1 引言
目前，我國(guó)河流普遍受到污染.排放到水體中的污染物可通過(guò)沉積、沉淀等作用在底泥中積累，使得底泥成為一個(gè)微生物種類豐富、物質(zhì)交換頻繁的復(fù)雜環(huán)境.環(huán)境條件的改變亦能直接或間接地改變微生物的群落結(jié)構(gòu);而微生物亦能通過(guò)同化、異化作用對(duì)底泥中的污染物進(jìn)行降解從而改變區(qū)域環(huán)境條件.細(xì)菌和古菌是微生物的重要組成部分，能參與到碳、氮、硫等元素的循環(huán)過(guò)程中，對(duì)促進(jìn)底泥中污染物的分解、減少污染積累、維持良好水質(zhì)具有重大的作用.目前，關(guān)于水環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及其環(huán)境因子耦合關(guān)系的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，但多集中在湖泊與海洋等環(huán)境中，涉及江河的較少，特別是關(guān)于底泥中細(xì)菌與古菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)比的研究更是鮮見(jiàn)報(bào)道.
渾河作為遼河流域最重要的支流之一，是沿岸城市重要的地下水補(bǔ)給水源.以沈陽(yáng)為例，其在渾河的取水量占全市取水總量的3/4;而位于上游撫順市的大伙房水庫(kù)，是遼寧省最大的人造蓄水水庫(kù)，并作為沈陽(yáng)、撫順、盤(pán)錦等城市的重要飲用水源地.由于傳統(tǒng)重工業(yè)的發(fā)展和人口數(shù)量的劇增，大量的工業(yè)廢水和生活污水排放到渾河中，致使渾河流域尤其是下游水質(zhì)遭受污染.目前，關(guān)于渾河的研究集中于氮、磷等污染物，以及重金屬和藻類等.
因此，本文利用PCR-DGGE技術(shù)考察渾河表層底泥中細(xì)菌與古菌的多樣性與群落結(jié)構(gòu)情況，并通過(guò)相關(guān)性分析方法來(lái)研究微生物多樣性與水環(huán)境因子間的關(guān)系，以期更為深入地掌握河流底泥微生物的分布特征，為河流生態(tài)系統(tǒng)的生物法修復(fù)提供科學(xué)依據(jù).
2 材料與方法
2.1 研究區(qū)域與采樣點(diǎn)的設(shè)置
渾河是遼河流域最重要的支流之一，河流全長(zhǎng)約415 km，位于遼寧省東部(122°20′~125°20′E，41°00′~42°20′N)，發(fā)源于長(zhǎng)白山支脈滾馬嶺西側(cè)，流經(jīng)清原、撫順、沈陽(yáng)、遼中、鞍山等市，并在海城市與太子河匯合后經(jīng)大遼河由營(yíng)口注入渤海灣.根據(jù)渾河的自然條件，本研究共設(shè)置了14個(gè)采樣點(diǎn)，其中，干流共設(shè)置9個(gè)采樣點(diǎn)，并分別在社河、章黨河、撫西河、白塔堡河、細(xì)河5條主要支流匯入干流處設(shè)置采樣點(diǎn)，具體分布見(jiàn)圖 1.
圖1 采樣地點(diǎn)示意圖(采樣點(diǎn)：1: 南雜木；2: 社河入渾口；3: 章黨大橋；4: 章黨河入渾口；5: 撫西河入渾口；6: 葛布大橋；7: 高坎大橋；8: 白塔堡河入渾口；9: 黃臘坨；10: 細(xì)河入渾口；11: 于家房；12: 對(duì)坨；13: 三岔河大橋；14: 田莊臺(tái))
2.2 樣品采集與分析
于2013年11月下旬，采集水樣和底泥樣品.水樣采集：用不銹鋼采水器采集水樣，采集深度約在底泥上方2 cm處，水樣保存在500 mL聚乙烯采樣瓶中，放入帶有冰塊的保溫箱，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存于4 ℃冰箱內(nèi);底泥采集：用滅菌的柱狀采泥器采集表層底泥(0~10 cm)，樣品采集后置于無(wú)菌自封袋中，置于干冰上運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱中保存.
