由于抗生素長(zhǎng)期被應(yīng)用于人與動(dòng)物的疾病治療及在養(yǎng)殖業(yè)中促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，導(dǎo)致環(huán)境微生物耐藥性逐漸增強(qiáng)，并嚴(yán)重威脅到人類健康[1, 2]. 城市 污水處理廠是耐藥菌與抗性基因的重要儲(chǔ)存庫(kù)[3, 4, 5, 6, 7]，其中城市污泥傳播抗性的潛在危險(xiǎn)性高于污水. 例如，Munir等[8]的研究表明，城市污水處理廠的活性污泥中的耐藥菌(3.17×104~1.85×109 CFU ·g-1; colony-forming unit，CFU)遠(yuǎn)高于出水中的耐藥菌(5.00~6.10×103 CFU ·mL-1). 葛峰等[9]發(fā)現(xiàn)在南京4個(gè)城市污水處理廠的活性污泥中分離出的35株細(xì)菌中，97.1%的細(xì)菌具有不同程度的耐藥性，80%的菌株具有多重耐藥性. 劉沖等[10]發(fā)現(xiàn)在上海2個(gè)城市污水處理廠的外排污泥中3種四環(huán)素類耐藥菌的濃度均高于進(jìn)水. 此外，研究表明城市污泥的土地利用很有可能造成抗性污染傳播[11, 12]. 由此可知，如果城市污泥處理不當(dāng)，則會(huì)有傳播耐藥菌與抗生素抗性基因的巨大風(fēng)險(xiǎn); 另一方面，城市污泥的合理處理也是控制耐藥菌傳播的重要工藝過(guò)程.

　　然而，目前已有研究大多是針對(duì)城市污水處理過(guò)程中耐藥的好氧菌群[8, 13]，或某特定菌如大腸菌群(Coliforms)[14, 15]、 腸球菌(Enterococci)[16]、 不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)[14, 17]、 大腸桿菌(Escherichia coli)[18, 19]、 金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[20]等的分布特征進(jìn)行研究，缺乏對(duì)城市污泥典型處理工藝，即厭氧消化過(guò)程中耐藥菌、 尤其是厭氧耐藥菌的分布規(guī)律與去除特征的研究，污泥中耐藥菌的去除及其影響因素和控制方法都有待深入探討[21]. 因此，本研究以北京某城市污水處理廠中溫厭氧卵形消化池的進(jìn)泥與出泥為對(duì)象，通過(guò)為期1 a的調(diào)查研究，重點(diǎn)考察應(yīng)用最廣泛的獸用/人類醫(yī)用抗生素四環(huán)素類及β-內(nèi)酰胺類的厭氧耐藥菌在城市污泥中溫厭氧消化過(guò)程中的分布特征與去除效果，以期為今后城市污泥處理過(guò)程中耐藥菌傳播污染控制提供科學(xué)依據(jù). 1 材料與方法 1.1 樣品采集與處理

　　自2012年9月~2013年8月，定期采集北京某城市污水處理廠卵形消化池的進(jìn)泥和出泥. 該污水處理廠服務(wù)人口300余萬(wàn)，初沉污泥采用中溫卵形消化池(35~38℃)處理，日處理規(guī)模為2200~2600 m3濃縮污泥(含水率96.5%~97.5%)，污泥停留時(shí)間為24~28 d. 將現(xiàn)場(chǎng)所取得的污泥樣品置于已滅菌的聚乙烯瓶(1 L)，立刻放于冰上冷藏、 運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室于4℃冷藏保存. 所取污泥樣品先經(jīng)1 mm篩網(wǎng)去除大顆粒雜質(zhì)后用于污泥TS等各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè). 污泥樣品在取樣后48 h內(nèi)進(jìn)行總厭氧菌與耐藥菌的培養(yǎng)試驗(yàn). 1.2 厭氧培養(yǎng)基的配制

