)的細(xì)菌群落多樣性, 結(jié)果表明MBR系統(tǒng)和OD系統(tǒng)樣品的OTU數(shù)目分別為2 297~3 330和1 802~3 517個(gè), 均高于真核微生物多樣性.具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　2.3 不同空間尺度下的活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落物種組成

　　物種組成是微生物群落研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容, 是探究群落優(yōu)勢菌種或核心物種的基礎(chǔ), 但不同空間尺度下活性污泥系統(tǒng)內(nèi)的微生物群落組成可能有所差異.因此, 本研究主要從區(qū)域、城市和污水處理廠這3個(gè)空間尺度, Supergroup、Division兩個(gè)水平對(duì)OTU所屬的物種信息進(jìn)行分析, 從而全面地揭示活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落的組成特征.

　　在區(qū)域尺度上, 在Supergroup水平下, 3 794個(gè)OTUs分屬于10個(gè)Supergroup[圖 2(a)], 其中, Opisthokonta的相對(duì)豐度最高, 為54.06%, Alveolata次之, 為35.90%.在Division水平下, 3 794個(gè)OTUs分屬于26個(gè)Division, 其中, 相對(duì)豐度大于1.0%的僅有10個(gè)[圖 2(b)], 但它們的累積相對(duì)豐度已大于98%.具體地, 87.08%的OTUs屬于Ciliophora、Fungi和Metazoa, 其中, 相對(duì)豐度最高的是Ciliophora, 為34.35%, 其次是Fungi和Metazoa, 相對(duì)豐度分別為33.02%和19.71%.

　　圖 2

 

(a)整體尺度, Supergroup水平; (b)整體尺度, Division水平; (c)城市尺度, Devision水平; (d)污水處理廠尺度, Devision水平(相對(duì)豐度小于1.0%的統(tǒng)一劃歸為others)圖 2 不同尺度/水平下活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落組成 

　　在城市尺度、Division水平下[圖 2(c)], 3個(gè)城市的活性污泥真核微生物群落均以Ciliophora, Fungi和Metazoa為主要組成成分, 總相對(duì)豐度為86.22%~89.40%, 但是北京和無錫群落均以Ciliophora為最主要的組分, 深圳群落則以Fungi為最主要的組分.

　　在污水處理廠尺度、Division水平下[圖 2(d)], 除BJ6外的13個(gè)污水處理廠內(nèi)的Ciliophora、Fungi和Metazoa的總相對(duì)豐度為83.21%~97.30%, BJ6較特殊, 三者總相對(duì)豐度僅為74.31%, 其他組分相對(duì)豐度較高.分析發(fā)現(xiàn)Perkinsea在各污水處理廠群落內(nèi)分布極其不均勻, 在BJ6群落內(nèi)的相對(duì)豐度高達(dá)19.99%, 但它們?cè)贐J3和SZ4兩個(gè)群落內(nèi)不存在, 在其他廠內(nèi)的相對(duì)豐度也均很低(0.02%~2.53%). Perkinsea主要包括一些雙殼類軟體動(dòng)物的寄生蟲, 常存活于淡水環(huán)境中.

　　2.4 活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落地域分布差異

　　采用基于Bray-Curtis距離的NMDS方法對(duì)來自于不同污水處理廠的樣品進(jìn)行了群落結(jié)構(gòu)分析, 結(jié)果如圖 3所示：整體上, 來自北京、深圳和無錫這3個(gè)城市的活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落各自聚為一類, 表明3個(gè)城市的活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異.相異性分析非參數(shù)檢驗(yàn)方法ADONIS、ANOSIM和MRPP的結(jié)果也為3個(gè)城市真核微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異提供了佐證(P < 0.01).具體看, 來自某一個(gè)城市不同污水處理廠的活性污泥真核微生物群落傾向于聚類在一起, 即來自同一城市的活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落具有較強(qiáng)的相似性, 不同污水處理廠的活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異, 表明活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物存在地域性差異.這與自然系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落和污水處理系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌群落均存在地域性差異的結(jié)論一致.

　　圖 3

 

圖 3 基于NMDS的活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落結(jié)構(gòu)分析

　　2.5 活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落結(jié)構(gòu)的影響因素

　　群落多樣性和結(jié)構(gòu)主要受確定性因素和隨機(jī)因素的影響.確定性因素通�；�于生態(tài)位理論描述, 隨機(jī)因素由中性理論闡述, 現(xiàn)有研究主要關(guān)注確定性因素中的環(huán)境條件對(duì)活性污泥系統(tǒng)內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響.基于高通量方法的研究表明WWTPs的水質(zhì)參數(shù)、操作條件、地理位置和處理工藝等因素均會(huì)對(duì)污水處理系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響, 研究對(duì)象不同, 影響作用較顯著的因素種類不盡相同.

　　為了探明城市污水處理廠活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落結(jié)構(gòu)的影響因子, 本研究利用partial mantel test分析了地理位置、進(jìn)出水水質(zhì)參數(shù)、操作條件等參數(shù)與群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性, 結(jié)果表明, 在參與分析的20個(gè)因子中, 10個(gè)因子與群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)(P<0.05), 其中相關(guān)系數(shù)最大、相關(guān)性最強(qiáng)的因子是出水總氮濃度(r=0.61), 其次是水力停留時(shí)間(r=0.50), 污泥齡(r=0.43)和出水總磷濃度(r=0.38).與出水污染物參數(shù)相比, 進(jìn)水污染物參數(shù)與群落相關(guān)性較弱[進(jìn)水BOD濃度(r=0.33), 進(jìn)水總磷濃度(r=0.26)], 此外, 與群落結(jié)構(gòu)具有顯著相關(guān)性的因素還有地理緯度(r=0.30), 曝氣池溶解氧濃度(r=0.22), 年平均氣溫(r=0.22)和曝氣池混合液濃度(r=0.22).