使用便攜式水質(zhì)測(cè)定儀(Thermo Orion Star，賽默飛世爾科技有限公司)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定水溫、pH和溶解氧(DO).于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，按照文獻(xiàn)方法測(cè)定以下主要水質(zhì)污染指標(biāo)：五日生化需氧量(BOD5)、總磷(TP)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、亞硝氮(NO2--N)和葉綠素(Chl-a).
2.3 DNA的提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
使用 Power Soil DNA Kit(Mo Bio Laboratories，Carlsbad，CA)對(duì)渾河底泥樣品進(jìn)行總DNA的提取，提取結(jié)果經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).
采用巢式PCR對(duì)底泥樣品中細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為后續(xù)變性梯度凝膠電泳(DGGE)的上樣樣品.對(duì)于細(xì)菌，第一輪引物為27F和1492R，第二輪引物為357F和518R.第一輪反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性1 min，53 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次;最后72 ℃延伸10 min.第二輪反應(yīng)除退火溫度為55 ℃外，其它條件同第一輪反應(yīng).對(duì)于古菌，第一輪引物為PRA46F和PREA1100R，第二輪引物為PARCH 340F和PARCH 519R.第一輪反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性l min，65~55 ℃退火50 s，每個(gè)循環(huán)溫度降低0.5 ℃，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)20次，然后在55 ℃的退火溫度下繼續(xù)擴(kuò)增，循環(huán)15次;最后72 ℃延伸7 min.第二輪反應(yīng)除退火溫度先為63~53 ℃循環(huán)20次、后為53 ℃循環(huán)15次外，其它條件同第一輪反應(yīng).
以上擴(kuò)增體系均為50 μL，包括：2×PCR GoTaqGreen Master Mix(Promega，USA)25 μL，上下引物各1 μL(10μmol · L-1)，DNA模版2μL(1~10 ng)，最后用ddH2O補(bǔ)足至50 μL.為保證基因片段的穩(wěn)定遷移、提高DGGE的分辨效率，分別在上游引物357F和PARCH 340F的5′ 端添加一個(gè)長(zhǎng)度為40 bp的GC夾.
2.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)
使用美國(guó)Bio-Rad公司的D-Code電泳系統(tǒng)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳.DGGE上樣樣品分別為細(xì)菌和古菌第二輪帶GC夾引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，每條泳道的上樣量均為25 μL.聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(丙烯酰胺 ∶ 甲叉丙烯酰胺=37.5 ∶ 1)，細(xì)菌與古菌變性劑濃度梯度范圍分別為40%~60%和20%~50%.在1×TAE緩沖液中，恒定溫度60 ℃、恒定電壓70 V的條件下，電泳15 h.用SYBR gold(Invirogen，USA)核酸染料染色30 min后，拍照分析.
各采樣點(diǎn)細(xì)菌和古菌的香濃-威爾多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener Index，H′)、種群豐度(Richness，R)及均勻度(Evenness Index，E)均通過(guò)Quantity One(Bio-Rad，USA)軟件來(lái)計(jì)算電泳條帶的遷移率灰度條帶數(shù)量得到，具體為：
式中，pi指一種特定菌群相對(duì)總菌群的比率，pi=ni/N，ni為第i條條帶的強(qiáng)度，N為所有條帶強(qiáng)度之和，S為每條泳道DGGE條帶的數(shù)目.
采用非加權(quán)成對(duì)算數(shù)平均法UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean)對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，研究各采樣點(diǎn)間的相似性.
2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
將DGGE圖譜條帶的位置和亮度分別類比于物種的種類和數(shù)量，利用Canoco for windows 4.5軟件分別對(duì)細(xì)菌和古菌的DGGE圖譜條帶的數(shù)字化結(jié)果進(jìn)行DCA分析，得到樣品矩陣第一軸的最大梯度長(zhǎng)度均小于3，因此，選用冗余梯度分析方法(RDA)來(lái)分別計(jì)算環(huán)境因子與細(xì)菌、古菌群落組成變化的相關(guān)性.