　　根據(jù)文獻(xiàn)[22, 23, 24]推薦的厭氧耐藥菌培養(yǎng)方法對(duì)卵形消化池進(jìn)/出污泥中厭氧耐藥菌進(jìn)行培養(yǎng)，重點(diǎn)考察6種抗生素耐藥菌在厭氧污泥中的分布情況，分別是3種四環(huán)素類抗生素：土霉素(oxytetracycline,OTC)、 金霉素(chlorotetracycline,CTC)、 四環(huán)素(tetracycline,TC)和3種β-內(nèi)酰胺類抗生素：氨芐西林(青霉素類，ampicillin,AMP)、 頭孢噻吩(Ⅰ代頭孢菌素，cephalothin,CEP)、 頭孢噻肟(Ⅲ代頭孢菌素，cefotaxime,CFT).

　　分別取抗生素純品163.27 mg土霉素(純度≥98%，LKT Labs,US)，173.13 mg四環(huán)素(鹽酸鹽)(≥95%，Sigma,US)，229.58 mg金霉素(鹽酸鹽)(≥75%，Sigma,US)，168.88 mg頭孢噻吩(鈉鹽，96.0%~101.0%，Sigma,US)，分別加入到50 mL的滅菌去離子水(Milli-Q,US)中，制備成含抗生素3.2g ·L-1的母液. 將氨芐西林(鈉鹽，100 mg ·mL-1，Goldbio,US)，頭孢噻肟(鈉鹽，100 mg ·mL-1，Goldbio,US)用滅菌去離子水稀釋10倍，制備成10g ·L-1母液，于-20℃避光保存?zhèn)溆? 耐藥菌培養(yǎng)采用Wilkins-chalgren 厭氧瓊脂(Oxoid，U.K.)[25, 26]作為厭氧菌培養(yǎng)基. 配制培養(yǎng)基時(shí)取相應(yīng)劑量的抗生素母液加入到培養(yǎng)基中，配制成含抗生素32μg·mL-1的厭氧耐藥菌選擇性培養(yǎng)基. 1.3 厭氧菌的培養(yǎng)

　　取10 mL厭氧污泥加到含有90 mL滅菌PBS緩沖液的三角燒瓶?jī)?nèi)，加入適量滅菌玻璃珠，在恒溫?fù)u床內(nèi)180 r ·min-1振蕩1 h，制成均勻的稀釋液，即為稀釋10-1的菌液. 取1 mL水樣，采用10倍梯度稀釋法，依此制成10-2~10-8稀釋菌液. 選擇3個(gè)適宜的稀釋梯度，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行試驗(yàn). 吸取0.1 mL稀釋菌液，接種已倒入滅菌厭氧培養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)皿中，以涂布棒涂布均勻，立刻倒置于Anaero Pack密封厭氧培養(yǎng)罐(MGC,JP)中，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋(用于消耗剩余氧氣)以及氧氣指示劑后密封，于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù). 1.4 數(shù)據(jù)處理

　　采用SPSS�q 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析. 采用的統(tǒng)計(jì)方法包括單因素方差分析、 配對(duì)T檢驗(yàn)、 獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)等方法. 對(duì)細(xì)菌濃度取log值后再進(jìn)行相應(yīng)的顯著性分析(P<0.05).

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 厭氧耐藥菌在厭氧消化過(guò)程中的分布特征

　　厭氧污泥中6種抗生素厭氧耐藥菌分布情況的全年考察結(jié)果見(jiàn)圖 1所示. 卵形消化池進(jìn)泥與出泥中的總異養(yǎng)菌與耐藥菌在一年內(nèi)大多在2個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)波動(dòng). 厭氧進(jìn)泥中總厭氧菌濃度為5.94×108~6.75×1010 CFU ·g-1，四環(huán)素類耐藥菌在3.57×106~1.77×109 CFU ·g-1之間，β-內(nèi)酰胺類耐藥菌為1.33×107~2.98×1010 CFU ·g-1之間.