　　由于partial mantel test只能逐一分析各環(huán)境因子與群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性或?qū)⒍鄠�(gè)環(huán)境因子作為一個(gè)整體考察其與群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性, 為了探究不同環(huán)境因子對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響的相對(duì)重要性, 本研究使用相同的影響因子組合構(gòu)建了MRM模型.結(jié)果表明, 模型顯著且擬合度較高(R2=0.92, P<0.01).對(duì)于單個(gè)因子而言(表 2), 曝氣池混合液溫度是造成群落存在差異最重要的因素.環(huán)境溫度影響生物處理構(gòu)筑物中生物化學(xué)過程的速度和趨向, 影響微生物的新陳代謝、進(jìn)化速率等生理活動(dòng), 適宜的溫度能夠促進(jìn)、強(qiáng)化微生物的生理活動(dòng), 反之, 能夠減弱甚至破壞微生物的生理活動(dòng), 導(dǎo)致微生物形態(tài)和生理特性的改變, 甚至可能導(dǎo)致微生物死亡, 進(jìn)而影響活性污泥的微生物種群的形成和發(fā)展.

　　表 2 MRM分析各環(huán)境因子對(duì)活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落結(jié)構(gòu)影響的權(quán)重1)

　

　　與進(jìn)水污染物濃度(進(jìn)水BOD濃度)相比, 出水污染物濃度(出水總氮濃度、出水總磷濃度)與群落結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的相關(guān)性, 其中出水總氮濃度與群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性強(qiáng)于出水總磷濃度(表 2), Wei等基于ITS數(shù)據(jù)對(duì)污水處理廠中真菌群落結(jié)構(gòu)影響因素研究表明, 出水總氮濃度與群落結(jié)構(gòu)有很強(qiáng)的相關(guān)性.氮是微生物生長、繁殖、代謝不可缺少的重要元素, 另外, 出水總氮濃度也是出水水質(zhì)監(jiān)測的一個(gè)重要指標(biāo), 因此這也側(cè)面反映了真核微生物作為出水水質(zhì)的指示生物, 其數(shù)量和密度與出水水質(zhì)有重要關(guān)聯(lián).齊嶸等采用活體鏡檢計(jì)數(shù)的方法對(duì)無機(jī)廢水硝化過程中原生動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物優(yōu)勢種類的數(shù)量變化與出水NO3--N和NO2--N的濃度存在一定聯(lián)系, 即隨著NO2--N的大量累積, 表殼蟲生長繁殖旺盛, 密度最高可達(dá)575 ind.·mL-1, 成為系統(tǒng)中絕對(duì)優(yōu)勢的原生動(dòng)物; 但當(dāng)NO2--N濃度小于10 mg·L-1時(shí), 幾乎未見表殼蟲的存在, 而系統(tǒng)中的另一種典型的原生動(dòng)物累枝蟲的數(shù)量則隨著NO3--N濃度的持續(xù)增加而逐漸增加.

　　此外, 地理距離也是影響群落結(jié)構(gòu)的重要因子(表 2), 這與上文3個(gè)城市群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異的結(jié)果相一致, 說明微生物種群的確存在地域性差異, 事實(shí)上, 地理距離的差異導(dǎo)致了環(huán)境的異質(zhì)性, 如氣溫、降水量的異質(zhì)性, 進(jìn)而導(dǎo)致了群落地域性差異. Bahram等報(bào)道了影響表層土壤真菌分布的最主要因素是降水量. Telford等的研究發(fā)現(xiàn)自然系統(tǒng)內(nèi)的真核微生物(硅藻)會(huì)因?yàn)閿U(kuò)散限制而呈有限的地理分布, 其他學(xué)者的研究結(jié)果也同樣證明了微生物地域性差異的存在, 且地理距離造成的群落間的差異可能因空間限制而被長期保留.

　　此外, 常規(guī)污水處理廠操作運(yùn)行參數(shù)曝氣池pH、污泥齡和曝氣池混合液濃度對(duì)群落結(jié)構(gòu)也存在重要影響, 它們也是活性污泥系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌群落的重要影響因子.

　　3 結(jié)論

　　(1) 不同空間尺度下, 活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落優(yōu)勢種群組成相似.在Devision水平上, 3個(gè)城市真核微生物群落優(yōu)勢種群主要由真菌、原生動(dòng)物(纖毛亞門)和后生動(dòng)物組成.

　　(2) 不同城市污水處理廠活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物多樣性存在差異, 無錫群落的多樣性(豐富度和香農(nóng)-威納多樣性指數(shù))最高, 北京的最低, 且3個(gè)城市的活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著的地域性差異.

　　(3) 利用Partial mantel test和MRM探討了影響活性污泥系統(tǒng)真核微生物群落結(jié)構(gòu)的因素, 結(jié)果表明, 曝氣池混合液溫度和出水總氮濃度與活性污泥系統(tǒng)內(nèi)真核微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性較強(qiáng).(來源：環(huán)境科學(xué) 作者：秦文韜)