3 結(jié)果與討論
3.1 水樣的理化指標(biāo)
各采樣點(diǎn)水質(zhì)的理化指標(biāo)見(jiàn)表 1.由表 1可知，渾河上覆水水質(zhì)均呈弱堿性.各采樣點(diǎn)水中溶解氧(DO)濃度變化范圍不大，除沈陽(yáng)段的兩大支流白塔堡河與細(xì)河在渾河的匯入口外，其余采樣點(diǎn)濃度均大于10 mg · L-1.葉綠素(Chl-a)濃度變化趨勢(shì)較為明顯，從上游到下游濃度明顯增大，特別是在沈陽(yáng)市下游地區(qū)，各個(gè)采樣點(diǎn)的葉綠素(Chl-a)的濃度值均大于80 mg · L-1，最大值達(dá)180.93 mg · L-1.分析其原因可能是因?yàn)橄掠蔚貐^(qū)多為農(nóng)村地帶，來(lái)自農(nóng)村生活污水和農(nóng)業(yè)面源的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物增多，導(dǎo)致藻類大量繁殖.
表1 水質(zhì)理化指標(biāo)
3.2 細(xì)菌與古菌的DGGE圖譜分析
3.2.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析
渾河底泥樣品中細(xì)菌DGGE的指紋圖譜如圖 2所示.可以看出，上游底泥樣品中條帶數(shù)量要明顯小于下游樣品，說(shuō)明上游底泥中細(xì)菌種類與下游相比較少;且上游樣品中條帶亮度較為平均，說(shuō)明其優(yōu)勢(shì)菌種并不明顯，而中、下游樣品中的部分條帶，如條帶3、4、6、7、8、9和10的亮度相對(duì)于其它條帶明顯較大，說(shuō)明這些條帶所代表的細(xì)菌在下游采樣點(diǎn)中相對(duì)于其它菌種數(shù)量較多.
圖2 細(xì)菌的DGGE分析圖譜
聚類分析結(jié)果如圖 3所示，可知14個(gè)底泥樣品中細(xì)菌群落大致可分為4個(gè)大簇.其中，章黨大橋(3#)與其它樣品的差異較為明顯，這可能與其周邊的啤酒廠有關(guān).由于啤酒廢水成分與其它排放到渾河的污水成分差異較大，久而久之，排放到該采樣點(diǎn)水體中的污染物質(zhì)不斷沉積到底泥中，導(dǎo)致底泥中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化;其它底泥樣品的細(xì)菌群落在系統(tǒng)樹(shù)上明顯分成3個(gè)大簇，結(jié)合實(shí)際的地理位置分析，可分為3段：①鄉(xiāng)村段：上游采樣點(diǎn)南雜木(1#)與社河(2#)為一大簇，兩者皆在大伙房水庫(kù)上游，其間人口密度小，沒(méi)有大型工廠等污染源，水中污染物濃度相對(duì)下游河段較低;②城市段：中游采樣點(diǎn)章黨河(4#)至高坎大橋(7#)為一大簇，其采樣點(diǎn)分布在渾河的撫順市至沈陽(yáng)市段部分，受城市生活污水和工業(yè)廢水影響較大;③城鎮(zhèn)段：下游采樣點(diǎn)白塔堡河(8#)至田莊臺(tái)(14#)為一大簇，其間沒(méi)有大城市，流經(jīng)的地點(diǎn)多為小城鎮(zhèn)或鄉(xiāng)村，污染物主要源自于農(nóng)村生活污水和農(nóng)業(yè)面源.各個(gè)大簇內(nèi)又可細(xì)分為更小的相似性族群，而空間上相鄰的兩采樣點(diǎn)底泥的總細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性一般較高.
圖3 細(xì)菌DGGE圖譜聚類(UPGMA)分析
分析上述現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是因?yàn)樘幱诔鞘械貐^(qū)的河段，由于城市生產(chǎn)、生活廢水的大量排放，超過(guò)了其自凈能力，致使污染物沉積到底泥中，改變了原有系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)物循環(huán).而環(huán)境條件的改變又導(dǎo)致底泥中一些土著細(xì)菌因不能適應(yīng)環(huán)境的改變而遭到淘汰，而另一些能夠適應(yīng)新環(huán)境的細(xì)菌大量繁殖，破壞了底泥中原有的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)平衡;相反，鄉(xiāng)村地區(qū)河流由于受人為因素的干擾較小，底泥細(xì)菌群落也明顯不同于城市河流段.