　　圖(a)和(c)為厭氧進(jìn)泥中耐藥菌與總厭氧菌濃度; 圖(b)和(d)為厭氧出泥中藥菌與總厭氧菌濃度; HPC. 總厭氧菌; OTC.土霉素; TC.四環(huán)素; CTC.金霉素; AMP.氨芐西林; CEP.頭孢噻吩; CFT.頭孢噻肟

 圖 1 厭氧消化進(jìn)/出泥中耐藥菌濃度的全年分布

　　由圖 2可知，中溫厭氧消化污泥中β-內(nèi)酰胺類耐藥菌量的年均值均高于四環(huán)素類耐藥菌量. 方差分析結(jié)果表明，厭氧進(jìn)泥的耐藥菌之間存在顯著差異，氨芐西林與頭孢噻吩>頭孢噻肟、 土霉素、 四環(huán)素>金霉素(P<0.05). 已有研究表明，污水生物處理過(guò)程，如傳統(tǒng)活性污泥法、 氧化溝、 生物轉(zhuǎn)盤、 膜生物反應(yīng)器(membrane bioreactor,MBR)等方法可以去除0~5個(gè)數(shù)量級(jí)的耐藥菌[8]，但尚未見(jiàn)到污泥厭氧消化過(guò)程中厭氧耐藥菌變化趨勢(shì)研究的報(bào)道. 本研究中，厭氧消化過(guò)程可以顯著去除1.68 log單位總厭氧菌(P<0.05)，并可顯著去除各種耐藥菌(1.48~1.64 log單位，P<0.05)(圖 2).

　　圖 2 中溫厭氧消化進(jìn)/出泥中耐藥菌濃度的全年平均值

　　2.2 厭氧消化過(guò)程中厭氧菌耐藥率的變化

　　對(duì)耐藥菌在總厭氧菌中的比例進(jìn)行分析，可知各種抗生素耐藥率在污泥厭氧消化過(guò)程中的變化情況. 厭氧進(jìn)泥與出泥中各種抗生素耐藥率的變化見(jiàn)圖 3. 厭氧進(jìn)泥中氨芐西林耐藥率最高，為58.01%，顯著高于排名其次的頭孢噻吩(23.74%)(P<0.05). 而氨芐西林與頭孢噻吩的耐藥率均顯著高于其它4種抗生素(土霉素：4.69%; 四環(huán)素：4.81%; 金霉素：0.56%; 頭孢噻肟：5.66%)(P<0.05). 雖然耐藥菌濃度經(jīng)過(guò)厭氧消化被去除1.48~1.64 log單位，但氨芐西林與頭孢噻吩耐藥比例卻分別從58.01%和23.74%增加到69.99%和38.02%(P<0.05)，其它4種抗生素的耐藥比例則無(wú)顯著變化(P>0.05). 其他學(xué)者在研究污水處理過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了這種處理后耐藥菌濃度降低，而部分耐藥菌的耐藥率升高的現(xiàn)象[16, 17, 18]，但人們對(duì)此現(xiàn)象目前尚未有確切的解釋，只是推測(cè)可能與不同細(xì)菌對(duì)抗生素敏感程度不同，即抗生素對(duì)細(xì)菌具有選擇性，從而不同細(xì)菌在處理過(guò)程中的去除比例也有所不同[16, 17, 18].

　　圖 3 厭氧消化進(jìn)/出泥中耐藥率的變化

　　本研究的厭氧污泥的厭氧耐藥菌中，四環(huán)素類耐藥率相對(duì)較低，為0.56%~5.82%，青霉素類的氨芐西林和Ⅰ代頭孢菌素類的頭孢噻吩耐藥率相對(duì)較高，為23.74%~69.99%，Ⅲ代頭孢菌素類的頭孢噻肟耐藥率為5.66%~7.30%，略高于四環(huán)素類耐藥率. 已有文獻(xiàn)中采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法研究好氧菌在城市污水、 污泥中抗生素耐藥率的結(jié)果如表 1所示. 從中可知，雖然各研究者所采用的培養(yǎng)基、 培養(yǎng)方法、 抗生素濃度各有不同，但城市污水、 污泥中的耐藥菌都具有青霉素類、 Ⅰ代頭孢類抗生素耐藥率較高，四環(huán)素類抗生素耐藥率相對(duì)低的特點(diǎn). 而Kerry等[27]發(fā)現(xiàn)在大量使用獸用抗生素的環(huán)境則有較高的四環(huán)素耐藥率，在魚塘使用土霉素治療的第3 d與24 d，魚塘沉積物中異養(yǎng)菌對(duì)土霉素的耐藥率從9%迅速增長(zhǎng)到26%.

　　表 1 文獻(xiàn)中總可培養(yǎng)異養(yǎng)菌對(duì)各種抗生素的耐藥率

　　目前研究人員對(duì)于污水、 污泥中抗生素殘留量與耐藥菌的關(guān)系尚未有定論[29, 34]. 例如，有研究表明抗生素殘留濃度與耐藥菌的濃度呈正相關(guān)[13, 35]，也有研究認(rèn)為二者之間不顯著相關(guān)[30]. 然而，抗生素的大量使用可以導(dǎo)致耐藥菌濃度或耐藥水平的增加[36, 37]. 由于城市污水廠接納的污水主要來(lái)自人類生活污水，污水與污泥中耐藥菌的分布受到人用抗生素的影響較大. 因此筆者考察了醫(yī)院的抗生素使用量與城市污水廠厭氧污泥中耐藥菌之間的關(guān)系，并將在今后研究中繼續(xù)考察抗生素殘留量與耐藥菌之間的關(guān)系. 我國(guó)醫(yī)院所使用的抗生素以β-內(nèi)酰胺類為主，使用量遠(yuǎn)高于四環(huán)素類抗生素[38, 39, 40, 41, 42]. 根據(jù)鄭利光等[43]對(duì)北京地區(qū)19家醫(yī)院2008年6月~2009年5月的抗菌藥物采購(gòu)數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，北京地區(qū)所使用的人用抗生素中，頭孢菌素類與青霉素類的使用頻率[使用頻率(DDDs)=購(gòu)藥總量/限定日用劑量]所占比例分別為31.05% 和6.37%，排名分別為第1和第4，四環(huán)素類抗生素則僅為0.31%，排名第15. 這可能是城市污水廠厭氧污泥中四環(huán)素類耐藥率較低的重要原因之一. 2.3 耐藥菌與耐藥率的季節(jié)性變化

　　北京具有冬夏持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)而春秋較短的氣候特點(diǎn),在5~9月，日均最高氣溫在26℃以上，日均最低氣溫在14~22℃; 而在10月~次年4月，日均最高氣溫為2~20℃，日均最低氣溫僅為-9~8℃(http://w.zuzuche.com/weather/c235.html). 此外，我國(guó)人用抗生素使用量有冬季大于夏季的特點(diǎn)[44, 45]，而抗生素使用量的增加常會(huì)導(dǎo)致耐藥菌濃度與耐藥水平的增加[27, 36]. 因此，本研究將5~9月和10月~次年4月分別作為溫暖季、 寒冷季，對(duì)耐藥菌在不同季節(jié)的分布情況進(jìn)行分析. 由于卵形消化池內(nèi)保持恒溫，故本研究不考慮厭氧消化溫度對(duì)耐藥菌的影響.

　　如圖 4所示，寒冷季的進(jìn)泥中總厭氧菌量為1.78×1010 CFU ·g-1，顯著高于溫暖季的1.66×109 CFU ·g-1(P<0.05). 進(jìn)泥中寒冷季各種抗生素耐藥菌為2.10×107~8.42×109 CFU ·g-1，溫暖季為1.12×107~1.04×109 CFU ·g-1，除金霉素耐藥菌外，總厭氧菌及其它耐藥菌均為寒冷季顯著高于溫暖季(P<0.05). 對(duì)于厭氧出泥，只有頭孢噻吩耐藥菌在寒冷季顯著高于溫暖季(寒冷季為7.92×107 CFU ·g-1，溫暖季為2.45×107 CFU ·g-1)(P<0.05)，其它耐藥菌則無(wú)顯著差異，說(shuō)明一年中厭氧消化過(guò)程在總體上對(duì)耐藥菌起到了很好的去除效果，出泥耐藥菌濃度較為穩(wěn)定.