總體上，渾河底泥樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了較為明顯的分區(qū)特征，這與關(guān)于松花江底泥中細(xì)菌群落分布的研究結(jié)果明顯不同.研究發(fā)現(xiàn)，松花江底泥中的細(xì)菌群落分布不存在明顯的地域分區(qū)現(xiàn)象，部分不相鄰的采樣點(diǎn)反而具有較高的群落相似度.他認(rèn)為之所以發(fā)生上述現(xiàn)象可能是由于松花江相鄰兩采樣點(diǎn)之間并沒(méi)有嚴(yán)格的分界線，細(xì)菌可以四處遷徙，因此，分區(qū)現(xiàn)象不明顯.而渾河上、中、下游3段的采樣點(diǎn)間水質(zhì)逐漸變化，各段內(nèi)水質(zhì)情況較為類似，導(dǎo)致其底泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)亦呈現(xiàn)逐漸演替的趨勢(shì)，因此，分區(qū)現(xiàn)象明顯.
底泥樣品細(xì)菌的多樣性指數(shù)、種群豐度及均勻度見(jiàn)表 2.從渾河上游至下游，細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)和種群豐度總體均呈現(xiàn)先逐漸上升再逐漸下降的趨勢(shì)，且分別在白塔堡河處達(dá)到最大值3.88和4.54.說(shuō)明從上游至下游，渾河底泥中細(xì)菌群落多樣性先增加再降低，群落中優(yōu)勢(shì)微生物所占比重加大.
表2 底泥樣品細(xì)菌與古菌的多樣性指數(shù)、種群豐度及均勻度
3.2.2 古菌群落結(jié)構(gòu)分析
渾河底泥樣品中古菌的DGGE指紋圖譜如圖 4所示，可看出上游和下游底泥樣品中古菌的條帶數(shù)量要小于中游底泥樣品的條帶數(shù)，說(shuō)明上游和下游底泥中古菌種類較中游少.總體來(lái)說(shuō)，14個(gè)采樣點(diǎn)中較亮的條帶并不多，只有位于下游的采樣點(diǎn)對(duì)坨(12#)存在6條相對(duì)較亮的條帶，說(shuō)明渾河底泥中古菌并不像細(xì)菌那樣存在某些數(shù)量相對(duì)其它菌種較多的菌種，而是各菌種數(shù)量相差不大.
圖4 古菌的DGGE分析圖譜
聚類分析結(jié)果如圖 5所示，可知14個(gè)底泥樣品中古菌群落大致可分為2個(gè)大簇：位于下游的采樣點(diǎn)黃臘坨(9#)、細(xì)河(10#)和對(duì)坨(12#)為一大簇，其余采樣點(diǎn)為另一大簇.可見(jiàn)，渾河底泥中古菌的群落結(jié)構(gòu)分布與細(xì)菌大不相同，并不具有明顯的地域分區(qū)特征，如位于上游的采樣點(diǎn)南雜木(1#)和位于下游的采樣點(diǎn)于家房(11#)在空間上并不相鄰，但二者卻具有較高的相似度.
圖5 古菌DGGE圖譜聚類(UPGMA)分析
渾河底泥樣品中古菌的多樣性指數(shù)、種群豐度及均勻度見(jiàn)表 2.與細(xì)菌相同，古菌的多樣性指數(shù)和種群豐度總體也呈現(xiàn)出先逐漸上升再逐漸下降的趨勢(shì)，且分別在白塔堡河處達(dá)到其最大值2.91和2.05.說(shuō)明從上游至下游底泥中古菌群落結(jié)構(gòu)的變化情況與細(xì)菌一致，也是由簡(jiǎn)單變?yōu)閺?fù)雜再變?yōu)楹?jiǎn)單.