　　我國(guó)城市污水廠有寒冷季進(jìn)水COD普遍高于溫暖季的特點(diǎn)，導(dǎo)致厭氧污泥的有機(jī)物濃度寒冷季高于溫暖季. 有機(jī)負(fù)荷的增加會(huì)導(dǎo)致耐藥菌增長(zhǎng)，但對(duì)耐藥率的影響不顯著[46]. 因此，本研究中，有機(jī)負(fù)荷、 抗生素用藥量等因素均有利于耐藥菌在寒冷季的增長(zhǎng)大于溫暖季，都是導(dǎo)致本研究中寒冷季耐藥菌顯著高于溫暖季的重要原因.

　　圖 4 厭氧污泥中耐藥菌在寒冷季與溫暖季的分布

　　如圖 5所示，雖然耐藥菌去除量在寒冷季均高于溫暖季，但獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，除土霉素耐藥菌外(寒冷季去除1.79 log單位，溫暖季去除1.21 log單位)(P<0.05)，總異養(yǎng)菌及其它耐藥菌并無(wú)顯著差異(P>0.05).

　　圖 5 厭氧污泥中耐藥菌在寒冷季與溫暖季的去除

　　獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析結(jié)果表明(表 2)，厭氧進(jìn)泥中各種抗生素的耐藥率在寒冷季與溫暖季無(wú)顯著區(qū)別，但厭氧出泥中金霉素耐藥率溫暖季顯著高于寒冷季(溫暖季1.02%; 寒冷季0.26%)，頭孢噻吩耐藥率寒冷季顯著高于溫暖季外(溫暖季23.81%; 寒冷季48.17%)，其它抗生素耐藥率無(wú)顯著差異(P>0.05). 與此不同的是，Novo等[47]發(fā)現(xiàn)春季與秋季中細(xì)菌對(duì)阿莫西林、 四環(huán)素、 新諾明的耐藥比例有顯著不同. 這些研究結(jié)果表明，環(huán)境微生物的耐藥率受到較多因素影響，仍然需要深入探討.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　表 2 不同季節(jié)厭氧污泥中抗生素耐藥率的變化 [均值(標(biāo)準(zhǔn)偏差)]/%

　　3 結(jié)論

　　(1)厭氧進(jìn)泥中四環(huán)素類耐藥菌在3.57×106~1.77×109 CFU ·g-1之間，β-內(nèi)酰胺類耐藥菌為1.33×107~2.98×1010 CFU ·g-1之間; 中溫厭氧消化可以顯著去除所有的耐藥菌(1.48~1.64 log單位，P<0.05); 但經(jīng)過(guò)中溫厭氧消化，氨芐西林與頭孢噻吩的耐藥率顯著增加，分別增加了12.0%與14.3%(P<0.05)，而其它抗生素的耐藥率無(wú)顯著變化.

　　(2)厭氧進(jìn)泥中耐藥菌濃度之間存在顯著差異，整體上β-內(nèi)酰胺類耐藥菌含量高于四環(huán)素類耐藥菌：氨芐西林與頭孢噻吩>頭孢噻肟、 土霉素、 四環(huán)素>金霉素(P<0.05); 厭氧污泥中四環(huán)素類耐藥率低于β-內(nèi)酰胺類.

　　(3)厭氧進(jìn)泥中耐藥菌分布有明顯季節(jié)特征：除金霉素耐藥菌外，總異養(yǎng)菌及其它耐藥菌均為寒冷季高于溫暖季(P<0.05); 但厭氧進(jìn)泥中抗生素耐藥率在不同季節(jié)無(wú)顯著區(qū)別.(來(lái)源及作者：中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 佟娟、王元月、魏源送)