3.4 細(xì)菌和古菌的種群結(jié)構(gòu)與水環(huán)境因子的相關(guān)性
運(yùn)用冗余梯度分析(RDA)，將細(xì)菌DGGE圖譜的數(shù)字化結(jié)果和水樣理化指標(biāo)結(jié)合在一起分析，結(jié)果概括于表 3，排序結(jié)果如圖 6a所示.可知，第一軸(λ=0.171)和第二軸(λ=0.131)揭示了50.9%的信息量，而4個(gè)軸總共揭示了78.2%的屬種數(shù)據(jù)變化.第一軸與硝氮(NO3--N)和亞硝氮(NO2--N)的相關(guān)系數(shù)較高，分別為-0.6751和-0.7645，而第二軸與pH和葉綠素(Chl-a)的相關(guān)系數(shù)較高，分別為0.7494和0.6550.說(shuō)明底泥中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要與水中的NO3--N、NO2--N、pH和Chl-a相關(guān).
表3 環(huán)境因子與細(xì)菌群落和古菌群落的RDA結(jié)果
圖 6為基于古菌DGGE圖譜的樣品與理化因子的 RDA排序圖，結(jié)合表 3可知，圖中前4個(gè)軸揭示了74.5%的信息量，其中，第一軸(λ=0.207)和第二軸(λ=0.112)揭示了49.5%的信息量;在古菌種類與環(huán)境因子之間的相關(guān)系數(shù)中，軸1(r=0.985)和軸2(r=0.976)的相關(guān)性都很高.第一軸與氨氮(NH4+-N)和葉綠素(Chl-a)的相關(guān)系數(shù)較高，分別為0.5788和0.4893，而第二軸與總磷(TP)和硝氮(NO3--N)的相關(guān)系數(shù)較高，分別為-0.3702和-0.3321.說(shuō)明底泥中古菌群落結(jié)構(gòu)主要與水中的NH4+-N、Chl-a、TP和NO3--N相關(guān).
圖6 基于細(xì)菌(a)和古菌(b)DGGE圖譜的樣品與環(huán)境因子的 RDA排序圖
4 結(jié)論
1)從上游至下游，渾河底泥中細(xì)菌與古菌的群落結(jié)構(gòu)均由簡(jiǎn)單變?yōu)閺?fù)雜，其Shannon多樣性指數(shù)總體均呈現(xiàn)先逐漸增大再逐漸減小的趨勢(shì)，變化范圍分別為3.00~3.88和2.10~2.91.
2)渾河底泥中具有豐富多樣的細(xì)菌種類，而古菌種類則相對(duì)較少，所有采樣點(diǎn)底泥中細(xì)菌的Shannon多樣指數(shù)和種群豐度R均大于同一地點(diǎn)底泥中古菌的Shannon多樣指數(shù)和種群豐度R，說(shuō)明細(xì)菌是渾河表層底泥中的主要存在的微生物.
3)渾河底泥樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了較為明顯的地域分區(qū)特征，鄉(xiāng)村段、城市段和城鎮(zhèn)段河流的相鄰采樣點(diǎn)間的群落結(jié)構(gòu)較為相似，而古菌群落結(jié)構(gòu)則不具有明顯的地域分區(qū)特征.
4)渾河底泥中細(xì)菌群落與上覆水中NO3--N、NO2--N、pH和Chl-a有明顯相關(guān)性，而古菌群落則與NH4+-N、Chl-a、TP和NO3--N有明顯相關(guān)性.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.northcarolinalenders.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
5 建議
RDA分析結(jié)果表明，NO3--N、NO2--N、NH4+-N、TP、Chl-a和pH是影響渾河底泥中細(xì)菌與古菌群落的主要因素，其中，Chl-a含量較高亦是因N、P物質(zhì)較多而引起水體富營(yíng)養(yǎng)化的結(jié)果.因此，控制和減少水中N、P等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量是渾河修復(fù)治理過(guò)程中的重要問(wèn)題之一.可通過(guò)人工投加微生物的方法來(lái)減少水中N、P等污染物的含量.如采用固定化氮循環(huán)細(xì)菌技術(shù)，即從渾河底泥中提取天然無(wú)害的氮循環(huán)細(xì)菌，進(jìn)行馴化，然后為之提供生存載體.同時(shí)，應(yīng)加大污染控制力度，提高污水處理能力，各部門(mén)積極配合，全面綜合治理渾河水質(zhì)，才能使之得以全面改善.
